Developmental Biology

昆虫の精母細胞の染色体の顕微操作

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57359

Nicolas K.H. Lin¹, Ryder Nance², Jane Szybist², Alan Cheville², Leocadia V. Paliulis³

¹Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University, ²Department of Electrical and Computer Engineering, Bucknell University, ³Biology Department, Bucknell University

Summary

このプロトコルの選択とそれらの細胞内の染色体の位置を変更するマイクロマニピュレーション用の適切なセルの作製と圧電マイクロマニピュレーターの使用をについて説明します。

Abstract

マイクロマニピュレーション染色体の染色体の整列を進める、紡錘体チェックポイントおよび後期染色体の動きのメカニズムを照らすための重要な方法をされているし、何が染色体の動きをコントロールを理解する鍵となっています細胞分裂。熟練した生物学者は、スピンドル、細胞内の染色体の位置を変更し、染色体の小さなガラス針を用いた非常に細かいチップに力を加えるから染色体をデタッチするのにマイクロマニピュレーターを使用できます。摂動は、光圧など他の方法およびレーザーの他の用途を使用して染色体を行うことができます、まで、他の方法許可されません数十から数百ミクロンの細胞への損傷なしには少し規模の細胞成分の再配置.

選択とキリギリスとコオロギの精母細胞の初代培養の住セルイメージ投射とマイクロマニピュレーションで使用するための準備を具体的に解説した染色体の顕微操作の適切なセルの準備です。ここで説明しました。さらに、分裂細胞内の染色体の位置を変更するそれに取り付けられたガラス針でセル、およびジョイスティック制御の圧電マイクロマニピュレーターの使用内の染色体の移動に使用する針の構造を示します。サンプルの結果は、一次精母細胞のスピンドルから染色体を切断し、細胞内染色体を再配置するマイクロマニピュレーターの使用を示します。

Introduction

マイクロマニピュレーション、染色体の整列を進める、紡錘体チェックポイントおよび後期染色体の動きのメカニズムの部分を明らかにしました。マイクロマニピュレーション実験の結果を説明する最も早い文書はロバート・チェンバース¹だった。チャンバーは、プローブ数が異なる種類の細胞の細胞質に添付のガラスの針式マイクロマニピュレーターを使用しました。残念ながら、部屋の実験は、このような細胞成分を再配置の効果を表示できませんでしたので当時、利用できません染色体と細胞内の多くの他の細胞成分の可視化を許可するコントラストメソッドがでした。染色体位置を変更初期のマイクロマニピュレーションスピンドル midzone 後期の細胞でこのような操作が後期バッタ神経^{2 染色体腕の位置を変えることができることを示すを掃引するのにチャンバー装置を使用}.ニクラスと彼の共同研究された最初の染色体の良いマイクロマニピュレーションを実行する染色体³をストレッチ、スピンドルからそれらをデタッチおよび向きかえ³^,⁴、安定化を誘導します。malorientation 染色体⁵^,⁶^,⁷に張力を適用すると、後期⁸^,⁹のスピンドルによって生成される力を測定します。ニクラスラボ、他の作品は、細胞質の顆粒には操作¹⁰可能性があり、マイクロマニピュレーション¹¹によって中心を再配置できることを示した。マイクロマニピュレーションは染色体とその他の細胞の部品を移動するためだけに有用ではありません。マイクロマニピュレーション針は鞭毛細胞¹²の紡錘をきれいに切ることができるまたは核膜¹³を溶解する使用ことができます。さらに、隣接するセルはマイクロマニピュレーション¹⁴^,¹⁵融合することができます。

ことができる興味深い実験のような多種多様なマイクロマニピュレーションを使用すると、それ意外では一見マイクロマニピュレーション実験が非常にいくつかの染色体生物学者によって行われていること。この欠乏の理由の一つは、脊椎動物の組織から派生して、染色体の動きを研究するために使われる有糸分裂分割培養細胞は micromanipulate に非常に困難なことです。これらの培養細胞一般に針""目視の取得方法で、染色体に針が到達できないか、針は細胞壁の破壊、死につながる、セルを磨く皮質細胞骨格があります。我々は、マイクロマニピュレーションを使用している他の実験者は、マイクロマニピュレーションをしやすくする節足動物細胞を発見しました。節足動物精母細胞ハロカーボン油の層の下に簡単に広がっているし、はるかに少ない堅牢な皮質細胞骨格細胞膜細胞分裂の間に基になるに表示されます。したがって、節足動物の精巣を提供 meiotically 分割細胞 (精母細胞) の良い情報源、マイクロマニピュレーションを容易にアクセス可能な染色体を持つ細胞 (精原細胞) の有糸分裂分割します。針がない細胞膜を浸透明らかに操作中に固定バッタ状態のシリアルセクショニング細胞膜は、(個人的なコミュニケーションニクラス r. b.) の指針に変形します。昆虫とクモの分類群の数から精母細胞はバッタ、祈るカマキリ、ショウジョウバエ、ガガンボ、コオロギ、spittlebugs、蛾、ブラック未亡人のスパイダー、セラーのスパイダー、オーブ編むくも^{を含む micromanipulated を正常にされています。3}^,⁷^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹^,²²。昆虫から培養、有糸分裂分割セルは、micromanipulated をすることができます。たとえば、初代培養でバッタを神経芽細胞の染色体は、micromanipulated²^,²³を容易にすることができます染色体を持ちます。利用可能な培養ショウジョウバエ由来株とその他の昆虫が、micromanipulatable になりますが我々はこれらの細胞の手法をテストしていない疑いがあります。バッタやコオロギから細胞分裂を準備するマイクロマニピュレーション用ことができますどのように我々が表示されます。コオロギは、年の任意の時間でほとんどのペット店から入手しやすい。研究者研究室コロニーにアクセスできますが、使用される種 (飼 sanguinipes)、セル、および長い、操作が簡単な染色体に簡単に平坦化された場合を除き、バッタ、夏に簡単に得られるのみです。

なぜマイクロマニピュレーション実験は生物学者のほんの一握りで行われているもう一つの理由は、市場で、染色体をも移動マニピュレーターがまれに利用できることです。ジョイスティック制御の圧電マイクロマニピュレーター制御振動、ドリフトやジョイスティックの動きと針の動きのずれと針の動きが、他の種類のマニピュレーターも正常に染色体をプッシュすることが、我々は発見しました。周辺セルで。エリスと Begg²⁵^,²⁶によって設計されたマニピュレーターは、古い技術を使用して、彼らが染色体の顕微操作に最適です。圧電式のマイクロマニピュレーターは、現在入手可能な一般的に使用される電気生理学;しかし、これらのマニピュレーターは、通常のジョイスティック制御ではありません。ジョイスティックコントロールが成功したマイクロマニピュレーションに必要な滑らかな動きにキーとジョイスティックのユーザー設定、構築して染色体の顕微操作のために働く現在利用可能な圧電式のマイクロマニピュレーターをするので。最高動作するジョイスティック制御の圧電マニピュレーターがある直接位置制御、ジョイスティックの動きを針の動きに直接変換します。

簡単に置き換えることができます市販パーツといくつかの小さな 3次元印刷コンポーネントから新しく設計された圧電マイクロマニピュレーターを構築でき、染色体マイクロマニピュレーション²⁴適しています。マニピュレーターは調節可能な感度、手動粗位置決めと振動、ドリフト、または針の動きや針の直接位置決め制御の遅れ。科学者は、命令の利用可能なオンライン²⁴を用いたマイクロマニピュレーターを構築できます。以下は一次精母細胞の細胞培養の準備し、micromanipulating のメソッドをその文化の細胞内の染色体。

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Protocol

1. マイクロマニピュレーション用主な昆虫の精母細胞の細胞培養の準備

スライドの準備
1. スライドの中心をカット 20 mm 径の円孔を有する 75 mm × 25 mm のガラススライドを取得します。
  注: これらは中央の穴とスライドグラスのサイズにウィンドウガラスの単一のシートから切られました。
2. 2 ブンゼンバーナーの炎の中に 25 mm × 25 mm #1.5 coverslip を実行 s。
3. スライドガラスの穴のエッジの周りの真空グリスします。
4. 図 1のように穴の coverslip の場所。それを押すし、タイトなシールを形成することを確認します。
5. ガラススライドを反転し、ハロカーボンオイルとよく解剖を入力します。
顕微鏡の視野の精母細胞文化準備
注: ここでは、バッタやコオロギの細胞を用いた培養準備法について述べる。他の節足動物の精巣の内容は、同様のメソッドを使用して培養することができます。
1. 獣のオスのコオロギ (またはバッタ) を取得します。それ冷たい麻酔に約 2 分間冷蔵庫で生きている昆虫を配置します。解剖はさみを使用すると、すぐに切って背側表面翅芽の後ろに直接腹部の長軸に平行。外骨格 (図 2) でカットを通して精巣をプッシュする優しく腹部を手動で絞る。
2. 鉗子を使用すると、よくハロカーボン油を含む解剖に孤立した精巣を配置します。
3. 必要な場合は、解剖顕微鏡下精巣を表示します。細かい指摘鉗子、精巣を覆う脂肪を削除するを使用してより小さな部分に分割し、精巣 (図 3 aと3 b) を分割する細かい指摘鉗子を使用します。カバーガラス (図 3) の表面に、油の下で精巣の内容を広めます。
4. 精巣の広がり部分が目 (図 3) に顕著になるまでは、精巣内容を広げます。必要な場合は、追加オイルロード解離井戸を使用します。

2. マイクロマニピュレーション

マイクロニードルの生産
1. ブンゼンバーナーの炎で (0.85 mm 外径、内径 0.65 mm) ガラスチューブの片方の端を置きます。150 ° の角度を形成すると、その細いガラス管の拡張領域が作成されるような方法でガラス管の端を引き出します。角度から伸びる薄い地域が約 10 mm 長い (図 4 a) ので、薄い領域でチューブを破る。
2. 使用、マイクロフォージ (パウエル²⁷に従って顧客用または商業的利用を参照テーブルの材料)、先端にガラスを溶かす熱白金線にガラス針の先端に触れます。フォーム、針とマイクロフォージ (図 4 b) の白金線間約 45 ° の角度。Mm ガラス針の終わりに ≤1.5 の細い先端をフォーミングワイヤに熱を遮断しながら、熱線からガラスを引き出します。
  注: 先端の直径は、測定することは困難になりますこの長さの先端はマイクロマニピュレーション用適切であろう企業が柔軟な針を生産するそうです。また、マイクロピペットの引き手を利用して (実験者は仕事のため適切に企業が柔軟なマイクロニードルを生成する別の引きのレシピをテストする必要が) 適切な先端径のガラス管が作成される可能性があります。針は、上記の方法に従って作成操作針に同様に形はホルダーに置くことが。
マニピュレーターの位置
1. 、倒立位相差顕微鏡のステージに用意されたスライドを配置します。分割セルを検索し、ビューのフィールドの中央に。可能な最も低い倍率を使用して細胞に焦点を当てます。
  注意: 16 × 位相差対物を使用しました。
2. マニピュレーターにニードルホルダーのマイクロニードルを配置します。
3. 針の先端が (図 5 b) の光で照らされているので、顕微鏡の光路の位置、マイクロニードルは手動で。
4. セルがある平面上のいくつかの焦点面顕微鏡の焦点します。
5. X 軸と y 軸の針の影を見つけるために数回低感度でジョイスティックコントローラーを使用するマイクロニードルの位置を変更します。位置を再調整して、先端の位置が表示されるまで続けます。針の先端が焦点になるまでは、z 軸に沿って針の位置を調整します。
6. 再び焦点を当てる、細胞、細胞がただのボケと目に見えないようにセル面顕微鏡の焦点します。そのヒントがこの焦点面でフォーカスされるように針の位置を調整してください。
7. 必要に応じて顕微鏡の倍率を調整します。
  注: 我々は、マイクロマニピュレーション用 100 × 1.4 開口数 (NA) 位相差対物を使用しました。
8. 高倍率の目的を使用して細胞に着目し後、細胞がただのボケと目に見えないように再びセル面顕微鏡を焦点します。その先端は、フォーカスとセルがある平面上の焦点面の中央に配置して針の位置を再調整感度を高く設定を使用して。
9. 彼らの視野の中心に残っているので、位置の調整、細胞に焦点を当てます。針は、目視のため準備が整いました。
染色体の顕微操作
1. 高倍率で細かい位置と同様に感度設定を使用し、ジョイスティックでマイクロニードルを制御し、細胞内の染色体をこき使います。セルの面の上の針の先端を維持します。
2. 引くか、染色体の移動、セルの上部にある染色体に焦点を当てます。
  注: これらの染色体が簡単操作を操作する染色体に近い、coverslip は、可能性を針がセルを破裂させ、実験観察に挽くことです。
3. フォーカス、および、移動、針の X でジョイスティックと先端に針の先端を持って、ジョイスティックの z 軸を調整し、裕が直接操作して、repositi にマニピュレーターを許可する任意の方向にプッシュする染色体の針の先端を配置染色体。
4. どのくらい遠くまで染色体を押すと、に応じて染色体に張力を適用するか、またはスピンドルから染色体をデタッチするのには十分な張力を適用します。スピンドルから染色体を削除すると、セル内にある任意の場所それ。

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Representative Results

図 6は、マイクロマニピュレーションの用途のいくつかの例では 2 の隣接するバッタ一次精母細胞のサンプルマイクロマニピュレーションを示します。この実験が行われた、倒立位相差顕微鏡を使用しています。0:00 (示されている時刻は、min:s にある) イメージ操作する前に両方のセルが表示されます。マイクロマニピュレーション針によって適用される張力の下で下のセルに 1 つの染色体を示す (0:05; 黒矢印) とスピンドルから完全に剥離 (0:10; 黒矢印)。1 つ下のセル (6:25; 黄色の矢印) 染色体は (7:05; 黄色の矢印)、そのセルの 1 スピンドル極に向かってプッシュされ、主軸領域 (7:10; 黄色の領域) の外側に移り。この実験で両方操作染色 (黄色と黒矢印) 新しいスピンドル添付ファイルの形成を防ぐためにマイクロ針位置を微調整されている継続的に、スピンドルに再アタッチまま保持されます。マイクロマニピュレーション針の影がいくつかの画像に表示が針の先端はほとんどわかりません。これらの画像表示の位置を変更、張力を適用し、マイクロマニピュレーションを使用して主軸から染色体を切り離すことが可能です。染色体は、その prometaphase のスピンドルから切り離すことが、中期と後期では、後期染色体がデタッチする非常に困難です。

図 1:ガラス添付 coverslip のスライドです。25 mm × 25 mm、炎治療観察は、直径円形穴、センターカット、真空グリース密封の 20 mm の 75 mm × 25 mm ガラススライドに添付されます。目に見える泡や真空グリース、coverslip の下のギャップの欠如を注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 2:コオロギやキリギリスから精巣の除去。精巣 (矢印) は男性クリケットから削除できます (Acheta 国立公園-トップ) やバッタ (飼 sanguinipes-下) 翅芽 (矢印) のすぐ後ろ、昆虫の腹部の切開後。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 3:細胞の準備。(A) クリケットの精巣の大部分が矢印で表示されます。単一のスライドの使用する精巣セグメントは、矢印で示されます。スケールバー = 1 ミリメートル。 (B) バッタ精巣、細管の数で構成されます。この図のように、通常、我々はスライドごとに若年男性バッタから 4 の細管を使用しました。スケールバー = 1 ミリメートル。 (C) いずれか種、精巣が鉗子を使用して壊れていると精巣セグメントの内容は、ハロカーボン油で広がっています。オイル下広がり精巣の内容が表示されます。スケールバー = 10 mmこの図の拡大版を表示するにはここをクリックしてください。。

図 4:ガラス管から形成されたマイクロ針。(A) 針の一般的な形状は、約 150 ° (伸ばし、ブンゼンバーナーの炎でガラス管を曲げによって形成される) 端から約 10 mm の曲げガラス管 (≥10 cm) の長い間、変更されていないセグメント。(B) パネルは、マイクロフォージに針を示しています。針 (矢印) フォーム、それを加熱する前に白金フィラメント (矢印) と約 60 ° の角度。(C) 針 (矢印) の先端が曲がったガラス管は、マイクロフォージの白金熱線フィラメント (矢印) に触れた後に形成し、離れてプルします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 5:顕微鏡の光路で針の配置。(A) このパネル、マイクロマニピュレーターのビューを示しています。(B) このパネルショーマイクロマニピュレーション針のクローズアップビュー 3 D の作品は、マイクロマニピュレーター針ホルダーに配置印刷プラスチックです。(C) A の針先が、倒立位相差顕微鏡の光路に配置されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

図 6:2 つの隣接するバッタ一次精母細胞における染色体のマイクロマニピュレーション。時代は min:s. に示すように、0:00 イメージに目視する前に両方のセルが表示されています。(黒の矢印で表示) 染色体の緊張を適用、セルの上部スピンドル極に向かってマイクロマニピュレーション針を使って (0:05)。染色体がスピンドルから切り離され、下のスピンドル極に向かって押されて (0:10)、最終的に主軸エリア外移動 (6:25、7:05、および 7:10)。隣接するセル (6:25、黄色の矢印) の染色体は (7:05、黄色の矢印)、そのセルでトップスピンドル極の方にプッシュされ、主軸質量 (7:10、黄色の矢印) の外に移動し。スケールバー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

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Discussion

練習では、細胞での染色体の移動は、第二の天性になることができます。」のコツを取得"を十分に硬いと十分に薄い先端針しにくい加工しますが、この能力も実際に付属して。ハロカーボン油で移動すると変形の様子が結構、針は細胞の染色体を押すために便利されません。ヒントが表示され、染色体の幅の 1/3 くらい (またはそれ以上) は細胞を殺すために非常に可能性が高いので針を鈍らせます。染色体をプッシュする十分に細かいが、細胞を殺すためにないので鈍針の作成は、プロトコルの重要なステップです。

成功は、健康的な生物が精母細胞製剤を作るため使用されマイクロマニピュレーション用セルの上部の表面近傍の染色体が選択されている場合に通常発生します。セルの coverslip 表面近傍の染色体を頻繁に操作する試みは、マイクロマニピュレーション針を研削、coverslip と実験終了セルの穴をあけます。セルは穴を開けられない、またはそうでなければ不健康なセルは、マイクロマニピュレーションを生き残る必要があります。細胞死は簡単にしたと診断、染色体は非常に急速に一緒に群生します。Micromanipulated 細胞は通常後期と細胞質分裂、生き残るし、正常に 6 時間長いマイクロマニピュレーション実験を実施しました。

急な学習曲線と micromanipulate を進めてで機器を入手する必要があります、大量の正確な方法で細胞成分を手動で再配置することに価値があります。前述のように、大規模な細胞構造のような正確な再配置を可能にする他の方法を現在利用できるはありません。マイクロマニピュレーションを使用してセルの構造を移動するの長い歴史があります。例では、プロセスの美しい数字マイクロマニピュレーションを使用して力を測定する私の染色体⁸後期で出るし、緊張を適用の染色体⁵文献で利用できます。また、マイクロマニピュレーションは細胞の微小管の²⁸^,²⁹の他の構造体の位置を変更するにも使えますの多くの例を¹³核膜のようなセルに他の構造を破壊またはヒューズ隣接するセル¹⁴^,¹⁵は文献で示されます。

染色体と他の構造は、構造に力を適用するを手動で再配置する機能として行われる必要がありますより多くのマイクロマニピュレーション実験と細胞分裂の各段階で染色体の力を測定するためのより良いにつながる細胞のプロセスの細胞プロセスの正確な予測数学モデルの作成を理解します。将来のアプリケーションは、すべての細胞分裂の段階で染色体に力の簡単な測定が許可されます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgments

彼女の貴重な議論ありがとうジェシカホール。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
VWR micro cover glass	VWR	48366 249	25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease	VWR	AA44224-KT
KEL-F Oil #10	Ohio Valley Specialty Chemical	10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel	Sigma-Aldrich	S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps	Fine Science Tools	11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube	Drummond Scientific	Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective	Any brand
microforge	either custom built or Narashige	MF-900
micromanipulator	either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick	PCS-6300