Summary
이 프로토콜에서 선택과 그 세포 내에서 염색체 위치를 micromanipulation에 대 한 적절 한 셀의 준비와 압 전 micromanipulator의 사용을 설명 합니다.
Abstract
염색체의 micromanipulation는 염색체 congression, 스핀 들 검사점 및 anaphase 염색체 운동에 대 한 메커니즘을 조명 하는 필수적인 방법 고 있다 염색체의 움직임을 제어 하는 무슨을 이해 하는 열쇠 셀 부 중. 숙련 된 생물학자는 micromanipulator 염색체는 세포 내에서 위치를 변경 하 고 아주 좋은 팁는 작은 유리 바늘을 사용 하 여 염색체를 힘을 적용 하는 스핀 들에서 염색체를 분리 사용할 수 있습니다. 섭 염색체 광학 트래핑 같은 다른 방법과 레이저의 다른 사용을 사용 하 여 만들 수 있습니다, 하는 동안 날짜, 아니 다른 메서드를 사용 하면 셀에 아무 손상도 거의 미크론의 수백에 10의 규모에 세포 구성 성분의 위치 .
선택과 적절 한 세포의 염색체, 메뚜기 및 귀뚜라미 spermatocyte 기본 문화권의 준비 라이브 셀 이미징 및 micromanipulation, 사용에 대 한 설명의 micromanipulation에 대 한 준비는 여기 설명합니다. 또한, 우리는 나누어 세포 내에서 염색체 위치를 그것에 붙어 있던 유리 바늘으로 세포, 그리고 조이스틱 제어 압 전 micromanipulator 사용 내 염색체 이동에 사용할 바늘의 건설을 보여줍니다. 샘플 결과 micromanipulator 기본 spermatocyte에 스핀 들에서 염색체를 분리 하 고 세포 내에서 해당 염색체 위치를 사용을 보여준다.
Introduction
Micromanipulation은 염색체 congression, 스핀 들 검사점 및 anaphase 염색체 운동에 대 한 메커니즘의 일부를 공개 했다. 가장 이른 간행물 micromanipulation 실험의 결과 설명 하는 로버트 챔버1했다. 챔버는 여러 종류의 다른 세포의 세포질을 연결 된 유리 바늘 기계 micromanipulator를 사용. 불행 하 게도, 염색체와 살아있는 세포에 많은 다른 세포 구성 성분의 시각화를 허용 하는 대비 방법을 사용할 수 없었습니다, 당시 챔버 실험 재배치 같은 세포 구성 성분의 효과 표시 하지 수 있으므로. 초기 micromanipulations 염색체 위치를 변경 하는 이러한 조작 anaphase 메뚜기 neuroblasts2에서에서 염색체 팔의 위치를 변경할 수 보여주는 anaphase 셀에 스핀 들 midzone 청소 챔버 장치 사용 . 니와 그의 공동 작업자 최초로 염색체의 미세 micromanipulations 수행 염색체3스트레칭, 스핀 들에서 그들을 분리 하 고 재교육3,4, 안정화를 유도 한 염색체5,,67, 긴장을 적용 anaphase8,9스핀 들에 의해 생산 하는 힘을 측정 하 여 malorientation. 니 클 랩 다른 작업 세포질과 립 또한 조작된10 수와 micromanipulation11centrosomes의 위치를 변경할 수는 나타났다. Micromanipulation은 염색체와 다른 세포질 구성 요소 이동 단지 유용 하지 않습니다. Micromanipulation 바늘 demembranated 셀12 mitotic 스핀 들을 통해 청결 하 게 자를 수 있다 또는 핵 봉투13해산 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 인접 한 셀 micromanipulation14,15융합 될 수 있다.
이러한 다양 한 할 수 있는 재미 있는 실험의 micromanipulation를 사용 하 여, 그것은 첫눈에 놀라운 micromanipulation 실험 거의 염색체 생물학에 의해 수행 되었습니다. 이 결핍에 대 한 이유 중 하나입니다 척추 조직에서 파생 되 고 염색체 움직임을 공부에 대 한 일반적으로 사용 되는 mitotically 분할 배양된 세포 micromanipulate 매우 어렵다. 이 조직 배양 세포는 일반적으로 바늘 "방해가 된다"는 micromanipulation의 그리고 염색체 중 하나는 바늘에 의해 도달할 수 없는 또는 바늘 세포 파열 및 죽음으로 이어지는 셀 grinds 대뇌 피 질의 골격을 있다. 우리, 그리고 micromanipulation를 사용 하 여 다른 경험 arthropod 셀 micromanipulation 의무가 있을을 발견 했다. Arthropod spermatocytes halocarbon 기름의 층에서 쉽게 확산 하 고 세포 분열 중 세포 막 내부는 훨씬 강력한 대뇌 피 질의 골격을가지고 있는 것 같습니다. 따라서, arthropod testes meiotically 분할 세포 (spermatocytes)의 좋은 소스를 제공 하 고 (spermatogonia) micromanipulation 위한 쉽게 접근할 수 있는 염색체를 가진 세포 mitotically 분할. 바늘 적 세포 막; 침투 계시는 조작 하는 동안 고정 메뚜기 spermatocyte의 직렬 구분 바늘 (니 클 R.B., 개인 커뮤니케이션) 주위 세포 막 변형. 곤충과 거미 taxa의 수에서 spermatocytes 되었습니다 micromanipulated 성공적으로, 메뚜기, 등 기도 mantids, 과일 파리, 크레인 파리, 귀뚜라미, spittlebugs, 나 방, 검은 부 거미, 지하실 거미, 천체 길 쌈 거미 3,7,17,18,19,20,,2122. 곤충에서 교양, mitotically 분할 셀 micromanipulated 될 수 있습니다. 예를 들어 기본 문화에 메뚜기 neuroblasts에서 염색체 염색체 micromanipulated2,23쉽게 될 수 있는 있다. 우리 용의자 사용 가능한 교양 라인 초파리 에서 파생 된 다른 곤충 또한 micromanipulatable, 있을 것입니다 비록 우리가 이러한 세포와 기법을 테스트 하지 않았습니다. 우리는 어떻게 메뚜기와 귀뚜라미에서 셀 분할 수 준비는 micromanipulation에 대 한 표시 됩니다. 귀뚜라미 들 언제 든 지 올해의 대부분의 애완 동물 상점에서 얻을 수 있습니다. 메뚜기는 연구원 실험실 식민지에 권한이 않으면 종 사용 (Melanoplus sanguinipes)는 쉽게 평평 하 게 셀, 그리고 긴, 쉬운 조작 염색체만 여름에 쉽게 얻을 수 있습니다.
또 다른 이유 왜 micromanipulation 실험 생물학의 작은 소수에 의해 수행 되었습니다 micromanipulators 염색체를 잘 이동 하는 시장에서 거의 사용할 수입니다. 우리는 진동, 드리프트, 또는 조이스틱 움직임와 바늘 움직임 사이의 지연 없이 바늘 움직임을 제어 하는 조이스틱 제어 압 전 micromanipulator 하지만 조작자의 다른 유형 또한 성공적으로 염색체를 밀 수 있다 발견 주변 셀에. 하지만 그들은 오래 된 기술을 사용 하 여 설계한 엘리스와 Begg25,26 micromanipulators 염색체의 micromanipulation에 이상적입니다. 압 전 micromanipulators 현재 사용할 수 있으며 일반적으로 전기 생리학;에 사용 그러나,이 micromanipulators 일반적으로 조이스틱을 제어 하지 않습니다. 조이스틱 제어는 성공적인 micromanipulation에 필요한 부드러운 움직임을 키 고 그래서 사용자 정의 조이스틱 염색체 micromanipulation 위해 일 하는 현재 사용할 수 있는 압 전 micromanipulators을 건설 한다. 최고의 작품은 조이스틱 제어 압 전 micromanipulators 직접 위치 제어를, 조이스틱의 움직임이 바늘 움직임에 직접 변환 하는 있다.
새롭게 설계 된 압 전 micromanipulator 쉽게 대체 될 수 있습니다 상용 부품 및 일부 작은 3 차원 인쇄 구성 요소를 생성할 수 있습니다 그리고 염색체 micromanipulation24를 위해 잘 작동 합니다. micromanipulator 조정 가능한 감도, 수동 거친 위치 및 진동, 드리프트, 또는 지연 바늘 운동, 그리고 바늘의 직접 위치 제어에 있다. 과학자 들은 micromanipulator 지침 사용할 수 온라인24를 사용 하 여 구성할 수 있습니다. 아래 기본 spermatocyte 세포 배양 준비 및 micromanipulating 메서드는 그 문화에 있는 세포 내에서 염색체.
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Protocol
1. Micromanipulation에 대 한 기본 곤충 Spermatocyte 세포 배양의 준비
- 슬라이드 준비
- 슬라이드의 중심에서 밖으로 잘라 20 m m 직경 원형 구멍 75 m m x 25 m m 유리 슬라이드를 가져옵니다.
참고:이 창 유리 유리 슬라이드 중심에 구멍의 크기를 한 시트에서 절단 했다. - 2 분 젠 버너 불꽃을 통해 25 m m x 25 m m #1.5 coverslip 실행 s.
- 유리 슬라이드에 구멍의 가장자리 주위에 진공 그리즈
- 그림 1과 같이 구멍에 coverslip 장소. 그것은 누르고 단단한 물개를 형성 하는 것을 확인 하십시오.
- 유리 슬라이드를 플립 하 고 halocarbon 기름으로 잘 해 부를 입력 합니다.
- 슬라이드의 중심에서 밖으로 잘라 20 m m 직경 원형 구멍 75 m m x 25 m m 유리 슬라이드를 가져옵니다.
- 현미경에 대 한 spermatocyte 문화 준비
참고: 여기, 우리가 메뚜기 또는 귀뚜라미 셀을 사용 하 여 문화 준비 방법을 설명 합니다. 다른 절지동물의 testes 내용은 비슷한 방법을 사용 하 여 양식 수 있습니다.- Subadult 남성 귀뚜라미 (메뚜기)를 가져옵니다. 감기-anesthetize에 약 2 분 동안 냉장고에서 살아있는 곤충을 놓습니다. 해가 위를 사용 하 여 신속 하 게 잘라 등 쪽 표면을 통해 직접 날개 싹 뒤에 복 부의 긴 축에 평행. 수동으로 외장 (그림 2)에서 잘라내기 통해 testes를 부드럽게 복 부를 짠 다.
- 집게를 사용 하 여 고립된 고환을 잘 halocarbon 유를 포함 해 부에 배치 합니다.
- 필요한 경우, 해 현미경 testes 볼. 잘 지적 집게, testes, 다루는 모든 지방 제거를 사용 하 여 작은 조각으로 그들을 분할 하 고 벌금 지적 집게를 사용 하 여 (그림 3A 와 3B) testes 헤어. Coverslip (그림 3C)의 표면에 기름에서 testes 내용을 확산.
- 고환의 확산 부분은 눈 (그림 3C)에 거의 눈에 띄는 때까지 고환 내용을 확산. 추가 오일 로드 분리 웰 스를 사용 하 여 필요한 경우.
2입니다. micromanipulation
- 미세 바늘의 생산
- 분 젠 버너의 불꽃에 (0.85 m m 외경, 내경 0.65 m m) 유리 튜브의 한쪽 끝을 배치 합니다. 150 °의 각도 형성 하 고 좁은 유리 튜브의 확장된 영역 생성 방식에 유리 튜브의 끝을 당겨. 각도에서 연장 하는 얇은 지역은 약 10 m m 긴 (그림 4A) 얇은 지역에서 튜브를 휴식.
- microforge을 사용 하 여 (파월27 에 따라 주문 품 또는 상업적으로 사용 가능한 참조 테이블의 자료), 끝에 유리를 녹기 뜨거운 백 금 철사에 유리 바늘의 끝을 터치. 형태는 바늘과 microforge (그림 4B)의 백 금 철사 사이 약 45 ° 각도. 와이어, ≤1.5 유리 바늘의 끝에 m m의 얇은 끝을 형성 하는 열을 종료 하는 동안 뜨거운 철사에서 유리를 당겨.
참고: 팁 직경 측정 하기 어려운 것 이지만 끝이이 길이 micromanipulation에 대 한 적절 한 될 것입니다 확고 하지만 유연한 바늘을 생산할 가능성이. 또는, micropipette 끌어당기는 사람 (는 실험 작업에 대 한 적절 하 게 확고 하지만 유연한 미세 바늘을 생산 하는 다른 당기 조리법을 테스트 해야 합니다) 적절 한 팁 직경 유리 튜브를 만드는 데 사용 될 수 있습니다. 바늘 위에서 설명한 방법에 따라 만든 조작 바늘에 비슷한 모양의 홀더에 배치 될 수 있습니다.
- 위치는 micromanipulator
- 거꾸로, 단계 대조 현미경의 스테이지 준비 슬라이드를 놓습니다. 분할 셀을 찾아서 보기의 필드에 센터. 가능한 가장 낮은 확대를 사용 하 여 셀에 초점.
참고: 우리는 16 X 단계 대조 목적 사용. - 장소에는 micromanipulator에 바늘 홀더 미세 바늘.
- 바늘의 팁 (그림 5B) 빛에 의해 조명 되도록 수동으로 현미경의 빛 경로에 microneedle를 놓습니다.
- 초점 현미경 셀 거짓말 평면 위에 여러 초점 비행기.
- 사용 하 여 조이스틱 컨트롤러 낮은 감도에서 여러 번 여 X 축과 y 축의에 바늘의 그림자를 찾아 미세 바늘 위치를 변경할. 계속 팁의 위치 표시 될 때까지 위치를 조정 합니다. 바늘 팁은 초점에까지 z 축 따라 바늘의 위치를 조정 합니다.
- 셀, refocus 다음 셀이 단지 초점 그리고 보이지 않는 되도록 셀 평면 위의 현미경 초점. 그것의 팁이 초점면에 초점에 바늘의 위치를 재조정.
- 필요에 따라 현미경의 배율을 조정 합니다.
참고: 우리는 micromanipulation에 대 한 100 X 1.4 수 가늠 구멍 (NA) 단계 대조 목적을 사용. - 높은 배율 목표를 사용 하 여 셀에 초점을 맞추고, 후 다시 초점을 셀 평면 위의 현미경 세포는 단지 초점 그리고 보이지 않는 있도록. 팁 초점이 고 셀 거짓말 평면 위에 초점면에서 높은 감도 설정을 사용 하 여, 바늘의 위치 조정.
- 그래서 그들은 보기의 필드의 중앙에 남아 그들의 위치를 조정 하는 셀에 촛점. 바늘은 이제는 micromanipulation에 대 한 준비.
- 거꾸로, 단계 대조 현미경의 스테이지 준비 슬라이드를 놓습니다. 분할 셀을 찾아서 보기의 필드에 센터. 가능한 가장 낮은 확대를 사용 하 여 셀에 초점.
- 염색체의 micromanipulation
- 높은 확대에 좋은 위치에 관해서는 동일한 감도 설정을 사용 하는 미세 바늘을 제어 하 고 셀 내부를 염색체를 밀어 조이스틱을 사용 합니다. 셀의 평면 위에 바늘 팁을 유지.
- 당겨 또는 염색체 이동, 셀의 위쪽에 염색체에 초점.
참고: 이러한 염색체는 쉽게 조작 조작 염색체 가까이 coverslip 게 바늘 coverslip 셀 파열 및 실험 끝에 갈아 버릴 가능성이 있습니다. - 초점, 및 다음 이동 x에서 조이스틱 바늘 팁에 바늘 팁을가지고 조이스틱에 z 축 조정 및 Y. 조작 하 고 repositi 조작 수 있도록 원하는 방향으로 밀어 염색체에 직접 바늘의 팁을 배치 염색체.
- 염색체 누르면 얼마나 멀리에 따라 염색체에 긴장을 적용 하거나 스핀 들에서 염색체 분리에 충분 한 긴장을 적용 합니다. 염색체는 스핀 들에서 제거 되 면 장소 어디서 나 셀 내에.
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Representative Results
그림 6 micromanipulation의 가능한 사용의 몇 가지 예 2 인접 한 메뚜기 기본 spermatocytes의 샘플 micromanipulation를 보여 줍니다. 이 실험 수행 되었다 거꾸로, 단계 대조 현미경을 사용 하 여. 0:00 (시간 표시 있는 min:s) 이미지 조작 전에 두 셀을 보여 줍니다. 맨 아래 셀에 하나의 염색체 micromanipulation 바늘에 의해 적용 긴장 아래 표시 (0:05; 검은 화살표) 다음 스핀 들에서 완전히 분리 하 고 (0:10; 검은 화살표). 아래쪽 셀 (6시 25분; 노란색 화살표)에서 하나의 염색체 1 스핀 들 (7시 05분; 노란색 화살표) 해당 셀의 극을 향해 밀어 이며 (7시 10분; 노란색 영역) 주요 스핀 들 영역 외부 이동. 모두 조작된 염색체 (노란색과 검은색 화살표)이이 실험에서 새로운 스핀 들 첨부 파일의 형성을 방지 micromanipulation 바늘 nudged 지속적으로 되 고 의해 스핀 들에 다시 연결에서 유지 됩니다. Micromanipulation 바늘 캐스팅 그림자 일부 이미지에 표시 하지만 바늘의 팁은 거의 볼 수 있습니다. 이러한 이미지 재배치, 긴장을 적용 하 고 micromanipulation를 사용 하 여 스핀 들에서 염색체를 분리 하는 것을 보여줍니다. 염색체에 그들의 prometaphase, 스핀 들에서 분리 될 수 있다 분열, 그리고 anaphase, anaphase 염색체는 분리 하기가 매우 어렵습니다.
그림 1 : 유리 슬라이드 연결 하는 coverslip로. 25 m m x 25 m m, 화 염 처리 coverslip 직경 원형 구멍 중앙에 자르고 진공 그리스와 함께 봉인에 20 m m 75 m m x 25 m m 유리 슬라이드에 첨부 됩니다. 보이는 거품이 나는 coverslip 아래 진공 그리스에 간격의 부족 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 귀뚜라미와 메뚜기 testes의 제거. Testes (화살표) 남성 크리켓에서 제거할 수 있습니다 (Acheta domesticus-최고) 또는 메뚜기 (Melanoplus sanguinipes-하단) 바로 뒤에 날개 싹 (화살촉) 곤충의 복 부에 절 개 후. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 세포 확산의 준비. (A)는 크리켓의 testes 대량 화살표로 표시 됩니다. 단일 슬라이드에 대 한 사용은 testes 세그먼트 화살촉으로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 1 m m. (B) 메뚜기 testes tubules의 수 구성 됩니다. 일반적으로, 우리 사용 4 tubules 청소년 남성 메뚜기에서 각 슬라이드에 대해이 이미지와 같이. 눈금 막대 = 1 m m. (C) 중 종, testes 집게를 사용 하 여 고장 및 고환 세그먼트의 내용을 halocarbon 기름에 전파 됩니다. 석유에서 확산 testes 내용이 표시 됩니다. 눈금 막대 = 10 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : 유리 튜브에서 형성 하는 micromanipulation 바늘. (A)는 바늘의 일반적인 모양 (스트레칭과 유리 튜브를 구 부리는 분 젠 버너 화 염에 의해 형성 된) 끝에서 약 10 m m 약 150 °의 벤드 튜브 (≥10 cm), 유리의 긴, 수정 되지 않은 세그먼트 이다. (B) 패널은 microforge에 배치 하는 바늘을 표시 합니다. 바늘 (화살촉) 형태는 약 60 ° 각도 백 금 철사 필 라 멘 트 (화살표)가 열 전에. (C) (화살촉) 바늘의 팁 구부러진된 유리 튜브는 뜨거운 백 금 철사 필 라 멘 트 (화살표)에 microforge만 진 후 형성 이며 멀리 당 겼 다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 : 현미경 빛 경로에 바늘의 위치입니다. (A)이이 패널은 micromanipulator의 보기를 표시 합니다. (B)이이 패널 쇼 micromanipulation 바늘의 클로즈업 보기 micromanipulator 바늘 홀더, 3 차원 조각에 배치 플라스틱 인쇄. (C) 바늘 팁 거꾸로, 단계 대조 현미경의 빛 경로에 배치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 : 의 2 개의 인접 한 메뚜기 기본 spermatocytes에서 염색체 micromanipulation. 시간 0 min:s.에 표시 됩니다: 00 이미지는 micromanipulation 이전 두 셀을 보여 줍니다. 긴장 (검은색 화살표 표시) 염색체에 적용 하는 해당 셀의 위쪽 스핀 들 극으로 micromanipulation 바늘을 사용 하 여 (0:05). 염색체는 스핀 들에서 분리 하 고 아래쪽 스핀 들 극 쪽으로 밀어 (0:10), 결국 메인 스핀 들 영역 밖으로 이동 하 고 (6:25, 7:05, 그리고 7시 10분). 인접 한 셀 (6시 25분, 노란 화살표)에 염색체 (7시 05분, 노란색 화살표) 해당 셀에 위쪽 스핀 들 극 쪽으로 밀어 이며 다음 메인 스핀 들 질량 (7시 10분, 노란색 화살표) 밖으로 이동. 눈금 막대 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
연습으로, 세포에서 염색체를 이동 하는 것은 제 2의 천 될 수 있다. 충분히 뻣 뻣 한 그리고 충분히 얇은 밀고 바늘은 어려운 "의 요령" 조작, 하지만이 기능 또한 연습으로 온다. 그래서 괜 찮 그들은 변형 halocarbon 기름에 이동할 때 바늘 셀에 염색체를 추진 하는 데 유용 되지 않습니다. 그래서 바늘 그들의 팁을 볼 수 있습니다으로 염색체의 폭의 1/3로 (또는 더 큰)는 세포를 죽 일 가능성이 매우 무딘. 염색체를 충분히 괜 찮 아 요 하지만 셀 죽으로 너무 무딘 프로토콜의 중요 한 단계는 바늘의 창조.
성공에는 일반적으로 건강 한 유기 체는 spermatocyte 준비를 만들기 위해 사용 하 고 셀의 위쪽 표면 근처 염색체는 micromanipulation에 대 한 결과. 종종 셀의 coverslip 표면 근처 염색체를 조작 하는 시도 coverslip로 micromanipulation 바늘을 연 삭 및 실험 종료 따라서 puncturing 셀, 결과. 셀이 구멍이 나 그렇지 않으면 건강에 해로운 경우 셀 micromanipulation을 생존 한다. 세포 죽음은 쉽게 염색체 매우 빠르게 덩어리 같이, 진단 이다. Micromanipulated 셀은 일반적으로 anaphase cytokinesis, 통해 생존과 우리는 성공적으로 6 h 긴 micromanipulation 실험을 실시.
가파른 학습 곡선 및 micromanipulate에 박차에 장비 확보 필요가 있지만, 정확한 방식으로 수동으로 세포질 구성 요소 위치를 변경할 수 있는 값의 큰 거래가 이다. 위에서 말한 바와 같이, 거기 방법은 다른 현재 사용할 수 있는 큰 세포 구조의 재배치 하는 등 정확한 수입니다. Micromanipulation를 사용 하 여 셀에서 구조를 이동 하는 오랜 역사가입니다. 예, 프로세스의 아름 다운 수치와 micromanipulation를 사용 하 여 힘을 측정 하 나 염색체8 anaphase에 발휘 하 고 긴장을 적용 염색체5 문학에서 사용할 수 있습니다. 또한, micromanipulation 수 또한 사용 하는 방법을 셀 같은 microtubules28,29, 기타 구조물의 위치를 변경의 많은 예제13핵 같은 셀에 다른 구조를 중단 또는 퓨즈 인접 한 셀14,15 문학에서 설명 됩니다.
더 많은 micromanipulation 실험 수동으로 염색체와 구조에 힘을 적용 하기 위해 다른 구조를 재배치 하는 능력으로 할 필요가 하 고 세포 분열의 다른 단계에 있는 염색체에 힘을 측정 하는 더 나은에 이어질 것입니다. 세포질 과정, 그리고 세포질 과정의 정확 하 고, 예측 수학적 모델의 창조의 이해. 미래의 응용 프로그램 세포 분열의 모든 단계에서 염색체에 세력의 쉬운 측정을 허용할 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 그녀의 귀중 한 토론에 대 한 제시카 홀을 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| VWR micro cover glass | VWR | 48366 249 | 25 mm x 25 mm, no 1.5 |
| Dow Corning High Vacuum Grease | VWR | AA44224-KT | |
| KEL-F Oil #10 | Ohio Valley Specialty Chemical | 10189 | |
| Microdissecting Scissors, Stainless Steel | Sigma-Aldrich | S3271-1EA | |
| Dumont #5 fine foreceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| 0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube | Drummond Scientific | Custom order--call to request | |
| Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective | Any brand | ||
| microforge | either custom built or Narashige | MF-900 | |
| micromanipulator | either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick | PCS-6300 |
References
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