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Developmental Biology

गुणसूत्रों के Micromanipulation में कीट Spermatocytes

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57359
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3
1Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University, 2Department of Electrical and Computer Engineering, Bucknell University, 3Biology Department, Bucknell University

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम micromanipulation के लिए उपयुक्त कक्षों के चयन और तैयारी का वर्णन करते हैं और उन कक्षों के भीतर गुणसूत्रों का स्थान लेने के लिए एक piezoelectric micromanipulator का उपयोग करते हैं ।

Abstract

गुणसूत्रों के micromanipulation गुणसूत्र कांग्रेस, धुरी चौकी, और anaphase गुणसूत्र आंदोलनों के लिए तंत्र को रोशन करने के लिए एक अनिवार्य तरीका रहा है, और गुणसूत्र आंदोलनों नियंत्रण क्या समझ के लिए महत्वपूर्ण है एक कक्ष विभाजन के दौरान । एक कुशल जीवविज्ञानी एक micromanipulator का उपयोग करने के लिए धुरी से गुणसूत्रों अलग कर सकते हैं, सेल के भीतर गुणसूत्रों की स्थिति, और एक बहुत ही ठीक टिप के साथ एक छोटे गिलास सुई का उपयोग गुणसूत्रों के लिए बलों को लागू करने के लिए । जबकि perturbations इस तरह के ऑप्टिकल ट्रैपिंग और एक लेज़र के अंय उपयोगों के रूप में अंय तरीकों का उपयोग कर गुणसूत्रों के लिए बनाया जा सकता है, तारीख करने के लिए, कोई अंय तरीका सेल को कोई नुकसान के साथ माइक्रोन के सैकड़ों के लिए दसियों के पैमाने पर सेलुलर घटकों की स्थिति की अनुमति देता है .

गुणसूत्रों के micromanipulation के लिए उपयुक्त कोशिकाओं के चयन और तैयारी, विशेष रूप से टिड्डी और क्रिकेट spermatocyte प्राथमिक संस्कृतियों के लाइव सेल इमेजिंग और micromanipulation में उपयोग के लिए तैयारी का वर्णन है, यहां बताई । इसके अलावा, हम एक सुई के निर्माण के लिए सेल के भीतर गुणसूत्रों चलती के लिए इस्तेमाल किया जा दिखाने के लिए, और विभाजन कोशिकाओं के भीतर गुणसूत्रों की स्थिति के लिए यह करने के लिए संलग्न एक गिलास सुई के साथ एक जॉयस्टिक नियंत्रित piezoelectric micromanipulator का उपयोग करें । एक नमूना परिणाम एक micromanipulator का उपयोग एक प्राथमिक spermatocyte में एक धुरी से एक गुणसूत्र अलग करने के लिए और कक्ष के भीतर उस गुणसूत्र की स्थिति को दर्शाता है ।

Introduction

Micromanipulation एक गुणसूत्र कांग्रेस, धुरी चौकी, और anaphase गुणसूत्र आंदोलनों के लिए तंत्र के कुछ हिस्सों से पता चला है । जल्दी micromanipulation प्रयोगों के परिणामों का वर्णन प्रकाशन रॉबर्ट चेंबर्स1द्वारा किया गया । चैंबर्स एक यांत्रिक micromanipulator एक संलग्न गिलास सुई के साथ एक नंबर की कोशिका द्रव्य जांच करने के लिए इस्तेमाल किया विभिन्न प्रकार के सेल. दुर्भाग्य से, विपरीत तरीकों कि गुणसूत्रों और कई अंय जीवित कोशिकाओं में सेलुलर घटकों के दृश्य की अनुमति दी समय पर उपलब्ध नहीं थे, इसलिए ' चैंबर प्रयोगों ऐसे सेलुलर घटकों की स्थिति का प्रभाव नहीं दिखा सकता है । जल्दी micromanipulations कि गुणसूत्र स्थिति बदल मंडलों उपकरण इस्तेमाल के लिए anaphase कोशिकाओं में धुरी midzone झाडू, दिखा रहा है कि इस तरह के जोड़तोड़ anaphase टिड्डी neuroblasts 2 में गुणसूत्र हथियारों की स्थिति को बदल सकता है . Nicklas और उनके सहयोगियों के गुणसूत्रों के ठीक micromanipulations प्रदर्शन करने के लिए पहले थे,3गुणसूत्रों खींच, उन्हें धुरी से अलग और एक reorientation उत्प्रेरण3,4, एक स्थिर गुणसूत्रों5,6,7, और anaphase8,9में धुरी द्वारा उत्पादित बलों को मापने के लिए तनाव लागू करके malorientation । Nicklas लैब द्वारा अंय काम से पता चला कि cytoplasmic granules भी10 हेरफेर किया जा सकता है और कि centrosomes11micromanipulation द्वारा स्थिति हो सकती है । Micromanipulation गुणसूत्रों और अन्य सेलुलर घटकों को ले जाने के लिए सिर्फ उपयोगी नहीं है । एक micromanipulation सुई साफ कर सकते हैं demembranated कोशिकाओं12 में एक mitotic धुरी के माध्यम से कटौती या परमाणु लिफाफा13भंग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता. इसके अलावा, आसंन कोशिकाओं micromanipulation14,15से जुड़े हो सकते हैं ।

दिलचस्प प्रयोग है कि micromanipulation का उपयोग किया जा सकता है की इस तरह के एक विस्तृत विविधता के साथ, यह पहली नज़र में आश्चर्य की बात यह है कि micromanipulation प्रयोगों बहुत कुछ गुणसूत्र जीव द्वारा किया गया है । इस कमी के लिए एक कारण यह है कि mitotically-विभाजित प्रसंस्कृत कोशिकाओं है कि हड्डीवाला ऊतकों से प्राप्त कर रहे हैं और आमतौर पर गुणसूत्र आंदोलनों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं micromanipulate के लिए बेहद मुश्किल है. इन ऊतक संस्कृति कोशिकाओं को आम तौर पर एक cortical cytoskeleton कि "micromanipulation सुई के रास्ते में हो जाता है, और गुणसूत्रों या तो सुई से नहीं पहुंचा जा सकता है या सुई सेल के माध्यम से grinds, एक कोशिका टूटना और मौत के लिए अग्रणी । हम, और अन्य प्रयोगकर्ता जो micromanipulation का उपयोग करते हैं, सन्धिपाद कोशिकाओं को micromanipulation के लिए उत्तरदायी पाया है. सन्धिपाद spermatocytes आसानी से halocarbon तेल की एक परत के नीचे फैल रहे है और एक बहुत कम मजबूत cortical cytoskeleton एक कोशिका विभाजन के दौरान कोशिका झिल्ली अंतर्निहित है दिखाई देते हैं । इस प्रकार, सन्धिपाद परीक्षण spermatogonia के लिए आसानी से सुलभ गुणसूत्रों के साथ meiotically-विभाजन कोशिकाओं (spermatocytes) और mitotically-विभाजन कोशिकाओं (micromanipulation) का एक अच्छा स्रोत प्रदान करते हैं । एक सीरियल एक टिड्डी एक हेरफेर के दौरान तय spermatocyte के अनुभाग में पता चला कि सुई कोशिका झिल्ली प्रवेश कभी नहीं; कोशिका झिल्ली सुई के आसपास विकृतियों (Nicklas R.B., व्यक्तिगत संचार) । कीट और मकड़ी taxa की एक संख्या से Spermatocytes सफलतापूर्वक micromanipulated किया गया है, टिड्डे सहित, प्रार्थना mantids, फल मक्खियों, क्रेन मक्खियों, क्रिकेट, spittlebugs, पतंगे, काली विधवा मकड़ियों, तहखाने मकड़ियों, और गोला-बुनाई मकड़ियों 3,7,17,18,19,20,21,22। कल्चर्ड, mitotically-कीड़ों से कोशिकाओं को विभाजित कर micromanipulated जा सकता है. उदाहरण के लिए, टिड्डी neuroblasts में गुणसूत्रों एक प्राथमिक संस्कृति में गुणसूत्रों है कि आसानी से2,23micromanipulated जा सकता है । हमें संदेह है कि Drosophila और अन्य कीड़ों से प्राप्त उपलब्ध कल्चरल लाइनें भी micromanipulatable होंगी, हालांकि हमने इन कोशिकाओं के साथ तकनीक का परीक्षण नहीं किया है. हम बताएंगे कि कैसे टिड्डे और क्रिकेट से विभाजित कोशिकाओं को एक micromanipulation के लिए तैयार किया जा सकता है । क्रिकेट के लिए वर्ष के किसी भी समय सबसे पालतू दुकानों से प्राप्त करने के लिए आसान कर रहे हैं । टिड्डे गर्मियों में केवल आसानी से प्राप्य होते हैं जब तक शोधकर्ता के पास कोई प्रयोगशाला कॉलोनी तक पहुँच न हो, लेकिन इस्तेमाल की गई प्रजातियों (Melanoplus sanguinipes) में आसानी से कोशिकाओं को चपटा कर दिया जाता है, और लंबे, आसानी से छेड़छाड़ करने वाले गुणसूत्र होते हैं.

एक और कारण है कि micromanipulation प्रयोगों जीव की एक छोटी सी मुट्ठी भर से किया गया है कि micromanipulators कदम गुणसूत्रों अच्छी तरह से शायद ही बाजार में उपलब्ध हैं । हमने पाया है कि एक जॉयस्टिक नियंत्रित piezoelectric micromanipulator कोई कंपन, बहाव, या जॉयस्टिक आंदोलन और सुई आंदोलन के बीच अंतराल के साथ सुई आंदोलन को नियंत्रित करता है, लेकिन जोड़तोड़ के अन्य प्रकार भी सफलतापूर्वक गुणसूत्रों धक्का कर सकते हैं कक्ष में चारों ओर । एलिस और भीख25,26 द्वारा डिजाइन micromanipulators गुणसूत्रों के micromanipulation के लिए आदर्श होते हैं, हालांकि वे पुराने प्रौद्योगिकी का उपयोग करें । Piezoelectric micromanipulators वर्तमान में उपलब्ध है और आमतौर पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी में इस्तेमाल किया; हालांकि, इन micromanipulators नहीं सामांयतया जॉयस्टिक-नियंत्रित हैं । जॉयस्टिक नियंत्रण एक सफल micromanipulation के लिए आवश्यक चिकनी आंदोलनों के लिए महत्वपूर्ण है, और इसलिए एक कस्टम जॉयस्टिक एक गुणसूत्र micromanipulation के लिए वर्तमान में उपलब्ध piezoelectric micromanipulators काम करने के लिए निर्माण किया जाना चाहिए । जॉयस्टिक नियंत्रित piezoelectric micromanipulators है कि सबसे अच्छा काम सीधे स्थिति नियंत्रण है, जिसमें जॉयस्टिक के आंदोलन एक सुई आंदोलन करने के लिए सीधे अनुवाद ।

एक नए डिजाइन piezoelectric micromanipulator व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों है कि आसानी से और कुछ छोटे 3 डी मुद्रित घटकों से प्रतिस्थापित किया जा सकता से निर्माण किया जा सकता है, और यह24micromanipulation गुणसूत्र के लिए अच्छी तरह से काम करता है । micromanipulator समायोज्य संवेदनशीलता, मैनुअल मोटे स्थिति, और कोई कंपन, बहाव, या सुई आंदोलन में अंतराल, और सुई के प्रत्यक्ष स्थिति नियंत्रण है । वैज्ञानिकों उपलब्ध निर्देशों का उपयोग कर micromanipulator का निर्माण कर सकते है ऑनलाइन24। नीचे एक प्राथमिक spermatocyte सेल संस्कृति की तैयारी के लिए और उस संस्कृति में कोशिकाओं के भीतर गुणसूत्रों micromanipulating के लिए तरीके हैं ।

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Protocol

1. Micromanipulation के लिए प्राथमिक कीट Spermatocyte सेल कल्चर की तैयारी

  1. स्लाइड तैयारी
    1. एक 20 मिमी व्यास परिपत्र छेद स्लाइड के केंद्र में बाहर कट के साथ एक ७५ मिमी x 25 मिमी ग्लास स्लाइड प्राप्त करें ।
      नोट: ये खिड़की कांच के एक एकल पत्रक से काट रहे थे केंद्र में एक छेद के साथ एक गिलास स्लाइड के आकार का हो ।
    2. 2 एस के लिए एक Bunsen-बर्नर लौ के माध्यम से एक 25 मिमी x 25 मिमी #1 .5 coverslip चलाते हैं ।
    3. ग्लास स्लाइड में छेद के किनारे के आसपास वैक्यूम तेल लागू करें
    4. चित्रा 1के रूप में छेद पर coverslip प्लेस । यह प्रेस और एक तंग सील बनाने के लिए सुनिश्चित करें ।
    5. ग्लास स्लाइड फ्लिप और halocarbon तेल के साथ अच्छी तरह से विच्छेदन भरें ।
  2. माइक्रोस्कोप पर देखने के लिए Spermatocyte कल्चर की तैयारी
    नोट: यहां, हम टिड्डी या क्रिकेट कोशिकाओं का उपयोग संस्कृति तैयारी विधि का वर्णन । अंय arthropods की सामग्री का परीक्षण एक समान विधि का उपयोग कर कल्चरित किया जा सकता है ।
    1. उपवयस्क पुरुष क्रिकेट (या टिड्डे) प्राप्त करें । ठंडा करने के लिए लगभग 2 मिनट के लिए एक रेफ्रिजरेटर में एक जीवित कीट प्लेस यह anesthetize । विदारक कैंची का प्रयोग, जल्दी से सीधे पंख कलियों के पीछे पेट की लंबी धुरी के समानांतर पृष्ठीय सतह के माध्यम से कटौती । मैंयुअल रूप से पेट निचोड़ धीरे exoskeleton (चित्रा 2) में कटौती के माध्यम से परीक्षण धक्का ।
    2. संदंश का प्रयोग, एक विच्छेदन में अलग testes जगह अच्छी तरह से halocarbon तेल युक्त ।
    3. यदि आवश्यक हो, एक विदारक खुर्दबीन के नीचे परीक्षण देखें । उंहें छोटे टुकड़ों में विभाजित ठीक का उपयोग करते हुए कहा संदंश, किसी भी परीक्षण को कवर वसा को हटाने, और ठीक का उपयोग करें संदंश को परीक्षाओं को तोड़ने के लिए (3 ए और बी)आंकड़ा । coverslip (चित्रा 3सी) की सतह पर, तेल के तहत testes सामग्री फैला ।
    4. वृषण के फैले हिस्से तक testes सामग्री फैल बमुश्किल आंखों को ध्यान देने योग्य है (आंकड़ा 3सी) । जरूरत पड़ने पर अतिरिक्त तेल भरी पृथक्करण कुओं का उपयोग करें.

2. Micromanipulation

  1. microneedle का उत्पादन
    1. एक Bunsen बर्नर की लौ में एक (बाहरी व्यास में ०.८५ मिमी, भीतरी व्यास में ०.६५ मिमी) ग्लास ट्यूब के एक छोर प्लेस । इस तरह है कि एक १५० ° कोण का गठन किया है में कांच टयूबिंग के अंत खींचो, और संकीर्ण कांच टयूबिंग का एक विस्तारित क्षेत्र बनाया जाता है । पतली क्षेत्र में ट्यूबिंग तोड़ो ताकि कोण से विस्तार पतली क्षेत्र लगभग है 10 मिमी लंबी (चित्रा 4a) ।
    2. एक microforge का प्रयोग (या तो कस्टम-पावेल के अनुसार27 या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध- सामग्री की तालिकादेखें), गर्म प्लेटिनम तार को कांच सुई की नोक को छूने के लिए टिप पर गिलास पिघला । सुई और microforge (चित्रा 4B) के प्लेटिनम तार के बीच एक लगभग ४५ डिग्री कोण फार्म । गिलास गर्म तार से दूर खींचो, जबकि तार को गर्मी बंद, कांच सुई के अंत में ≤ १.५ mm की एक पतली टिप बनाने ।
      नोट: टिप व्यास को मापने के लिए मुश्किल हो जाएगा, लेकिन इस लंबाई की एक टिप के लिए एक फर्म लेकिन लचीला सुई कि micromanipulation के लिए उपयुक्त हो जाएगा उत्पादन की संभावना है । वैकल्पिक रूप से, एक micropipette खींचने के लिए एक उपयुक्त टिप व्यास के साथ कांच टयूबिंग बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (प्रयोगकर्ता के लिए अलग खींच व्यंजनों का परीक्षण करने के लिए एक उचित फर्म लेकिन काम के लिए लचीला microneedle उत्पादन होगा) । सुई एक धारक है कि हेरफेर सुई ऊपर वर्णित विधि के अनुसार बनाया करने के लिए इसी तरह के आकार का है में रखा जा सकता है ।
  2. पोजिशनिंग micromanipulator
    1. तैयार स्लाइड को एक उल्टे, चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के मंच पर रखें । विभाजन कक्ष ढूंढें और उंहें देखने के क्षेत्र में केंद्र । सबसे कम आवर्धन संभव का उपयोग कर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित ।
      नोट: हम एक 16X चरण-विपरीत उद्देश्य का इस्तेमाल किया ।
    2. सुई धारक में microneedle को micromanipulator पर रखें ।
    3. मैन्युअल रूप से सुई की नोक प्रकाश (चित्रा 5B) द्वारा रोशन किया जाता है ताकि माइक्रोस्कोप के प्रकाश पथ में microneedle की स्थिति.
    4. विमान है जिसमें कोशिकाओं झूठ के ऊपर माइक्रोस्कोप कई फोकल विमानों ध्यान केंद्रित ।
    5. X-और Y-अक्षों में सुई की छाया को खोजने के लिए कई बार कम संवेदनशीलता पर जॉयस्टिक नियंत्रक का उपयोग कर microneedle की स्थिति जानें । जब तक टिप की स्थिति दिखाई न दे तब तक स्थिति को पुनः समायोजित करना जारी रखें. सुई टिप ध्यान में है जब तक Z-अक्ष के साथ सुई की स्थिति को समायोजित करें ।
    6. कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित है, तो सेल विमान के ऊपर माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित है कि कोशिकाओं को सिर्फ ध्यान और अदृश्य से बाहर हैं । सुई की स्थिति इतना है कि इसकी टिप इस फोकल विमान में ध्यान में है फिर से समायोजित ।
    7. आवश्यकतानुसार माइक्रोस्कोप की आवर्धन समायोजित करें ।
      नोट: हम micromanipulation के लिए एक 100X १.४ संख्यात्मक एपर्चर (ना) चरण-कंट्रास्ट उद्देश्य थे ।
    8. उच्च आवर्धन उद्देश्य का उपयोग कर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करने के बाद, फिर कोशिकाओं को ध्यान केंद्रित और अदृश्य से बाहर हैं ताकि सेल विमान के ऊपर माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित. एक उच्च संवेदनशीलता सेटिंग का उपयोग करना, सुई की स्थिति को फिर से समायोजित कि इसकी टिप ध्यान में है और विमान जिसमें कोशिकाओं झूठ के ऊपर फोकल विमान में केंद्रित है ।
    9. कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित, उनकी स्थिति का समायोजन ताकि वे देखने के क्षेत्र के केंद्र में रहते हैं । सुई अब micromanipulation के लिए तैयार है ।
  3. गुणसूत्रों के Micromanipulation
    1. एक उच्च आवर्धन पर ठीक स्थिति के लिए के रूप में एक ही संवेदनशीलता की स्थापना का उपयोग करना, जॉयस्टिक का उपयोग करने के लिए microneedle नियंत्रण और चारों ओर गुणसूत्रों धक्का सेल के अंदर । कोशिकाओं के विमान के ऊपर सुई टिप रखो ।
    2. किसी गुणसूत्र को खींचने या खिसकाने के लिए, कक्ष के शीर्ष के पास गुणसूत्र पर फ़ोकस करें ।
      नोट: इन गुणसूत्रों हेरफेर करने के लिए आसान कर रहे है गुणसूत्रों coverslip के करीब जोड़कर यह संभावना है कि सुई coverslip में पीसने, सेल फट और प्रयोग समाप्त होगा बनाता है ।
    3. ध्यान में सुई टिप लाने के लिए जॉयस्टिक पर Z-अक्ष को समायोजित करें, और उसके बाद एक्स और वाई में जॉयस्टिक के साथ सुई टिप चाल और हेरफेर किया जा करने के लिए गुणसूत्र पर सीधे सुई के टिप जगह और repositi करने के लिए जोड़तोड़ की अनुमति देने के लिए वांछित दिशा में यह धक्का गुणसूत्र पर ।
    4. कैसे दूर गुणसूत्र धक्का दिया है पर निर्भर करता है, या तो गुणसूत्र को तनाव लागू या एक गुणसूत्र धुरी से अलग करने के लिए पर्याप्त तनाव लागू होते हैं । एक गुणसूत्र एक धुरी से हटा दिया जाता है एक बार, यह कक्ष के भीतर कहीं भी जगह है ।

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Representative Results

चित्रा 6 micromanipulation के संभावित उपयोग के कई उदाहरणों में 2 आसंन टिड्डी प्राथमिक spermatocytes का एक नमूना micromanipulation से पता चलता है । यह प्रयोग एक उल्टे, चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर किया गया था । 0:00 (बार दिखाया गया है मिनट में हैं) छवि दोनों कोशिकाओं को दिखाता है हेरफेर करने से पहले । नीचे कक्ष में एक गुणसूत्र micromanipulation सुई (0:05; काला तीर) द्वारा लागू तनाव के तहत दिखाया गया है और फिर पूरी तरह से धुरी (0:10; काला तीर) से अलग है । नीचे कक्ष में एक गुणसूत्र (6:25; पीला तीर) उस कोशिका के 1 धुरी ध्रुव की ओर धकेल दिया है (7:05; पीला तीर) और फिर मुख्य धुरी क्षेत्र (7:10; पीला क्षेत्र) के बाहर ले जाया गया । दोनों में हेरफेर गुणसूत्रों (पीले और काले तीर) इस प्रयोग में लगातार नए धुरी संलग्नक के एक गठन को रोकने के लिए micromanipulation सुई के साथ कुहनी से दब जा रहा द्वारा धुरी को रिattach से रखा जाता है । micromanipulation सुई द्वारा डाली गई छाया कुछ छवियों में दिखाई देती है, लेकिन सुई की नोक शायद ही कभी दिखती हो. इन छवियों को पता चलता है कि यह स्थिति के लिए संभव है, तनाव लागू करने के लिए, और micromanipulation का उपयोग कर धुरी से एक गुणसूत्र अलग । गुणसूत्रों अपने prometaphase, metaphase, और anaphase में एक धुरी से अलग किया जा सकता है, हालांकि anaphase गुणसूत्रों को अलग करने के लिए बेहद मुश्किल है ।

Figure 1
चित्रा 1 : ग् coverslip संलग्न के साथ स्लाइड । एक 25 मिमी x 25 मिमी, लौ-इलाज coverslip एक ७५ मिमी x 25 मिमी ग्लास स्लाइड के साथ जुड़ा हुआ है व्यास में एक 20 मिमी परिपत्र छेद में कटौती केंद्र और वैक्यूम तेल के साथ सील. दृश्य बुलबुले या coverslip के तहत वैक्यूम तेल में अंतराल की कमी को ध्यान दें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : क्रिकेट और टिड्डी से टेस्ट हटाने। टेस्ट (arrow) एक पुरुष क्रिकेट (Acheta domesticus-top) या एक टिड्डी (Melanoplus sanguinipes-नीचे) के बाद एक चीरा कीट के पेट पर किया जाता है, सीधे पंख कलियों (ऐरोहेड) के पीछे से हटाया जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : सेल की तैयारी फैल गई। (क) एक क्रिकेट के टेस्ट थोक तीर से दिखाया गया है । किसी एकल स्लाइड के लिए उपयोग किया गया testes खंड arrowhead द्वारा दिखाया गया है । स्केल बार = 1 मिमी. (ख) टिड्डी tests नलिकाओं की एक संख्या से बना रहे हैं । आमतौर पर, हम प्रत्येक स्लाइड के लिए एक किशोर पुरुष टिड्डी से 4 नलिकाओं इस्तेमाल किया, के रूप में इस छवि में दिखाया गया है । स्केल बार = 1 मिमी. (ग) या तो प्रजातियों के लिए, testes संदंश का उपयोग कर टूट रहे हैं, और वृषण खंडों की सामग्री halocarbon तेल में फैले हुए हैं । प्रसार तेल के तहत सामग्री का परीक्षण दिखाया जाता है । स्केल बार = 10 मिमी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्र 4 : एक micromanipulation सुई ग्लास टयूबिंग से गठित। (एक) सुई के सामान्य आकार कांच टयूबिंग (≥ 10 सेमी) की एक लंबी, unmodified खंड है, लगभग १५० ° के एक मोड़ के साथ लगभग 10 मिमी अंत (खींच और एक Bunsen बर्नर लौ में कांच टयूबिंग झुकने द्वारा गठित). (ख) पैनल microforge में रखी गई सुई को दिखाता है. सुई (arrowhead) प्लैटिनम वायर रेशा के साथ एक लगभग ६० ° कोण रूपों (तीर) यह हीटिंग से पहले । (ग) सुई की नोक (arrowhead) का गठन होने के बाद तुला काँच की ट्यूब को microforge में गर्म प्लैटिनम के तार रेशा (तीर) को छुआ जाता है और दूर खींचा जाता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : माइक्रोस्कोप प्रकाश पथ में सुई की नियुक्ति. (क) इस पैनल micromanipulator का एक दृश्य दिखाता है । (ख) यह पैनल micromanipulator सुई धारक में रखी micromanipulation सुई का क्लोज-अप दृश्य दिखाता है, जिसमें 3-डी मुद्रित प्लास्टिक का एक टुकड़ा है । (ग) एक सुई एक औंधा, चरण कंट्रास्ट माइक्रोस्कोप के प्रकाश पथ में तैनात टिप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : गुणसूत्रों के Micromanipulation दो निकटवर्ती टिड्डी प्राथमिक spermatocytes में । टाइंस मिनट में दिखाया गया है: एस 0:00 छवि micromanipulation से पहले दोनों कोशिकाओं को दर्शाता है । तनाव गुणसूत्र पर लागू किया जाता है (काले तीर से दिखाया गया है) उस सेल के शीर्ष धुरी पोल (0:05) की ओर micromanipulation सुई का उपयोग कर । गुणसूत्र धुरी से अलग है और नीचे धुरी ध्रुव (0:10) की ओर धकेल दिया है, और अंततः मुख्य धुरी क्षेत्र के बाहर चले गए (6:25, 7:05, और 7:10) । सन्निकट कक्ष में एक गुणसूत्र (6:25, पीले तीर) उस कोशिका में शीर्ष धुरी पोल की ओर धकेल दिया है (7:05, पीला तीर) और फिर मुख्य धुरी द्रव्यमान (7:10, पीले तीर) के बाहर ले जाया गया. स्केल बार = 10 µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

अभ्यास के साथ, चलती गुणसूत्रों कोशिका में चारों ओर दूसरा प्रकृति बन सकता है । सुइयों कि दोनों पर्याप्त कड़ी है और पर्याप्त रूप से पतली इत्तला दे दी है "के आदत प्राप्त" बनाना मुश्किल है, लेकिन यह क्षमता भी अभ्यास के साथ आता है । सुई कि इतना ठीक है कि वे ख़राब जब halocarbon तेल में ले जाया गया सेल में गुणसूत्रों धक्का के लिए उपयोगी नहीं होगा रहे हैं । सुई कि इतनी कुंद कर रहे है कि उनके सुझावों और दिखाई दे रहे है के रूप में एक गुणसूत्र की चौड़ाई (या बड़ा) के रूप में बड़े 1/3 बहुत सेल को मारने की संभावना है । एक सुई है कि पर्याप्त गुणसूत्रों पुश करने के लिए ठीक है, लेकिन इतना कुंद के रूप में सेल को मारने के लिए नहीं है की रचना प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण कदम है ।

सफलता आम तौर पर परिणाम जब स्वस्थ जीवों spermatocyte तैयारी बनाने के लिए उपयोग किया जाता है, और सेल की ऊपरी सतह के पास गुणसूत्रों micromanipulation के लिए चुना जाता है । कोशिका की coverslip-सतह के पास गुणसूत्रों में हेरफेर करने के प्रयास अक्सर coverslip में micromanipulation सुई पीसने में परिणाम और सेल puncturing, इस प्रकार प्रयोग को समाप्त । यदि कोशिका पंचर न हो या अन्यथा अस्वस्थ हो तो कोशिका micromanipulation जीवित रहनी चाहिए. कोशिका मृत्यु का आसानी से निदान हो जाता है, क्योंकि गुणसूत्रों का बहुत तेजी से झुरमुट एक साथ होता है । Micromanipulated कोशिकाओं को आम तौर पर anaphase और cytokinesis के माध्यम से जीवित है, और हम सफलतापूर्वक 6 एच लंबे micromanipulation प्रयोगों का आयोजन किया है ।

जबकि वहां एक खड़ी सीखने की अवस्था और एक आवश्यकता को micromanipulate करने के लिए कमर कस में उपकरण प्राप्त कर रहे हैं, वहां में मूल्य का एक बड़ा सौदा है मैंयुअल रूप से एक सटीक तरीके से सेलुलर घटकों की स्थिति में सक्षम किया जा रहा है । जैसा कि ऊपर कहा गया है, वहां कोई अंय विधि वर्तमान में उपलब्ध है कि बड़े सेलुलर संरचनाओं के इस तरह के सटीक स्थिति की अनुमति देता है । कक्ष में संरचनाओं को ले जाने के लिए micromanipulation का उपयोग करने का एक लंबा इतिहास है । उदाहरण के लिए, प्रक्रिया के सुंदर आंकड़ों के साथ, micromanipulation का उपयोग करने के लिए बलों anaphase मैं8 गुणसूत्रों पर लागू है और गुणसूत्रों के लिए तनाव आवेदन5 साहित्य में उपलब्ध हैं । इसके अलावा, कैसे micromanipulation भी सेल में अन्य संरचनाओं की स्थिति में परिवर्तन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की तरह microtubules28,29, परमाणु लिफाफा13की तरह सेल में अन्य संरचनाओं को बाधित, या फ्यूज सन्निकट कक्ष१४,१५ साहित्य में सचित्र हैं.

और अधिक micromanipulation प्रयोगों को करने की जरूरत है, के रूप में मैंयुअल रूप से स्थान गुणसूत्रों और अंय संरचनाओं की क्षमता, संरचनाओं के लिए बलों को लागू करने के लिए, और सेल प्रभाग के विभिंन चरणों में गुणसूत्रों पर बलों को मापने के लिए एक बेहतर नेतृत्व करेंगे सेलुलर प्रक्रियाओं की समझ, और सेलुलर प्रक्रियाओं के सटीक, भविष्यवाणी गणितीय मॉडल के निर्माण. भविष्य में आवेदन सेल प्रभाग के सभी चरणों में गुणसूत्रों पर बलों की एक आसान माप की अनुमति देगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम उसे मूल्यवान चर्चा के लिए जेसिका हॉल धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR micro cover glass VWR 48366 249 25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease VWR AA44224-KT
KEL-F Oil #10 Ohio Valley Specialty Chemical 10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel Sigma-Aldrich S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps Fine Science Tools 11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube  Drummond Scientific Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective Any brand
microforge either custom built or Narashige MF-900
micromanipulator either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick PCS-6300

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References

  1. Chambers, R. Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon. Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).
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गुणसूत्रों के Micromanipulation में कीट Spermatocytes
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Lin, N. K. H., Nance, R., Szybist,… More

Lin, N. K. H., Nance, R., Szybist, J., Cheville, A., Paliulis, L. V. Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes. J. Vis. Exp. (140), e57359, doi:10.3791/57359 (2018).

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