Summary
In questo protocollo, descriviamo la selezione e la preparazione delle celle appropriate per micromanipolazione e l'uso di un micromanipolatore piezoelettrico per riposizionare i cromosomi all'interno di quelle cellule.
Abstract
La micromanipolazione dei cromosomi è stato un metodo essenziale per illuminare il meccanismo per cromosoma congression, il punto di arresto mandrino e anafase cromosoma movimenti ed è stata la chiave per comprendere ciò che controlla i movimenti del cromosoma durante la divisione cellulare. Un biologo esperto può utilizzare un micromanipolatore per scollegare i cromosomi dal mandrino, per riposizionare i cromosomi all'interno della cellula e di applicare forze ai cromosomi utilizzando un ago di vetro piccolo con una punta molto fine. Mentre perturbazioni possono avvenire ai cromosomi utilizzando altri metodi quali l'intrappolamento ottico e altri usi di un laser, fin qui, nessun altro metodo consente il riposizionamento delle componenti cellulari sulla scala di decine o centinaia di micron con poco o nessun danno alla cella .
La selezione e la preparazione delle celle appropriate per la micromanipolazione dei cromosomi, in particolare descrivendo la preparazione di colture primarie di spermatocita cavalletta e Grillo per l'uso in cellule vive imaging e micromanipolazione, sono descritto qui. Inoltre, ci mostra la costruzione di un ago per essere utilizzato per spostare i cromosomi all'interno della cella e l'uso di un micromanipolatore piezoelettrico controllato joystick con un ago di vetro collegato ad esso per riposizionare i cromosomi all'interno della divisione delle cellule. Un risultato di esempio viene illustrato l'utilizzo di un micromanipolatore per staccare un cromosoma da un mandrino in un spermatocita primario e per riposizionare quel cromosoma all'interno della cellula.
Introduction
Micromanipolazione ha rivelato parti del meccanismo per un congression di cromosoma, il mandrino checkpoint e movimenti cromosoma anafase. La prima pubblicazione che descrive i risultati degli esperimenti di micromanipolazione era di Robert Chambers1. Chambers utilizzato un micromanipolatore meccanico con un ago di vetro allegata per sondare il citoplasma di un certo numero di diversi tipi di cellule. Purtroppo, i metodi di contrasto che ha permesso la visualizzazione dei cromosomi e molti altri componenti cellulari in cellule viventi non erano disponibili al momento, quindi esperimenti Chambers' non potevano mostrare gli effetti di tali componenti cellulari di riposizionamento. Micromanipulations precoce che ha alterato la posizione di cromosoma utilizzato apparato Chambers a spazzare la fosforila mandrino in cellule anafase, mostrando che tali manipolazioni potrebbero alterare la posizione dei bracci cromosomici in neuroblasti di cavalletta anafase2 . Nicklas e i suoi collaboratori furono i primi a eseguire bene micromanipulations dei cromosomi, stretching i cromosomi3, staccandole dal mandrino e inducendo un riorientamento3,4, stabilizzando una malorientation applicando tensione al cromosomi5,6,7, e misurando le forze prodotte da mandrini in anafase8,9. Altri lavori di laboratorio Nicklas ha mostrato che i granelli citoplasmici potrebbero anche essere manipolato10 e che centrosomi potrebbero essere riposizionati di micromanipolazione11. Micromanipolazione non è solo utile per lo spostamento di cromosomi e altri componenti cellulari. Un ago di micromanipolazione in modo pulito può tagliare attraverso un fuso mitotico in demembranated cellule12 o può essere utilizzato per sciogliere la busta nucleare13. Inoltre, le celle adiacenti possono essere fusi da micromanipolazione14,15.
Con una vasta gamma di interessanti esperimenti che può essere fatto utilizzando micromanipolazione, è a prima vista sorprendente che micromanipolazione esperimenti sono stati condotti dai biologi del cromosoma molto pochi. Una ragione per questa carenza è che divide mitotically cellule coltivate derivate dai tessuti dei vertebrati e sono comunemente usate per studiare i movimenti del cromosoma sono estremamente difficili da micromanipulate. Queste cellule hanno generalmente un citoscheletro corticale che "si mette di mezzo" della micromanipolazione dell'ago e cromosomi o non raggiungibili con l'ago o l'ago macina attraverso la cella, portando a una rottura delle cellule e la morte. Abbiamo e altri sperimentatori che usano micromanipolazione, abbiamo trovato degli artropodi cellule per essere suscettibili di micromanipolazione. Spermatociti artropodi sono facilmente diffondersi sotto uno strato di olio halocarbone e sembrano avere un molto meno robusto citoscheletro corticale sottostante la membrana delle cellule durante la divisione cellulare. Così, testicoli dell'artropodo forniscono una buona fonte di cellule di divisione meiotically (spermatociti) e mitotically per dividere le celle (spermatogoni) con cromosomi facilmente accessibili per micromanipolazione. Una divisione di serie di un spermatocita cavalletta fissata durante una manipolazione ha rivelato che l'ago non penetri mai la membrana delle cellule; la membrana cellulare si deforma intorno all'ago (Nicklas R.B., comunicazione personale). Spermatociti da un certo numero di taxa insetto e ragno sono state micromanipulated con successo, tra cui cavallette, mantidi, mosche della frutta, gru mosche, grilli, spittlebugs, falene, ragni vedova nera, ragni di cantina e orb-tessitura ragni 3,7,17,18,19,20,21,22. Le cellule coltivate, dividendo mitotically dagli insetti possono essere micromanipulated. Ad esempio, i cromosomi in neuroblasti cavalletta in una coltura primaria hanno cromosomi che possono essere prontamente micromanipulated2,23. Abbiamo il sospetto che il disponibile coltivate linee derivate da Drosophila e altri insetti sarà anche micromanipulatable, anche se non abbiamo testato la tecnica con queste cellule. Vi mostreremo come la divisione delle cellule da cavallette e grilli possono essere preparati per una micromanipolazione. Grilli sono facili da ottenere da maggior parte dei negozi di animali in qualsiasi momento dell'anno. Cavallette sono facilmente ottenibili in estate solo a meno che il ricercatore ha accesso ad una colonia di laboratorio, ma le specie utilizzate (spretus moorei) facilmente ha appiattito le cellule e i cromosomi lunghi, facile da manipolare.
Un altro motivo perché micromanipolazione esperimenti sono stati condotti da una piccola manciata di biologi è che micromanipolatori che i cromosomi si muovono bene sono raramente disponibili sul mercato. Abbiamo trovato che un micromanipolatore piezoelettrico controllato joystick controlla il movimento dell'ago senza vibrazioni, drift, o il ritardo tra il movimento del joystick e il movimento dell'ago, ma altri tipi di manipolatori anche con successo possono spingere i cromosomi intorno nella cella. Micromanipolatori progettati da Ellis e Begg25,26 sono ideali per la micromanipolazione dei cromosomi, anche se usano tecnologia precedente. Micromanipolatori piezoelettrici sono attualmente disponibili e comunemente utilizzati in elettrofisiologia; Tuttavia, questi micromanipolatori non sono in genere controllata mediante joystick. Joystick di controllo è la chiave per i lisci movimenti necessari per un successo micromanipolazione, e così un joystick personalizzato deve essere costruito per rendere i micromanipolatori piezoelettrici attualmente disponibili di lavoro per micromanipolazione un cromosoma. I micromanipolatori piezoelettrici controllato joystick che funzionano meglio sono controllo di posizione diretta, in cui il movimento del joystick si traduce direttamente in un movimento dell'ago.
Un micromanipolatore piezoelettrico di nuova concezione può essere costruito da parti disponibili in commercio che possono essere facilmente sostituiti e da alcuni piccoli componenti 3D stampati, e funziona bene per cromosoma micromanipolazione24. Il micromanipolatore non ha sensibilità regolabile, posizionamento manuale grossolana e nessuna vibrazione, deriva o ritardo nel movimento dell'ago e controllo diretto della posizione dell'ago. Gli scienziati possono costruire il micromanipolatore utilizzando istruzioni disponibili online24. Di seguito sono i metodi per la preparazione di una coltura cellulare spermatocita primario e per micromanipulating i cromosomi all'interno delle cellule in quella cultura.
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Protocol
1. preparazione di colture cellulari primarie spermatocita insetto per micromanipolazione
- Preparazione del vetrino
- Ottenere una lastra di vetro di 75 x 25 mm con un foro circolare di diametro 20 mm tagliato al centro della diapositiva.
Nota: Questi sono stati tagliati da un unico foglio di vetro della finestra per essere la dimensione di un vetrino con un foro al centro. - Eseguire un vetrino coprioggetti 25 mm x 25 mm #1.5 attraverso una fiamma di bruciatore di Bunsen per 2 s.
- Applicare grasso per vuoto intorno al bordo del foro nel vetrino
- Posto il coprioggetto sul foro come in Figura 1. Premilo e assicurarsi che formare una guarnizione a tenuta.
- Capovolgere il vetrino e riempire la dissezione bene con olio halocarbone.
- Ottenere una lastra di vetro di 75 x 25 mm con un foro circolare di diametro 20 mm tagliato al centro della diapositiva.
- Preparazione di cultura spermatocita per la visualizzazione su microscopio
Nota: Qui, descriviamo il metodo di preparazione di cultura usando cellule cavalletta o cricket. Contenuto di testicoli di altri artropodi possa essere coltivate utilizzando un metodo simile.- Ottenere grilli maschi subadulti (o cavallette). Posizionare un insetto vivente in frigorifero per circa 2 min a freddo-anestetizzare. Utilizzando le forbici per dissezione, tagliare rapidamente attraverso la superficie dorsale parallela all'asse lungo dell'addome direttamente dietro i germogli di ala. Manualmente e spremere l'addome delicatamente per spingere i testicoli attraverso il taglio nell'esoscheletro (Figura 2).
- Mediante pinze, inserire i testicoli isolati in una dissezione ben contenente olio halocarbone.
- Se necessario, Mostra i testicoli sotto un microscopio per dissezione. Dividere in pezzi più piccoli utilizzando forcipe ammenda-aguzzo, togliendo il grasso che copre i testicoli e utilizzare punte belle pinze per rompere i testicoli (Figura 3A e 3B). Diffondere il contenuto di testicoli sotto l'olio, sulla superficie del coprivetrino (Figura 3).
- Diffondere il contenuto di testicoli fino a quando la parte di diffusione del testicolo è appena percettibile per gli occhi (Figura 3). Se necessario, utilizzare pozzi ulteriore dissociazione olio-caricato.
2. micromanipolazione
- Produzione del microneedle
- Inserire un'estremità di un tubo di vetro (0,85 mm di diametro esterno, diametro interno mm 0,65) nella fiamma di un becco Bunsen. Tirare l'estremità del tubo di vetro in modo tale che un angolo di 150° è formata, e viene creata un'area estesa di tubazione di vetro stretto. Rompere il tubo nella regione sottile in modo che la regione sottile che si estende dal punto di vista è lungo circa 10 mm (Figura 4A).
- Utilizzando un microforge (o su misura secondo Powell27 o commercialmente disponibile-Vedi Tabella materiali), toccare la punta dell'ago di vetro per il legare di platino caldo per fondere il vetro sulla punta. Forma un angolo di circa 45° tra l'ago e il filo di platino di microforge (Figura 4B). Tirare il vetro dal filo caldo, mentre chiudendo il calore al filo, formando una sottile punta di ≤ 1.5 mm alla fine dell'ago di vetro.
Nota: Il diametro di punta sarà difficile da misurare, ma una punta di questa lunghezza è in grado di produrre un ago duro ma flessibile che sarà opportuno per micromanipolazione. In alternativa, un estrattore micropipetta potrebbe essere utilizzato per creare la tubazione di vetro con un diametro di punta appropriata (lo sperimentatore dovrà testare diverse ricette che tirare per produrre un microneedle opportunamente duro ma flessibile per il lavoro). L'ago può essere inserito in un supporto che ha la forma allo stesso modo per l'ago di manipolazione creato secondo il metodo sopra descritto.
- Posizionamento il micromanipolatore
- Posizionare il vetrino preparato sul palco di un microscopio invertito, contrasto di fase. Trovare la divisione delle cellule e loro centro nel campo visivo. Concentrarsi sulle cellule usando l'ingrandimento più basso possibile.
Nota: Abbiamo usato un obiettivo di contrasto di fase X 16. - Posizionare i microaghi nel supporto dell'ago sul micromanipolatore.
- Posizionare manualmente il microneedle nel percorso della luce del microscopio in modo che la punta dell'ago sia illuminata dalla luce (figura 5B).
- Il microscopio si concentrano diversi piani focali sopra il piano in cui si trovano le cellule.
- Riposizionare il microneedle usando il joystick di controllo a una bassa sensibilità diverse volte per trovare l'ombra dell'ago negli assi X e y. Continuare a regolare nuovamente la posizione fino a quando la posizione della punta è visibile. Regolare la posizione dell'ago lungo l'asse z fino a quando la punta dell'ago è a fuoco.
- Rimettere a fuoco sulle cellule, quindi concentrarsi il microscopio sopra l'aereo di cella in modo che le cellule sono appena fuori fuoco e invisibile. Regolare nuovamente la posizione dell'ago in modo che la punta sia a fuoco in questo piano focale.
- Regolare l'ingrandimento del microscopio.
Nota: Abbiamo usato un obiettivo di contrasto di fase apertura numerica (NA) 100 X 1.4 per la micromanipolazione. - Dopo aver focalizzato sulle cellule con l'obiettivo di ingrandimento maggiore, nuovamente concentrarsi il microscopio sopra l'aereo di cella in modo che le cellule sono appena fuori fuoco e invisibile. Utilizzando un'impostazione di sensibilità superiore, regolare nuovamente la posizione dell'ago, così che la sua punta è a fuoco e centrato nel piano focale sopra il piano in cui si trovano le cellule.
- Rimettere a fuoco sulle cellule, regolare la loro posizione quindi restano al centro del campo visivo. L'ago è ora pronto per la micromanipolazione.
- Posizionare il vetrino preparato sul palco di un microscopio invertito, contrasto di fase. Trovare la divisione delle cellule e loro centro nel campo visivo. Concentrarsi sulle cellule usando l'ingrandimento più basso possibile.
- Micromanipolazione dei cromosomi
- Utilizzando la stessa impostazione di sensibilità per quanto riguarda il posizionamento bene ad un alto ingrandimento, utilizzare il joystick per controllare i microaghi e spingere i cromosomi intorno all'interno della cellula. Tenere la punta dell'ago sopra il piano delle cellule.
- Per tirare o spostare un cromosoma, concentrarsi su un cromosoma nella parte superiore della cella.
Nota: Questi cromosomi sono più facili da manipolare-manipolazione cromosomi vicino a che coprivetrino rende probabile che l'ago macinerà nel vetrino coprioggetto, scoppiando la cella e termina l'esperimento. - Regolare l'asse z sul joystick per portare la punta dell'ago messa a fuoco e quindi spostare l'ago punta con il joystick in X e Y. Posizionare la punta dell'ago direttamente sul cromosoma ad essere manipolato e spingerlo nella direzione desiderata per consentire il manipolatore a repositi sul cromosoma.
- A seconda di quanto lontano il cromosoma è spinto, applicare tensione al cromosoma oppure applicare una tensione sufficiente per staccare un cromosoma dal mandrino. Una volta che un cromosoma viene rimosso da un mandrino, posizionarlo in qualsiasi punto all'interno della cellula.
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Representative Results
Figura 6 Mostra una micromanipolazione campione di 2 spermatociti primari adiacenti cavalletta in diversi esempi dei possibili utilizzi di micromanipolazione. Questo esperimento è stato fatto utilizzando un microscopio invertito, contrasto di fase. 0:00 (i tempi indicati sono in min:s) immagine mostra entrambe le celle prima della manipolazione. Un cromosoma nella cella inferiore viene mostrato sotto tensione applicata dall'ago micromanipolazione (0:05; nero freccia) e quindi completamente staccato dal mandrino (0:10; nero freccia). Un cromosoma nella cella inferiore (06:25; freccia gialla) è spinto verso il palo 1 mandrino della cella (07:05; freccia gialla) e poi spostato all'esterno dell'area di mandrino principale (07:10; area gialla). Entrambi i cromosomi manipolati (frecce gialle e nere) in questo esperimento sono tenuti da ricollegare al mandrino di essere continuamente spinti con l'ago di micromanipolazione per impedire una formazione di nuovi collegamenti di mandrino. L'ombra proiettata dall'ago micromanipolazione è visibile in alcune immagini, ma la punta dell'ago è raramente visibile. Queste immagini mostrano che è possibile riposizionare e applicare la giusta tensione per staccare un cromosoma dal mandrino mediante micromanipolazione. I cromosomi possono essere staccati da un mandrino in loro prometafase, metafase e anafase, sebbene anafase i cromosomi sono estremamente difficili da staccare.
Figura 1 : Vetro vetrino con coprioggetto attaccato. Coprioggetto fiamma-trattati da 25 mm x 25 mm, è fissato a una lastra di vetro di 75 x 25 mm con un 20 mm nel foro circolare di diametro tagliato al centro e sigillato con grasso per vuoto. Si noti la mancanza di bolle visibili o lacune nel grasso per vuoto sotto il vetrino coprioggetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rimozione dei testicoli da cricket e cavalletta. Testicoli (freccia) possono essere rimosso da un grillo maschio (Acheta domesticus-top) o una cavalletta (spretus moorei-fondo) dopo aver effettuata un'incisione sull'addome dell'insetto, direttamente dietro i germogli di ala (frecce). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Preparazione della cella si sono diffuse. (A) la massa di testicoli di un grillo è indicata dalla freccia. Il segmento di testicoli utilizzato per una singola diapositiva è dimostrato dalla punta della freccia. Barra della scala = 1 mm (B) testicoli Grasshopper sono composti da un numero di tubuli. In genere, abbiamo usato 4 tubuli da una cavalletta maschio giovanile per ogni diapositiva, come mostrato in questa immagine. Barra della scala = 1 mm. (C) per sia specie, i testicoli sono rotti usando il forcipe, e il contenuto dei segmenti testicolo è distribuito in olio halocarbone. Il contenuto di testicoli di diffusione sotto olio è mostrato. Barra della scala = 10 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Un ago di micromanipolazione formato da un tubo di vetro. (A), la forma generale dell'ago è un segmento lungo, non modificato di vetro tubo (≥ 10 cm), con una curvatura di circa 150 ° circa 10 mm dalla fine (formata da stretching e piegare il tubo di vetro in una fiamma di bruciatore di Bunsen). (B) il pannello mostra l'ago inserito nella microforge. Le forme dell'ago (punta di freccia) un angolo di 60° circa con il filamento del legare di platino (freccia) prima del riscaldamento. (C), la punta dell'ago (punta di freccia) è formato dopo che il tubo di vetro piegato è toccato al filamento caldo filo di platino (freccia) nella microforge e tirato via. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Posizionamento dell'ago nel percorso ottico del microscopio. (A), questo pannello mostra una vista il micromanipolatore. (B), questo pannello mostra una vista ravvicinata dell'ago micromanipolazione collocata nel supporto dell'ago micromanipolatore, che è un pezzo di 3D stampata plastica. (C), A punta d'ago posizionato nel percorso della luce di un microscopio invertito, contrasto di fase. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Micromanipolazione dei cromosomi in due spermatociti primari adiacenti cavalletta. I tempi sono riportati in min:s. le 0:00 immagine mostra entrambe le celle prima la micromanipolazione. Tensione è applicata sul cromosoma (indicato dalla freccia nera) utilizzando l'ago di micromanipolazione verso il polo dell'alberino superiore della cella (0:05). Il cromosoma è staccato dal mandrino e spinto verso il palo di mandrino inferiore (0:10) e alla fine si è trasferito fuori della zona di mandrino principale (06:25, 07:05 e 07:10). Un cromosoma nella cella adiacente (06:25, freccia gialla) è spinto verso il polo superiore dell'alberino in quella cella (07:05, freccia gialla) e poi spostato di fuori della massa di mandrino principale (07:10, freccia gialla). Barra della scala = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Con la pratica, muoversi cromosomi nella cellula può diventare una seconda natura. Gli aghi che sono sufficientemente rigida e sufficientemente sottile punta sono difficili da "ottenere l'abilità di" fabbricando, ma questa abilità inoltre viene con la pratica. Gli aghi che sono così belle che deformano quando spostato nell'olio halocarbone non sarà utili per spingere i cromosomi nella cella. Gli aghi che sono così ottuso che loro suggerimenti sono visibili e come grande come 1/3 della larghezza di un cromosoma (o superiore) sono molto probabilmente uccidere la cellula. La creazione di un ago che è sufficiente per spingere i cromosomi, ma non così diretta quanto a uccidere la cellula è la fase cruciale del protocollo.
Successo si verifica in genere quando organismi sani sono utilizzati per realizzare preparazioni spermatocita e i cromosomi vicino alla superficie superiore della cella sono selezionati per micromanipolazione. Tentativi di manipolare i cromosomi vicino il vetrino coprioggetto-superficie della cella spesso causare macinazione l'ago di micromanipolazione nel vetrino coprioggetto e perforatura della cella, ponendo così fine all'esperimento. Se la cella non è forato o altrimenti malsano, la cellula deve sopravvivere micromanipolazione. Morte delle cellule è facilmente diagnosticata, come i cromosomi ammassarsi molto rapidamente. Micromanipulated cellule sopravvivono in genere attraverso l'anafase e citochinesi, e abbiamo condotto con successo esperimenti di micromanipolazione lungo 6 h.
Mentre ci sono una ripida curva di apprendimento e un obbligo di acquistare le apparecchiature in attrezzando per micromanipulate, c'è una grande quantità di valore nell'essere in grado di riposizionare manualmente i componenti cellulari in modo preciso. Come detto sopra, non c'è nessun altro metodo attualmente disponibile che consente tale riposizionamento preciso di grandi strutture cellulari. C'è una lunga storia di utilizzo di micromanipolazione per spostare strutture nella cella. Esempi, con belle figure del processo, di utilizzo di micromanipolazione per misurare le forze esercitate sulla anafase I cromosomi8 e applicare tensione ai cromosomi5 sono disponibili nella letteratura. Inoltre, molti esempi di come micromanipolazione può anche essere utilizzato per modificare la posizione di altre strutture nel cellulare-come microtubuli28,29, interrompere altre strutture nella cella come l' involucro nucleare13o fusibile celle adiacenti14,15 sono illustrati nella letteratura.
Ulteriori esperimenti di micromanipolazione devono essere fatte, come la possibilità di riposizionare manualmente i cromosomi e altre strutture, di applicare forze alle strutture, e per misurare le forze sui cromosomi in diversi stadi della divisione cellulare porterà ad una migliore la comprensione dei processi cellulari e la creazione di modelli matematici accurati, predittivi di processi cellulari. Applicazioni future verranno permetterà una facile misurazione delle forze sui cromosomi in tutte le fasi della divisione cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Jessica Hall per la sua preziosa discussione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25 mm x 25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order--call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
References
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