Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Mikromanipulation kromosomer i insekt spermatocyter

Published: October 22, 2018 doi: 10.3791/57359
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 3
1Program in Cell Biology/Biochemistry, Bucknell University, 2Department of Electrical and Computer Engineering, Bucknell University, 3Biology Department, Bucknell University

Summary

I detta protokoll beskriver vi urval och förberedelse av lämpliga celler för mikromanipulation och användning av en piezoelektrisk micromanipulator att flytta kromosomer i dessa celler.

Abstract

Mikromanipulation kromosomer har varit en viktig metod för upplysande mekanismen för kromosom congression, spindel checkpoint och Anaphasen kromosom rörelser, och har varit nyckeln till att förstå vad som styr kromosom rörelser under en celldelning. En skicklig biolog kan använda en micromanipulator för att lossa kromosomer från spindeln, flytta kromosomer i cellen, och att tillämpa styrkor till kromosomer med ett litet glas nål med en mycket fin spets. Medan störningar kan göras till kromosomer med andra metoder såsom optiska svällning och andra användningar av en laser, hittills, tillåter ingen annan metod ompositioneringen av cellulära komponenter på skalan av tiotals till hundratals mikrometer med liten eller ingen skada på cellen .

Urval och förberedelse av lämpliga celler för mikromanipulation kromosomer, som specifikt beskriver utarbetandet av gräshoppa och cricket spermatocyte primära cellkulturer för användning i live-cell imaging och mikromanipulation, är beskrivs här. Dessutom visar vi byggandet av en nål användas för flyttar kromosomer i cellen, och användning av en joystick-kontrollerade piezoelektriska micromanipulator med ett glas nålen bifogas det flytta kromosomer inom delande celler. Ett provresultat visar användningen av en micromanipulator att lösgöra en kromosom från en spindel i en primär spermatocyte och flytta den kromosomen inom cellen.

Introduction

Mikromanipulation har avslöjat delar av mekanismen för en kromosom congression, spindel checkpoint och Anaphasen kromosom rörelser. Den tidigaste publikation som beskriver resultaten av mikromanipulation experiment var av Robert Chambers1. Chambers används en mekanisk micromanipulator med en bifogad glas nål sond cytoplasman i ett antal olika celltyper. Tyvärr, kontrast metoder som tillät visualisering av kromosomer och många andra cellulära komponenter i levande celler inte var tillgängliga vid tiden så Chambers experiment inte kunde Visa effekterna av ompositionering sådana cellulära komponenter. Tidig micromanipulations som förändrade kromosomen position används Chambers apparaten för att sopa den spindeln midzone i Anaphasen celler, visar att sådana manipulationer kan ändra positionen för kromosom armar i Anaphasen gräshoppa neuroblasts2 . Nicklas och hans medarbetare var först att utföra fina micromanipulations av kromosomer, stretching kromosomerna3, du lossar dem från spindeln och förmå en omorientering3,4, stabilisera en malorientation av spänning för kromosomerna5,6,7, och mäta de krafter som produceras av spindlar i Anaphasen8,9. Annat arbete av Nicklas lab visade att cytoplasmiska korn också kan vara manipulerade10 och att centrosomes skulle flyttas av mikromanipulation11. Mikromanipulation är inte bara användbart för att flytta kromosomer och andra cellulära komponenter. En mikromanipulation nål renlig kan skära genom en mitotiska spindeln i demembranated celler12 eller kan användas för att upplösa den nuclear envelope13. Intilliggande celler kan dessutom vara smält av mikromanipulation14,15.

Med ett så brett utbud av intressanta experiment som kan göras med mikromanipulation är det vid första anblicken förvånande att mikromanipulation experiment har gjorts av mycket få kromosom biologer. En orsak till denna brist är att de mitotiskt dividera odlade celler som härrör från ryggradsdjur vävnader och används ofta för att studera kromosom rörelser är extremt svåra att micromanipulate. Dessa vävnadsodling celler har i allmänhet en kortikal cytoskelettet att ”kommer i vägen” av mikromanipulation nål, och kromosomerna antingen inte kan nås av nålen eller nålen slipar igenom cellen, vilket leder till en cell bristning och döden. Vi och andra praktiker som använder mikromanipulation, har hittat leddjur celler att vara mottagliga för mikromanipulation. Leddjur spermatocyter sprids lätt under ett lager av halocarbon olja och verkar ha en mycket mindre robust kortikala cytoskelettet underliggande cellmembranet under en celldelning. Således, leddjur testiklarna ger en bra källa av meiotically-att dela upp celler (spermatocyter) och mitotiskt-att dela upp celler (spermatogonier) med lättillgängligt kromosomer för mikromanipulation. En seriell sektionering av en gräshoppa spermatocyte fast under en manipulation avslöjade att nålen aldrig tränger cellmembranet; cellmembranet deformerar runt nålen (Nicklas R.B., personlig kommunikation). Spermatocyter från ett antal insekt och spider taxa har varit micromanipulated framgångsrikt, inklusive gräshoppor, be mantids, bananflugor, crane flugor, syrsor, spittlebugs, nattfjärilar, svarta änkan spindlar, källare spindlar och orb-vävning spindlar 3,7,17,18,19,20,21,22. Odlade, mitotiskt-att dela upp celler från insekter kan vara micromanipulated. Till exempel har kromosomerna i grasshopper neuroblasts i en primär kultur kromosomer som kan vara lätt micromanipulated2,23. Vi misstänker att de tillgängliga odlade linjer härrör från Drosophila och andra insekter blir också micromanipulatable, men vi inte har testat tekniken med dessa celler. Vi visar hur delande celler från gräshoppor och syrsor kan förberedas för en mikromanipulation. Syrsor är lätt att få från de flesta djuraffärer som helst på året. Gräshoppor är bara enkelt kan erhållas i sommaren om forskaren har tillgång till ett laboratorium koloni, men de arter som används (Melanoplus sanguinipes) har lätt tillplattad celler och lång, lätt-till-manipulera kromosomer.

En annan orsak varför mikromanipulation experiment har gjorts av en liten handfull biologer är att micromanipulators som flyttar kromosomer väl är sällan tillgängliga i marketplace. Vi har funnit att en joystick-kontrollerade piezoelektriska micromanipulator styr nålen rörelsen med ingen vibration, drift eller eftersläpning mellan den joystick rörligheten och nål, men andra typer av manipulatorer kan också framgångsrikt driva kromosomer runt i cellen. De micromanipulators designad av Ellis och Begg25,26 är idealiska för mikromanipulation kromosomer, även om de använder äldre teknik. Piezoelektriska micromanipulators är för närvarande tillgängliga och används ofta i elektrofysiologi; dessa micromanipulators är dock inte vanligtvis joystick-kontrollerade. Joystick kontroll är nyckeln till de mjuka rörelser som krävs för en lyckad mikromanipulation, och så en anpassad joystick bör utformas för att göra de nu befintliga piezoelektriska micromanipulators arbeta för en kromosom mikromanipulation. De joystick-kontrollerade piezoelektriska micromanipulators som fungerar bäst har direkt position kontroll, där rörelsen av joysticken översätter direkt till en nål rörelse.

En nydesignade piezoelektriska micromanipulator kan konstrueras från kommersiellt tillgängliga delar som lätt kan ersättas och några små 3D-utskrivna komponenter, och det fungerar bra för kromosom mikromanipulation24. Micromanipulator har justerbar känslighet, manuell grov positionering, och inga vibrationer, drift eller lagg i nålen rörelsen och direkt position kontroll av nålen. Forskare kan konstruera den micromanipulator som använder instruktioner tillgängliga online24. Nedan är metoderna för att förbereda en primär spermatocyte cellkultur och för micromanipulating kromosomer i cellerna i det kulturen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. beredning av primära insekt Spermatocyte cellkultur för mikromanipulation

  1. Bild förberedelse
    1. Erhålla en 75 x 25 mm glasskiva med ett 20 mm diameter cirkulärt hål klippa ut i mitten av bilden.
      Obs: Dessa sänktes från ett enstaka pappersark fönsterglas till storleken av en glasskiva med ett hål i mitten.
    2. Kör en 25 x 25 mm #1.5 täckglas genom en Bunsen-brännare flamma för 2 s.
    3. Vakuum smörj runt kanten av hålet i glasskiva
    4. Placera täckglaset på hålet enligt figur 1. Tryck på den och se till att bilda en tät förslutning.
    5. Vänd glasskiva och fyll dissektion väl med halocarbon olja.
  2. Spermatocyte kultur förberedelse för visning på mikroskopet
    Obs: Här beskriver vi den kultur förberedelse metod använder grasshopper eller cricket celler. Testiklarna innehållet i andra leddjur kan vara odlade med en liknande metod.
    1. Erhålla inomartspredation manliga syrsor (eller gräshoppor). Placera en levande insekt i kylskåp i ca 2 min till kalla-söva den. Snabbt använda dissekera saxen, skära genom den dorsala ytan parallellt med den långa axeln av buken direkt bakom vingen knopparna. Manuellt pressa magen försiktigt för att driva testiklarna genom snittet i exoskelett (figur 2).
    2. Med pincett, placera isolerade testiklarna i en dissektion brunn innehållande halocarbon olja.
    3. Om det behövs, Visa testiklarna i dissekera Mikroskop. Dela dem i mindre bitar med hjälp av fine-pekade pincett, ta bort något fett som täcker testiklarna, och använda böter-pekade pincett för att bryta upp testiklarna (figur 3A och 3B). Sprida testiklarna innehållet under oljan, på ytan av täckglaset (figur 3 c).
    4. Sprida testiklarna innehållet tills spridningen portion av testiklarna är knappt märkbar på ögonen (figur 3 c). Använd ytterligare olja-loaded dissociation brunnar vid behov.

2. mikromanipulation

  1. Produktionen av microneedle
    1. Placera ena änden av ett (0,85 mm i ytterdiameter, 0,65 mm i innerdiameter) glasrör i lågan av en Bunsen-brännare. Dra i slutet av glas slangen så att en 150° vinkel bildas, och ett utökat område av smala glas skapas. Bryta slangen i regionen tunn så att den tunna regionen sträcker sig från vinkeln är ca 10 mm lång (figur 4A).
    2. Med hjälp av en microforge (antingen specialanpassade enligt Powell27 eller kommersiellt tillgängliga-se Tabell för material), på spetsen av glas nålen till heta platina tråd att smälta glaset på spetsen. Bilda en ca 45° vinkel mellan nålen och platina tråd av microforge (figur 4B). Dra av glaset från het tråd, medan avstängning av värmen till tråd, bildar en tunn spets av ≤1, 5 mm vid slutet av glas nålen.
      Obs: Spets diameter blir svårt att mäta, men ett tips av denna längd är sannolikt att producera en fast men flexibel nål som kommer att vara lämpliga för mikromanipulation. Alternativt kunde en mikropipett avdragare användas för att skapa glas med en lämplig spets diameter (försöksledaren kommer behöva testa olika dragande recept för att producera en lämplig fast men flexibel microneedle för jobbet). Nålen kan placeras i en hållare som är formade på liknande sätt på manipulation nålen skapade enligt den metod som beskrivs ovan.
  2. Positionering av micromanipulator
    1. Placera den förberedda bilden på scenen av en inverterad, faskontrastmikroskop. Hitta delande celler och centrerar dem i synfältet. Fokusera på de celler som använder den lägsta förstoringen som möjligt.
      Obs: Vi använde en 16 X faskontrast mål.
    2. Placera microneedle i nålen hållaren på micromanipulator.
    3. Manuellt placera microneedle i ljusstrålen av mikroskopet så att spetsen på nålen är upplyst av ljuset (figur 5B).
    4. Fokusera mikroskopet flera fokal plan över plan där cellerna ligger.
    5. Flytta den microneedle använda joystick controller på en låg känslighet flera gånger att hitta skuggan av nålen i X- och y. Fortsätta att justera positionen tills spetsen är synliga. Justera positionen för nålen längs z-axeln tills nålens spets är i fokus.
    6. Fokusera på cellerna och sedan fokusera mikroskopet över cell plan så att cellerna är bara ur fokus och osynlig. Justera placeringen av nålen så att dess spets är i fokus i denna fokalplanet.
    7. Justera förstoringen av mikroskopet som behövs.
      Obs: Vi använde ett 100 X 1.4 numeriska bländaröppningen (NA) faskontrast mål för mikromanipulation.
    8. Efter fokusering på cellerna med målsättningen högre förstoring, igen fokusera mikroskopet över cell plan så att cellerna är bara ur fokus och osynlig. Använder en högre känslighet, justera placeringen av nålen så att dess spets är i fokus och centrerad i fokalplanet över plan där cellerna ligger.
    9. Fokusera på cellerna, justera sin position så att de förblir i mitten av synfältet. Nålen är nu redo för mikromanipulation.
  3. Mikromanipulation kromosomer
    1. Använder samma känslighetsinställning när det gäller den fina placeringen vid hög förstoring, Använd bläddringsknappen för att styra microneedle och driva kromosomerna inuti cellen. Håll kanylspetsen över plan av cellerna.
    2. Att dra eller flytta en kromosom, fokusera på en kromosom nära toppen av cellen.
      Obs: Dessa kromosomer är lättare att manipulera-manipulera kromosomer nära täckglaset gör det sannolikt att nålen kommer att slipa till den täckglas, spricker cellen och slutar experimentet.
    3. Justera z-axeln på joysticken för att bringa kanylspetsen i fokus, och sedan flytta nålen spets med joysticken i X och Y. Placera spetsen på nålen direkt på kromosomen att manipuleras och skjut den i önskad riktning att tillåta manipulatorn till repositi på kromosomen.
    4. Beroende på hur långt kromosomen skjuts, antingen spänning gälla med kromosomen eller Använd tillräcklig spänning för att lossa en kromosom från spindeln. När en kromosom avlägsnas från en spindel, placera den någonstans i cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 6 visar en prov mikromanipulation av 2 intilliggande gräshoppa primära spermatocyter i flera exempel på de möjliga användningsområdena för mikromanipulation. Detta experiment gjordes med hjälp av en inverterad, faskontrastmikroskop. 0:00 (gånger visas är i min:s) bilden visar båda cellerna före manipulering. En kromosom i cellen längst ned visas under spänning appliceras av mikromanipulation nålen (0:05; svart pil) och sedan helt fristående från spindeln (0:10; svart pil). En kromosom i cellen längst ned (6:25; gul pil) skjuts mot 1 spindel pol av cellen (7:05; gul pil) och flyttade sedan utanför området huvudspindel (7:10; gula området). Båda manipulerade kromosomer (gula och svarta pilar) i detta experiment hålls från återansluta till spindeln genom att kontinuerligt nudged med mikromanipulation nålen att förhindra ett bildande av nya spindel bilagor. Skuggan som kastas av mikromanipulation nålen är synliga i vissa bilder, men spetsen av nålen syns sällan. Dessa bilder visar att det är möjligt att flytta, tillämpa spänningar och lossa en kromosom från spindeln med mikromanipulation. Kromosomer kan tas loss från en spindel i deras metafasen, metafas och Anaphasen, även Anaphasen kromosomer är extremt svårt att ta loss.

Figure 1
Figur 1 : Glas bild med täckglas bifogas. Ett 25 mm x 25 mm, flame-behandlade täckglas är kopplad till en 75 x 25 mm glasskiva med en 20 mm i diameter cirkulärt hål skär i mitten och förseglade med vakuum fett. Notera avsaknaden av synliga bubblor eller luckor i vakuum fettet under täckglaset. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Borttagning av testiklarna från cricket och gräshoppa. Testiklarna (pil) kan tas bort från en manlig cricket (Acheta domesticus-topp) eller en gräshoppa (Melanoplus sanguinipes-botten) efter ett snitt på buken av insekten, direkt bakom vingen knopparna (pilspetsar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Beredning av cell spridning. (A) testiklarna huvuddelen av en cricket visas av pilen. Segmentet testiklarna används för en enskild bild framgår av pilspetsen. Skalstapeln = 1 mm. (B) gräshoppa testiklarna består av ett antal tubuli. Typiskt, vi använde 4 tubuli från en juvenil hane gräshoppa för varje bild som visas i denna bild. Skalstapeln = 1 mm. (C) för antingen arter, testiklarna är bruten med pincett, och innehållet i testiklarna segmenten sprids i halocarbon olja. Spridningen testiklarna innehållet under olja visas. Skalstapeln = 10 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : En mikromanipulation nål bildas från glas. (A) allmänna form av nålen är en lång, omodifierade segment av glas slangar (≥10 cm), med en krök av ungefärligt 150 ° ca 10 mm från slutet (bildas av stretching och böja glas slangen i en bunsenbrännare låga). (B) panelen visar nålen placeras i microforge. Formulären nål (pilspets) en cirka 60° vinkel med platina tråd glödtrådens (pil) före uppvärmning det. (C), spetsen på nålen (pilspets) bildas efter det böjda glasröret vidrörs till heta platina tråd glödtrådens (pil) i microforge och drog iväg. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Placering av nål i mikroskopet ljusstrålen. (A) denna panel visar en vy av micromanipulator. (B) denna panel visar en närbild av mikromanipulation nålen placeras i micromanipulator nål hållaren, som är en bit av 3-D tryckt plast. (C) en kanylspetsen placerad i ljusstrålen av en inverterad, faskontrastmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Mikromanipulation kromosomer i två intilliggande gräshoppa primära spermatocyter. Tiderna visas i min:s. 0:00 bilden visar båda cellerna före mikromanipulation. Spänning appliceras på kromosomen (visas med den svarta pilen) använder mikromanipulation nålen mot den övre spindel pol av cellen (0:05). Kromosomen är fristående från spindeln och sköt mot den nedre spindel Polen (0:10), och flyttade så småningom utanför området huvudspindel (6:25, 7:05 och 7:10). En kromosom i den intilliggande cellen (6:25, gul pil) skjuts mot övre spindel staven i cellen (7:05, gul pil) och flyttade sedan utanför huvudspindel massan (7:10, gul pil). Skalstapeln = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Med övning, kan flyttar kromosomer i cellen bli en andra natur. Nålar som är tillräckligt styva och tillräckligt tunn spets är svårt att ”få knep för” fabricera, men denna förmåga kommer också med praktiken. Nålar som är så fina att de deformeras när flyttade i halocarbon oljan blir inte användbar för att driva kromosomer i cellen. Nålar som är så trubbig att deras tips är synliga och lika stora som 1/3 av en kromosom bredd (eller större) är mycket sannolikt att döda cellen. Skapandet av en nål som är tillräckligt bra att driva kromosomer men inte så trubbig att döda cellen är det avgörande steget i protokollet.

Framgång resulterar vanligtvis när friska organismer används för att göra spermatocyte preparat, och kromosomerna nära den övre ytan av cellen är markerat för mikromanipulation. Försök att manipulera kromosomer nära täckglas-ytan av cellen ofta resultera i malning mikromanipulation nålen i täckglaset och punktera cellen, vilket gör slut på experimentet. Om cellen inte punkteras eller annars ohälsosamt, cellen bör överleva mikromanipulation. Celldöd är lätt diagnostiseras, som kromosomerna mycket snabbt klumpar ihop. Micromanipulated celler överlever vanligen genom Anaphasen och cytokines och vi har framgångsrikt bedrivit 6 h lång mikromanipulation experiment.

Medan det finns en brant inlärningskurva och ett krav på att förvärva utrustningen i förbereder sig för att micromanipulate, finns det en hel del av värde i att kunna manuellt flytta cellulära komponenter på ett precist sätt. Som nämnts ovan, finns det ingen annan metod för närvarande tillgängliga som tillåter sådan exakt ompositionering av stora cellulära strukturer. Det finns en lång historia av att använda mikromanipulation för att flytta strukturer i cellen. Exempel, med vackra siffror av processen, att använda mikromanipulation för att mäta krafter utövas på Anaphasen jag kromosomerna8 och tillämpa spänning till kromosomerna5 är tillgängliga i litteraturen. Dessutom många exempel på hur mikromanipulation kan också användas för att ändra läge och position av andra strukturer i cellen-liknande mikrotubuli28,29, störa andra strukturer i cellen som den nuclear envelope13eller säkring intilliggande celler14,15 illustreras i litteraturen.

Mer mikromanipulation experiment behöver göras, som förmågan att manuellt flytta kromosomer och andra strukturer, att tillämpa styrkor på strukturer, och för att mäta krafter kromosomerna i olika stadier av celluppdelningen kommer att leda till en bättre förståelse av cellulära processer och skapandet av korrekta, prediktiva matematiska modeller av cellulära processer. Framtida tillämpningar kommer att tillåta en enkel mätning av krafter på kromosomer i alla stadier av celldelning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Jessica Hall för hennes värdefulla diskussion.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
VWR micro cover glass VWR 48366 249 25 mm x 25 mm, no 1.5
Dow Corning High Vacuum Grease VWR AA44224-KT
KEL-F Oil #10 Ohio Valley Specialty Chemical 10189
Microdissecting Scissors, Stainless Steel Sigma-Aldrich S3271-1EA
Dumont #5 fine foreceps Fine Science Tools 11254-20
0.85 mm outer diameter, 0.65 mm inner diameter Pyrex glass tube  Drummond Scientific Custom order--call to request
Inverted, Phase contrast microscope with 10X or 16X low magnification objective and 60X or 100X high magnification objective Any brand
microforge either custom built or Narashige MF-900
micromanipulator either custom built or Burleigh PCS-6000 with custom piezo-controlling joystick PCS-6300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, R. Microdissection studies II. The cell aster: a reversible gelation phenomenon. Journal of Experimental Zoology. 23 (3), 483-505 (1917).
  2. Carlson, J. G. Microdissection studies of the dividing neuroblast of the grasshopper, Chortophaga viridifasciata. Chromosoma. 5 (3), 199-220 (1952).
  3. Nicklas, R. B., Staehly, C. A. Chromosome micromanipulation. I. The mechanics of chromosome attachment to the spindle. Chromosoma. 21 (1), 1-16 (1967).
  4. Nicklas, R. B. Chromosome micromanipulation. II. Induced reorientation and the experimental control of segregation in meiosis. Chromosoma. 21 (1), 17-50 (1967).
  5. Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. 3. Spindle fiber tension and the reorientation of mal-oriented chromosomes. Journal of Cell Biology. 43 (1), 40-50 (1969).
  6. Nicklas, R. B., Ward, S. C. Elements of error correction in mitosis: microtubule capture, release, and tension. Journal of Cell Biology. 126 (5), 1241-1253 (1994).
  7. Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
  8. Nicklas, R. B. Measurements of the force produced by the mitotic spindle in anaphase. Journal of Cell Biology. 97 (2), 542-548 (1983).
  9. Nicklas, R. B. The forces that move chromosomes in mitosis. Annual Review of Biophysics and Biophysical Chemistry. 17, 431-449 (1988).
  10. Nicklas, R. B., Koch, C. A. Chromosome micromanipulation. IV. Polarized motions within the spindle and models for mitosis. Chromosoma. 39 (1), 1026 (1972).
  11. Zhang, D., Nicklas, R. B. The impact of chromosomes and centrosomes on spindle assembly as observed in living cells. Journal of Cell Biology. 129 (5), 1287-1300 (1995).
  12. Nicklas, R. B., Lee, G. M., Rieder, C. L., Rupp, G. Mechanically cut mitotic spindles: clean cuts and stable microtubules. Journal of Cell Science. 94 (Pt 3), 415-423 (1989).
  13. Zhang, D., Nicklas, R. B. Chromosomes initiate spindle assembly upon experimental dissolution of the nuclear envelope in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Biology. 131 (5), 1125-1131 (1995).
  14. Nicklas, R. B. Chromosome distribution: experiments on cell hybrids and in vitro. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. 227 (955), 267-276 (1977).
  15. Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. The reduction of chromosome number in meiosis is determined by properties built into the chromosomes. Journal of Cell Biology. 150 (6), 1223-1232 (2000).
  16. Church, K., Nicklas, R. B., Lin, H. P. Micromanipulated bivalents can trigger mini-spindle formation in Drosophilamelanogaster spermatocyte cytoplasm. Journal of Cell Biology. 103 (6), 2765-2773 (1986).
  17. Forer, A., Koch, C. Influence of autosome movements and of sex-chromosome movements on sex-chromosome segregation in crane fly spermatocytes. Chromosoma. 40 (4), 417-442 (1973).
  18. Camenzind, R., Nicklas, R. B. The non-random chromosome segregation in spermatocytes of Gryllotalpa hexadactyla. A micromanipulation analysis. Chromosoma. 24 (3), 324-335 (1968).
  19. Ault, J. G., Felt, K. D., Doan, R. N., Nedo, A. O., Ellison, C. A., Paliulis, L. V. Co-segregation of sex chromosomes in the male black widow spider Latrodectus mactans (Araneae, Theridiidae). Chromosoma. 126 (5), 645-654 (2017).
  20. Felt, K. D., Lagerman, M. B., Ravida, N. A., Qian, L., Powers, S. R., Paliulis, L. V. Segregation of the amphitelically attached univalent X chromosome in the spittlebug Philaenus spumarius. Protoplasma. 254 (6), 2263-2271 (2017).
  21. Golding, A. E., Paliulis, L. V. Karyotype, sex determination, and meiotic chromosome behavior in two pholcid (Araneomorphae, Pholcidae) spiders: implications for karyotype evolution. PLoS One. 6, e24748 (2011).
  22. Doan, R. N., Paliulis, L. V. Micromanipulation reveals an XO-XX sex determining system in the orb-weaving spider Neoscona arabesca (Walckenaer). Hereditas. 146 (4), 180-182 (2009).
  23. Paliulis, L. V., Nicklas, R. B. Micromanipulation of chromosomes reveals that cohesion release during cell division is gradual and does not require tension. Current Biology. 14 (23), 2124-2129 (2004).
  24. Biology Micromanipulator. DIY High Precision Micromanipulator. , http://micromanipulator.scholar.bucknell.edu (2018).
  25. Ellis, G. W. Piezoelectric micromanipulators. Science. 138 (3537), 84-91 (1962).
  26. Ellis, G. W., Begg, D. A. Chromosome micromanipulation studies. Mitosis/Cytokinesis. Zimmerman , A. M., Forer, A. , Academic Press. 155-179 (1981).
  27. Powell, E. O. A microforge attachment for the biological microscope. Journal. Royal Microscopical Society. 72 (4), 214-217 (1953).
  28. Alsop, G. B., Zhang, D. Microtubules continuously dictate distribution of actin filaments and positioning of cell cleavage in grasshopper spermatocytes. Journal of Cell Science. 117 (Pt 8), 1591-1602 (2004).
  29. Zhang, D., Nicklas, R. B. Anaphase' and cytokinesis in the absence of chromosomes. Nature. 382, 466-468 (1996).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 140 mikromanipulation kromosomer Mitos meios spermatocyter gräshoppor syrsor
Mikromanipulation kromosomer i insekt spermatocyter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, N. K. H., Nance, R., Szybist,… More

Lin, N. K. H., Nance, R., Szybist, J., Cheville, A., Paliulis, L. V. Micromanipulation of Chromosomes in Insect Spermatocytes. J. Vis. Exp. (140), e57359, doi:10.3791/57359 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter