Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

חוץ-גופית של הכרומוזומים Spermatocytes חרקים

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57359
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3
1Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University, 2Department of Electrical and Computer Engineering, Bucknell University, 3Biology Department, Bucknell University

Summary

ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הבחירה ואת הכנת תאים המתאימים עבור המיקרומניפולציה ושימוש micromanipulator פיזואלקטריים כדי למקם מחדש כרומוזומים בתוך התאים האלה.

Abstract

חוץ-גופית של כרומוזומים היה שיטה חיונית עבור מאירה את המנגנון על כרומוזום congression, פלך מחסום ו "אנאפאזה" כרומוזום תנועות, ואני כבר מפתח להבנת מה ששולט כרומוזום תנועות במהלך חלוקת התא. ביולוג מיומן ניתן להשתמש micromanipulator כדי לנתק את הכרומוזומים מ בכישור, מיקום מחדש של הכרומוזומים שבתא, וכדי להחיל כוחות על כרומוזומים באמצעות מחט זכוכית קטנים עם טיפ מצוין. בעוד לפליטת יכולים להתבצע כרומוזומים באמצעות שיטות אחרות כגון השמנה אופטי ושימושים אחרים של לייזר, נכון להיום, אין שיטה אחרת מאפשר את מיקום מחדש של רכיבי הסלולר בהיקף של עשרות למאות מיקרון עד אין נזק לתא .

את הבחירה ואת הכנה של תאים המתאימים חוץ-גופית של כרומוזומים, במיוחד המתארת את הכנת חגב קריקט spermatocyte הראשית תרבויות לשימוש הדמיה לחיות תאים, חוץ-גופית המתוארים כאן. בנוסף, אנו מראים הבנייה של מחט כדי לשמש להעברת כרומוזומים בתוך התא, השימוש micromanipulator פיזואלקטריים שבשליטת ג'ויסטיק עם מחט זכוכית מצורף, מיקום מחדש של הכרומוזומים בתאים החלוקה. תוצאה הדגימה מראה את השימוש micromanipulator לנתק כרומוזום מ זה פלך ב spermatocyte העיקרי וכדי למקם מחדש הכרומוזום בתוך התא.

Introduction

המיקרומניפולציה חשף חלקי המנגנון של כרומוזום congression, פלך מחסום ו "אנאפאזה" כרומוזום תנועות. הפרסום המוקדם ביותר המתאר את תוצאות המיקרומניפולציה ניסויים היה על ידי רוברט צ'יימברס1. צ'יימברס להשתמש micromanipulator מכני עם מחט זכוכית המצורף כדי לחקור את הציטופלסמה של מספר סוגי תאים שונים. למרבה הצער, שיטות ניגוד שמותר הפריט החזותי של כרומוזומים ורכיבים רבים אחרים התאית בתאים חיים לא היו זמינים בזמן, אז הניסויים של צ'יימברס לא יכולתי להראות את ההשפעות של שינוי מיקום כזה מרכיבי התא. Micromanipulations מוקדם ששינו את המיקום כרומוזום משמש את המנגנון צ'יימברס לטאטא את midzone פלך בתאים "אנאפאזה", מראה כי מניפולציות כאלה יכול לשנות את המיקום של הזרועות כרומוזום ב "אנאפאזה" חרגול neuroblasts2 . Nicklas ושותפיו שלו היו הראשונים לבצע בסדר micromanipulations של כרומוזומים, מתיחה של כרומוזומים3, ניתוק אותם מן בכישור וגרימת ולהתפכחות3,4, ייצוב malorientation על-ידי החלת מתח הכרומוזומים5,6,7ולאחר מדידה. לכוחות המיוצר על ידי הצירים "אנאפאזה"8,9. עבודה אחרת על ידי המעבדה Nicklas הראה כי בגרגרים cytoplasmic יכול גם להיות מרומה10 כי centrosomes יכול למקם על ידי המיקרומניפולציה11. המיקרומניפולציה שימושי לא רק להעברת כרומוזומים ורכיבים אחרים התאית. מחט המיקרומניפולציה נקיה יכול לחתוך דרך זה mitotic פלך בתאים demembranated12 או יכול לשמש כדי להעלים את מעטפת הגרעין13. בנוסף, תאים סמוכים יכולים נכרכים על ידי המיקרומניפולציה14,15.

עם מגוון רחב של ניסויים מעניינים שאפשר לעשות שימוש חוץ-גופית, זה במבט ראשון מפתיע כי המיקרומניפולציה ניסויים נעשו על ידי ביולוגים כרומוזום מעט מאוד. סיבה אחת על מחסור זה הוא התאים בתרבית חלוקת mitotically נגזרות רקמות חוליות, משמשים בדרך כלל לימוד תנועות כרומוזום הן קשה מאוד micromanipulate. תאים אלה תרביות רקמה בדרך כלל יש שלד התא קורטיקלית כי "מפריע" של המיקרומניפולציה המחט, ואת כרומוזומים או לא נגיש באמצעות המחט או המחט חורק דרך התא, המוביל אל המוות ולמסמנים התא. אנחנו, ניסויים אחרים המשתמשים המיקרומניפולציה, מצאו תאים arthropod להיות מקובל המיקרומניפולציה. Arthropod spermatocytes מתפשטים בקלות תחת שכבה של שמן halocarbon, נראה כי שלד התא קורטיקלית הרבה פחות חזקים שבבסיס קרום התא במהלך חלוקת התא. לפיכך, האשכים arthropod לספק מקור טוב של meiotically, חלוקת תאים (spermatocytes), mitotically, חלוקת תאים (spermatogonia) עם כרומוזומים נגיש עבור המיקרומניפולציה. טורי חלוקתה של spermatocyte חגב קבוע במהלך מניפולציה חשף כי המחט לא חודר את קרום התא; קרום התא מתעוות סביב המחט (R.B. Nicklas, תקשורת אישית). Spermatocytes ממספר taxa חרק, עכביש היה micromanipulated בהצלחה, כולל חגבים, גמלי שלמה התפילה, זבובי פירות, קריין, צרצרים, spittlebugs, עש, אלמנה שחורה עכבישים, עכבישים מרתף, אריגה orb העכבישים והזבובים 3,7,17,18,19,20,21,22. התאים בתרבית, חלוקת mitotically מפני חרקים יכולים להיות micromanipulated. לדוגמה, הכרומוזומים. חגב neuroblasts בתרבות הראשי יש כרומוזום שניתן בקלות micromanipulated2,23. אנו חושדים כי קווי נגזר דרוזופילה תרבותי זמינים, חרקים אחרים יהיה גם micromanipulatable, למרות שלא בדקנו את הטכניקה עם תאים אלה. אנחנו נראה איך חלוקת תאים חגבים, צרצרים יכול להיות מוכנים חוץ-גופית. צרצרים בקרבת להשיג ברוב החנויות לחיות מחמד בכל עת של השנה. חגבים הן פתוח בעונת הקיץ בלבד אלא אם החוקר חייב גישה מושבה מעבדה, אבל המין בשימוש (Melanoplus sanguinipes) יש משוטחים בקלות תאים ולאחר זמן, קל לתפעל כרומוזומים.

סיבה נוספת למה המיקרומניפולציה ניסויים נעשו על ידי קומץ קטן של ביולוגים היא כי micromanipulators להזיז כרומוזומים טוב זמינים רק לעתים נדירות בשוק. מצאנו כי micromanipulator פיזואלקטריים שבשליטת ג'ויסטיק שולטת התנועה מחט ללא רטט, הסחף או השהיה בין התנועה ג'ויסטיק התנועה מחט, אך סוגים אחרים של סימולטורי יכול לדחוף גם בהצלחה כרומוזומים סביב בתא. Micromanipulators שעוצב על ידי25,אליס, ייסד26 הינם אידיאליים עבור חוץ-גופית של כרומוזומים, אף הם להשתמש בטכנולוגיה בוגרים. Micromanipulators פיזואלקטריים הם זמין כעת, בדרך כלל בשימוש אלקטרופיזיולוגיה; עם זאת, micromanipulators האלה אינם בדרך כלל מבוקר ג'ויסטיק. ג'ויסטיק הבקרה היא המפתח חלקה התנועות הדרושות המיקרומניפולציה מוצלחת, אז יש אפשרות לבנות ג'ויסטיק מותאם אישית כדי להפוך את micromanipulators פיזואלקטריים זמין כרגע עובד חוץ-גופית הכרומוזום. שבשליטת ג'ויסטיק פיזואלקטריים micromanipulators עובד בצורה הטובה ביותר יש שליטה עמדה ישירה, שבה תנועת מוט ההיגוי מתורגם ישירות תנועה מחט.

ניתן לבנות micromanipulator פיזואלקטריים החדש תוכנן מן החלקים הזמינים בשוק כי ניתן להחליף בקלות ומן כמה רכיבים קטנים המודפס תלת-ממדי, וזה עובד היטב עבור המיקרומניפולציה כרומוזום24. Micromanipulator יש רגישות מתכווננת, מיקום גס ידנית, ו אין רטט, הסחף או השהיה המחט התנועה, ואת תפקיד ישיר הבקרה של המחט. מדענים יכולים לבנות את micromanipulator באמצעות הוראות באינטרנט זמין24. להלן השיטות להכנת תרבות תא spermatocyte הראשי ועבור micromanipulating הכרומוזומים בתוך התאים בתרבות הזו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנה של תרבית תאים ראשיות חרקים Spermatocyte חוץ-גופית

  1. הכנת שקופית
    1. להשיג שקופית 75 מ"מ x 25 מ"מ זכוכית עם חור עגול של קוטר 20 מ מ לגזור במרכז השקופית.
      הערה: הם נקטפו מתוך גיליון אחד של חלון זכוכית לגודל של שקופית מזכוכית עם חור במרכז.
    2. לעבור coverslip 25 מ"מ x 25 מ"מ #1.5 של להבה מבער בונזן 2 s.
    3. למרוח משחה ואקום סביב קצה החור בשקופית זכוכית
    4. מניחים את coverslip על החור כמו באיור 1. תלחץ על זה וודא כי ליצור חותם צר.
    5. הפוך את השקופית זכוכית ולמלא את הקרע עם שמן halocarbon.
  2. Spermatocyte תרבות הכנה לצפייה במיקרוסקופ
    הערה: כאן, אנו מתארים את שיטת הכנה תרבות באמצעות תאים חגב או קריקט. יכול להיות תרבותי האשכים התוכן של פרוקי רגליים אחרים באמצעות שיטה דומה.
    1. להשיג צרצרים זכר subadult (או חגבים). מקום חרק חי במקרר למשך כ- 2 דקות קר-עזים ומתנגד זה. באמצעות מספריים ויבתר, במהירות לחתוך דרך המשטח הגבי מקביל לציר הארוך של הבטן מאחורי ניצנים כנף. באופן ידני מחצי הבטן בעדינות כדי לדחוף את האשכים דרך החתך של שלד חיצוני (איור 2).
    2. באמצעות מלקחיים, מקם את האשכים מבודד. הקרע טוב המכיל שמן halocarbon.
    3. אם יש צורך, להציג את האשכים מתחת למיקרוסקופ ויבתר. לחלק אותם לחתיכות קטנות יותר באמצעות מלקחיים הארכית פיין, הסרת כל השומן המכסה את האשכים, ולהשתמש מלקחיים הארכית בסדר כדי לשבור את האשכים (איור 3A ו- 3B). להפיץ את התוכן האשכים תחת השמן, על-פני coverslip (איור 3C).
    4. להפיץ את התוכן האשכים עד החלק התפשטות של בזרמה בקושי מורגש בעיני (איור 3C). השתמש בארות דיסוציאציה שנטענו שמן נוספים במידת הצורך.

2. חוץ-גופית

  1. ייצור microneedle
    1. מקם קצה אחד של שפופרת זכוכית (0.85 מ מ בקוטר חיצוני 0.65 מ"מ בקוטר פנימי) להבת מבער בונזן. למשוך את קצה לאורך צינור זכוכית באופן כזה כי זווית 150° נוצר, נוצר שטח מורחבת של צינורות זכוכית צר. לשבור את הצנרור באזור דק כך באזור דק הזווית היא כ 10 מ"מ (איור 4A).
    2. באמצעות microforge של (או בהזמנה אישית על פי פאול27 או זמינים מסחרית-ראה טבלה של חומרים), לגעת בקצה של המחט זכוכית לכבל פלטינה חם כדי להמיס את הכוס בקצה. טופס כ 45° זווית בין המחט החוט פלטינה של microforge (איור 4B). משוך את הזכוכית מהכבל חם, תוך כדי לכבות את החום על חוט התיל, ויוצרים טיפ דק של ≤1.5 מ מ בקצה המחט זכוכית.
      הערה: הקוטר עצה יהיה קשה למדוד, אבל טיפ זה באורך סביר לייצר מחט תקיף אך גמיש זה יהיה מתאים המיקרומניפולציה. לחלופין, ניתן להשתמש של פולר micropipette כדי ליצור זכוכית צינורות בקוטר עצה המתאימה (הנסיין יהיה לבחון מתכונים מושך שונים כדי לייצר microneedle כראוי תקיף אך גמיש לעבודה). המחט יכול להציב אותם בעל זה מעוצב באופן דומה כדי שהמחט מניפולציה שנוצרו על פי השיטה המתוארת לעיל.
  2. מיצוב של micromanipulator
    1. במקום השקופית מוכן על השלב של מיקרוסקופ ניגוד שלב הפוכה. למצוא את התאים החלוקה ובמרכז להם שדה הראיה. מתמקדים התאים בעזרת ההגדלה הנמוך ביותר האפשרי.
      הערה: השתמשנו מטרה ניגודיות שלב 16 X.
    2. מקם את microneedle למחזיק המחט על micromanipulator.
    3. מקם באופן ידני את microneedle בנתיב האור של המיקרוסקופ, כך קצה המחט הוא מואר על ידי האור (איור 5B).
    4. פוקוס המיקרוסקופ בכמה מישורים מוקד מעל המטוס שבו התאים לשקר.
    5. למקם מחדש את microneedle באמצעות הבקר ג'ויסטיק-רגישות נמוכה מספר פעמים כדי למצוא את הצל של המחט ב X - ו Y-axes. להמשיך לעדכן את המיקום עד המיקום של הקצה יהיה גלוי. להתאים את מיקום המחט לאורך ציר z עד קצה המחט יהיה בפוקוס.
    6. להתמקד. על התאים, ואז להתמקד המיקרוסקופ מעל המטוס תא כך התאים הם רק מחוץ לפוקוס, בלתי נראה. להתאים מחדש את המיקום של המחט כך את קצהו הוא בפוקוס במישור המוקד הזה.
    7. התאם את רמת ההגדלה של המיקרוסקופ כנדרש.
      הערה: השתמשנו מטרה ניגודיות שלב מפתח נומרי (NA) 100 X 1.4 עבור המיקרומניפולציה.
    8. לאחר התמקדות התאים באמצעות המטרה גבוה ההגדלה, שוב להתמקד המיקרוסקופ מעל המטוס תא כך התאים הם רק מחוץ לפוקוס, בלתי נראה. באמצעות הגדרת רגישות גבוהה יותר, להתאים מחדש את המיקום של המחט כך את קצהו נמצא בפוקוס וממורכז ב מישור מוקד מעל המטוס שבו התאים לשקר.
    9. להתמקד. על תאי, התאמת המיקום שלהם, כך שהן נותרות במרכז שדה הראייה. המחט מוכן כעת המיקרומניפולציה.
  3. חוץ-גופית של כרומוזומים
    1. שימוש באותה הגדרה רגישות לגבי מיקום בסדר בהגדלה, להשתמש מוט ההיגוי כדי לשלוט על microneedle ולדחוף את הכרומוזומים בתוך התא. שמור על קצה המחט מעל המטוס של התאים.
    2. כדי למשוך או להעביר כרומוזום, מתמקדים כרומוזום בסמוך לחלקו העליון של התא.
      הערה: כרומוזומים אלה קלים יותר לתמרן-מניפולציה כרומוזומים קרוב ש-coverslip עושה את זה סביר כי יטחנו את המחט לתוך coverslip, מתפרצת לתא וכלה הניסוי.
    3. התאם ציר z על מוט ההיגוי להביא את מחט אל המוקד, אז לעבור המחט עצה עם הג'ויסטיק ב- X וי' המקום קצה המחט ישירות על כרומוזום ה-כדי להשפיע ולדחוף אותו בכיוון הרצוי כדי לאפשר manipulator כדי repositi בכרומוזום.
    4. תלוי כמה רחוק הוא דחף את הכרומוזום, או להחיל את המתח על הכרומוזום או להחיל מתח מספיק כדי לנתק כרומוזום מ בכישור. ברגע כרומוזום יוסר מה זה פלך, למקם אותו בכל מקום בתוך התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 6 מראה של המיקרומניפולציה מדגם של 2 חגב סמוכים spermatocytes ראשי מספר דוגמאות של השימושים האפשריים של חוץ-גופית. ניסוי זה נעשה שימוש במיקרוסקופ ניגוד שלב הפוכה,. 0:00 (ערב לזמנים הנקובים הם ב- min:s) תמונת מראה שני התאים לפני המניפולציה. כרומוזום אחד בתא התחתון מוצג תחת מתח שהוחלו על-ידי המחט המיקרומניפולציה (0:05; שחור חץ) ולאחר מכן מנותקים לחלוטין בכישור (0:10; שחור חץ). כרומוזום אחד בתא התחתון (6:25; חץ צהוב) דחף לכיוון ציר 1 מוט של תא זה (ב- 7:05; חץ צהוב) ועבר לאחר מכן מחוץ לאזור ציר ראשי (7:10; באזור הצהוב). שני כרומוזומים מניפולציה (חיצים צהוב ושחור) בניסוי זה נשמרים מן חיבור מחדש כדי בכישור מאת להיות עזר לסגור ללא הרף עם מחט המיקרומניפולציה כדי למנוע היווצרות של קבצים מצורפים ציר חדש. הצל שהטילה את המחט המיקרומניפולציה מוצגת בכמה תמונות, אבל קצה המחט הוא גלוי רק לעתים רחוקות. תמונות אלה מראים שזה אפשרי למקם מחדש, להחיל מתח כדי לנתק כרומוזום מ בכישור באמצעות המיקרומניפולציה. יכול להיות מנותקים כרומוזומים זה פלך ב prometaphase שלהם, מפה של, "אנאפאזה", למרות כרומוזומים "אנאפאזה" קשים מאוד להתנתק.

Figure 1
איור 1 : זכוכית שקופית עם coverslip מחובר. 25 מ מ x 25 מ מ, שטופלו להבה coverslip מצורפת לשקופית זכוכית 75 מ"מ x 25 מ"מ עם 20 מ מ קוטר חור עגול חתך במרכז ואטום עם גריז ואקום. שים לב להיעדר בועות גלוי או פערים המשחה ואקום תחת coverslip. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : הסרת האשכים קריקט, חגב. האשכים (חץ) ניתן להסיר צרצר זכר (Acheta. חתול-טופ) או חגב (Melanoplus sanguinipes-התחתון) לאחר חתך על הבטן של החרק, מאחורי כנף ניצנים (חץ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הכנת תא להתפשט. (א) עיקר האשכים צרצר מוצג על ידי החץ. קטע האשכים המשמש עבור שקופית בודדת מוצג על ידי החץ. סרגל קנה מידה = 1 מ מ. (B) חגב האשכים מורכבים ממספר בקוריאנית. בדרך כלל, השתמשנו בקוריאנית 4 של חגב זכר לנוער עבור כל שקופית, כפי שמוצג בתמונה זו. סרגל קנה מידה = 1 מ מ. (ג) עבור מינים, האשכים שהם מנותקים באמצעות מלקחיים, או התוכן של המקטעים testis פרוסים בשמן halocarbon. התכנים האשכים כפולה תחת שמן מוצגים. סרגל קנה מידה = 10 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : . מחט המיקרומניפולציה נוצר כימיקלים-סלוונטים (א) הצורה הכללית של המחט הוא קטע ארוך, שלא שונתה של זכוכית צינורות (≥ 10 ס מ), עם עיקול של 150 מעלות כ- 10 מ מ מקצה (שנוסדה על ידי מתיחה וכיפוף לאורך צינור זכוכית ב להבה מבער בונזן). (B) בחלונית ' ' מראה את המחט להציב את microforge. הטפסים המחט (חץ) כ 60 מעלות עם נימה פלטינה תיל (חץ) לפני חימום. (ג) קצה המחט (חץ) נוצר אחרי הצינור זכוכית כיפוף הוא נגע על חוט הלהט חם תיל פלטינה (חץ) ב- microforge, התרחקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : מיקום המחט בנתיב האור מיקרוסקופ. (א) בלוח זה הופעות תצוגה של micromanipulator. (B) לוח זה מראה להציג מקרוב המחט המיקרומניפולציה להציב בעל מחט micromanipulator, אשר היא חתיכה של תלת-ממד מודפס פלסטיק. (ג) A מחט ממוקם בנתיב האור במיקרוסקופ ניגוד שלב הפוכה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : חוץ-גופית של הכרומוזומים. שני חגב סמוכים spermatocytes ראשי- הזמנים מוצגים min:s. של 0:00 תמונת מראה שני התאים לפני המיקרומניפולציה. המתח מוחל על כרומוזום ה-(המוצג על ידי החץ השחור) באמצעות המחט המיקרומניפולציה לכיוון הקוטב פלך העליונה של תא זה (0:05). הכרומוזום מנותקת בכישור, דחף לכיוון הקוטב ציר תחתון (0:10), ועבר בסופו של דבר מחוץ לאזור ציר ראשי (6:25, 7:05, 7:10). כרומוזום בתא הסמוך (6:25, חץ צהוב) דחף לכיוון הקוטב העליון פלך בתא (ב- 7:05, חץ צהוב) ועבר לאחר מכן מחוץ המסה צירים עיקריים (7:10, חץ צהוב). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עם התרגול, זז הכרומוזומים בתא יכול להפוך לטבע שני. כי הן מספיק נוקשה מספיק דק שקצהו שהמחטים קשה להשיג "הכישרון של" בדיית, אבל היכולת הזו מגיע גם עם תרגול. מחטים כי הם כל כך טוב כי הם לעוות בעת העברת הנפט halocarbon לא יהיה שימושי עבור דוחפים הכרומוזומים בתא. מחטים. זה כל-כך קהה כי הטיפים גלויים, גדול כמו 1/3 של הרוחב של כרומוזום כמו (או גדול) סביר מאוד להרוג את התא. היצירה של מחט מספיק בסדר לדחוף כרומוזומים, אבל לא כל כך בוטה עד כדי להרוג את התא הוא צעד קריטי של הפרוטוקול.

הצלחה גורמת בדרך כלל כאשר הבריאים משמשים לייצור תכשירים spermatocyte, הכרומוזומים קרוב לפני השטח העליון של התא שנבחרו עבור המיקרומניפולציה. ניסיונות לתמרן כרומוזומים קרוב לפני השטח-coverslip של התא לעיתים קרובות לגרום חריקת המחט המיקרומניפולציה לתוך coverslip, ניקב את התא, ובכך מסיימת את הניסוי. אם התא אינו מנוקבת או אחרת לא בריא, התא צריך לשרוד המיקרומניפולציה. מוות של תאים מאובחנת בקלות, כפי הכרומוזומים במהירות רבה להתאחד. Micromanipulated תאים בדרך כלל לשרוד "אנאפאזה" ואת ציטוקינזה, בהצלחה ערכנו ניסויים המיקרומניפולציה ארוך 6-אייץ '.

אמנם יש עקומת למידה תלולה, דרישה לרכוש את הציוד בחדר תשלובת micromanipulate, יש מידה רבה של ערך היכולת ידנית מיקום רכיבים הסלולר באופן מדויק. כאמור לעיל, יש אין שיטה אחרת זמין כעת המאפשר כזה מיקום מדויק מחדש של מבנים הסלולר גדול. יש היסטוריה ארוכה של שימוש המיקרומניפולציה כדי לעבור מבנים בתא. דוגמאות, עם איורים יפים של התהליך, לשימוש חוץ-גופית למדידת כוחות ללחוץ על "אנאפאזה" אני כרומוזומים8 ולהחיל מתח כדי כרומוזומים5 זמינים בספרות. בנוסף, דוגמאות רבות של איך המיקרומניפולציה יכול לשמש גם כדי לשנות את המיקום של מבנים אחרים28,תא דמוי microtubules29, לשבש מבנים אחרים בתא כמו מעטפת הגרעין13, או נתיך 14,תאים סמוכים15 מומחשים בספרות.

ניסויים המיקרומניפולציה עוד צריך להיעשות, כפי יכולתו ידנית מיקום הכרומוזומים ומבנים אחרים, כדי להחיל כוחות על מבנים, ויובילו למדידת כוחות על כרומוזומים בשלבים שונים של החטיבה תא טובה יותר הבנה של תהליכים תאיים, ויצירת מודלים מתמטיים מדויקים, ניבוי תהליכים תאיים. יישומים עתידיים יאפשר על מידה קלה של הכוחות על כרומוזומים בכל שלבי חלוקת התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מודים ג'סיקה הול לדיון בעל ערך שלה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR micro cover glass VWR 48366 249 25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease VWR AA44224-KT
KEL-F Oil #10 Ohio Valley Specialty Chemical 10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel Sigma-Aldrich S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps Fine Science Tools 11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube  Drummond Scientific Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective Any brand
microforge either custom built or Narashige MF-900
micromanipulator either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick PCS-6300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, R. Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon. Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).
  2. Carlson, J. G. Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata. Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).
  3. Nicklas, R. B., Staehly, C. A. Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle. Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).
  4. Nicklas, R. B. Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis. Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).
  5. Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes. Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).
  6. Nicklas, R. B., Ward, S. C. Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension. Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).
  7. Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
  8. Nicklas, R. B. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).
  9. Nicklas, R. B. The forces that move chromosomes in mitosis. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).
  10. Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis. Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).
  11. Zhang, D., Nicklas, R. B. The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells. Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).
  12. Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules. Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).
  13. Zhang, D., Nicklas, R. B. Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).
  14. Nicklas, R. B. Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).
  15. Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes. Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).
  16. Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm. Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).
  17. Forer, A., Koch, C. Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes. Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).
  18. Camenzind, R., Nicklas, R. B. The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis. Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).
  19. Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae). Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).
  20. Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius. Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).
  21. Golding, A. E., Paliulis, L. V. Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution. PLoS One. 6, e24748 (2011).
  22. Doan, R. N., Paliulis, L. V. Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer). Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).
  23. Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension. Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).
  24. Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , http://micromanipulator.scholar.bucknell.edu (2018).
  25. Ellis, G. W. Piezoelectric micromanipulators. Science. 138 (3537), 84-91 (1962).
  26. Ellis, G. W., Begg, D. A. Chromosome micromanipulation studies. Mitosis/Cytokinesis. Zimmerman , A. M., Forer, A. , Academic Press. 155-179 (1981).
  27. Powell, E. O. A microforge attachment for the biological microscope. Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).
  28. Alsop, G. B., Zhang, D. Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).
  29. Zhang, D., Nicklas, R. B. Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes. Nature. 382, 466-468 (1996).

Tags

ביולוגיה התפתחותית 140 בעיה חוץ-גופית כרומוזומים מיטוזה מיוזה spermatocytes חגבים צרצרים
חוץ-גופית של הכרומוזומים Spermatocytes חרקים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, N. K. H., Nance, R., Szybist,… More

Lin, N. K. H., Nance, R., Szybist, J., Cheville, A., Paliulis, L. V. Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes. J. Vis. Exp. (140), e57359, doi:10.3791/57359 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter