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Neuroscience

केंद्रीय थकान का एक चूहा मॉडल एक संशोधित एकाधिक प्लेटफ़ॉर्म विधि का उपयोग

Published: August 14, 2018 doi: 10.3791/57362
Automatic Translation
*1, *1, *1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 3
1School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, West China Hospital, Sichuan University, 3Institute of Tibetan Medicine, Tibetan Traditional Medical College
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम एक प्रोटोकॉल पेश करने के लिए केंद्रीय थकान का एक चूहा मॉडल का उपयोग कर संशोधित एकाधिक मंच विधि (MMPM) ।

Abstract

इस अनुच्छेद में, हम केंद्रीय थकान का एक चूहा मॉडल संशोधित एकाधिक मंच विधि (MMPM) का उपयोग शुरू की । एकाधिक प्लेटफ़ॉर्म बॉक्स नीचे संकीर्ण प्लेटफार्मों के साथ एक पानी के टैंक के रूप में डिजाइन किया गया था । मॉडल चूहों टैंक में डाल दिया गया था और प्रति दिन 14 घंटे के लिए प्लेटफार्मों पर खड़ा था (18:00-8:00) एक लगातार 21 दिनों के लिए, इसके विपरीत के लिए सेट एक खाली नियंत्रण समूह के साथ. मॉडलिंग के अंत में, मॉडल समूह में चूहों एक स्पष्ट थकान उपस्थिति दिखाई दिया । मॉडल का आकलन करने के लिए, हम ओपन फील्ड टेस्ट (बहुधा), ऊंचा प्लस भूलभुलैया (EPM) परीक्षण, और संपूर्ण तैराकी (ES) परीक्षण सहित कई व्यवहार परीक्षण, प्रदर्शन किया । परिणामों से पता चला कि चिंता, स्थानिक अनुभूति हानि, गरीब मांसपेशी प्रदर्शन, और अस्वीकृत स्वैच्छिक मॉडल चूहों में प्रस्तुत गतिविधि केंद्रीय थकान के निदान की पुष्टि । केंद्रीय न्यूरोट्रांसमीटर के परिवर्तन भी परिणाम का सत्यापन किया. अंत में, मॉडल सफलतापूर्वक केंद्रीय थकान अनुकरणीय, और मॉडल के साथ भविष्य के अध्ययन में मदद कर सकते है रोग तंत्र का पता चलता है ।

Introduction

थकान मुख्य कारकों में से एक है कि धमकी मानव स्वास्थ्य1। पिछले दशकों में, विभिंन शोध ने साबित कर दिया है कि थकान बाह्य है-ट्रिगर लेकिन केंद्र संचालित है, और हमेशा भावनात्मक और संज्ञानात्मक विकारों के साथ साथ । इटालियन physiologist ए. Mosso प्रथम ने वर्ड सेन्ट्रल थकान2का प्रस्ताव रखा । यह आम तौर पर केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में आवेग संचरण की शिथिलता के कारण सीमित स्वैच्छिक गतिविधि और अनुभूति हानि के रूप में परिभाषित किया गया है (सीएनएस)3. परिधीय मांसपेशी थकान के साथ तुलना में, केंद्रीय थकान सीएनएस में परिवर्तन पर जोर देती है, साथ ही साथ फलस्वरूप भावनात्मक/व्यवहार गड़बड़ी, अवसाद, चिंता, अनुभूति हानि, और स्मृति हानि भी शामिल है । एक अध्ययन से पता चलता है कि कई कारकों केंद्रीय थकान पैदा कर सकते हैं, जो बीच में अत्यधिक शारीरिक गतिविधि और मानसिक तनाव काफी अपरिहार्य है4। रोगजनन के लिए के रूप में, tryptophan-kynurenine मार्ग परिकल्पना5 जैसे सिद्धांतों कुछ रास्ते में परिवर्तन की व्याख्या; हालांकि, और अधिक में गहराई से अध्ययन अभी भी केंद्रीय थकान के केंद्रीय परिधीय सहसंबंध प्रकट करने के लिए आवश्यक हैं ।

केंद्रीय थकान के अंतर्निहित तंत्र के रूप में अभी भी स्पष्ट नहीं है, एक प्रभावी पशु मॉडल आगे अनुसंधान के लिए काफी महत्वपूर्ण है । मौजूदा थकान मॉडल ज्यादातर अत्यधिक व्यायाम द्वारा प्रेरित कर रहे हैं, ट्रेडमिल की तरह6 और वजन भरी तैराकी7, मानसिक कारकों पर थोड़ा चिंता के साथ । बेहतर केंद्रीय थकान के विकास अनुकरण करने के लिए, हमारे समूह MMPM के साथ एक चूहे मॉडल विकसित की है । मॉडलिंग की प्रक्रिया के दौरान, चूहों लंबे समय के लिए कई मंच बॉक्स में संकीर्ण प्लेटफार्मों पर खड़े रहते हैं सोने के वक्त का हिस्सा भी शामिल है । अत्यधिक व्यायाम मॉडल से अलग, MMPM मॉडल केंद्रीय थकान के जटिल रोगजनन के विचार में एक मानसिक कारक के रूप में आंशिक नींद अभाव का उपयोग करता है ।

मॉडल मूल्यांकन के लिए, हम बहुधा और EPM परीक्षण का उपयोग करने के लिए चिंता का मूड और स्वैच्छिक गतिविधि निर्धारित करते हैं । ES परीक्षण परिधीय मांसपेशियों के प्रदर्शन को मापने के लिए किया जाता है । इसके अलावा, हम चूहे के मस्तिष्क ले और दोनों hypothalamuses में डोपामाइन (डीए)/serotonin (5-एचटी) सामग्री का पता लगाने के लिए केंद्रीय न्यूरोट्रांसमीटर मतभेद का पालन.

प्रोटोकॉल नीचे प्रस्तुत मॉडल केंद्रीय थकान दोहराया शारीरिक गतिविधि और नींद की कमी से प्रेरित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, मानव जीवन में एक आम हालत नकल उतार । हालांकि, मॉडल अवधि का समायोजन करके, यह कई अन्य क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है, नींद अवलोकन और तनाव के अध्ययन में की तरह. भविष्य में अनुसंधान, हमें उंमीद है कि इस मॉडल में मदद मिलेगी और सीएनएस परिवर्तन और परिधीय प्रणाली के साथ उनके संबंध की खोज, केंद्रीय थकान के रोगजनन तंत्र प्रकट करने के लिए ।

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Protocol

सभी जानवरों के नैतिक उपयोग और प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल पर चीनी कानून द्वारा दिशा निर्देशों के अनुसार बनाए रखा गया था ।

1. प्री-मॉडलिंग तैयारी

  1. प्रयोगशाला तैयारी
    1. चलाएं यूवी दीपक प्रयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए ।
    2. 25 ± 3 डिग्री सेल्सियस पर प्रयोगशाला तापमान नियंत्रण, और 30% के आसपास सापेक्ष आर्द्रता ।
    3. 6:00 पर लैब लाइट चालू करें और इसे बंद 18:00 पर एक 12 ज/12 एच प्रकाश की स्थापना/
  2. एकाधिक प्लेटफ़ॉर्म बॉक्स निर्माण
    1. ११० × ६० × ४० सेमी3का एक कवर के बिना एक अपारदर्शी प्लास्टिक टैंक का निर्माण ।
    2. ठीक पंद्रह परिपत्र प्लेटफार्मों (एच = 8 सेमी, डी = ६.५ सेमी) टैंक है, जो आदेश के तीन पंक्तियों और पांच स्तंभों में वितरित के तल पर । प्रत्येक प्लेटफ़ॉर्म के बीच पर्याप्त रिक्ति छोड़ें, स्तंभों के बीच लगभग 10 सेमी और पंक्तियों के बीच 13 सेमी.
    3. टैंक के पार्श्व ओर एक पानी की दुकान सेट और एक नल स्थापित करें ।
    4. एक लोहे के तार एक खाना उस पर लटका बॉक्स के साथ टैंक के लिए जाल कवर करें ।
  3. समूह और आवास चूहों
    नोट: 8 सप्ताह पुराने के Wistar नर चूहों, लगभग २००-२१० ग्राम वजनी, प्रयोग में किया जाता है । चूहे मॉडलिंग की प्रक्रिया के दौरान समूहों में रहते हैं ।
    1. एक मार्कर पेन के साथ चूहों की पूंछ जड़ों संख्या ।
    2. चूहों तौलना, अत्यंत प्रकाश या भारी लोगों को बाहर, और मॉडल और नियंत्रण समूहों में बेतरतीब ढंग से बाकी विभाजित ।
    3. चूहों को धीरे से साफ पिंजरों में डाल दें और उन्हें acclimate करने के लिए लैब में कम से 3 दिन के लिए अनुमति दे । पर्याप्त पानी और भोजन की आपूर्ति प्रदान करें ।

2. MMPM के साथ मॉडलिंग

नोट: प्रक्रिया 18:00 पर शुरू होता है और 8:00 पर अगले दिन समाप्त होता है, के लिए कुल 14 घंटे प्रति दिन, पर 21 दिन । हस्तक्षेप कारकों से बचने के लिए एक ही व्यक्ति को पूरे प्रयोग का संचालन करना होता है, जबकि उसी लैब कोट को पहनना आवश्यक होता है । प्रयोग में 10 Wistar चूहों का प्रयोग किया जाता है ।

  1. एक सपाट सतह पर टैंक प्लेस, जैसे, मंजिल । फिर गर्म के लगभग 7 सेमी (25 ± 3 डिग्री सेल्सियस) पानी के साथ टैंक को भरने, फ्लैट मंच के नीचे करीब 1 सेमी ।
  2. 1 दिन के लिए टैंक में सभी चूहों के लिए पर्याप्त भोजन और पेय तैयार करें । खाने के डब्बे में चारा और पानी डाल कर उसे ढक पर लटका दें ।
    नोट: कुछ स्मार्ट चूहों को खाना बॉक्स पर आराम करना सीखो. यदि हां, तो उंहें वापस टैंक में ड्राइव ।
  3. मॉडल समूह चूहे पिंजरे से बाहर ले लो, उंहें पूंछ से हड़पने के लिए, और उंहें धीरे से टैंक में डाल दिया । पानी के प्रति अपने डर को प्रेरित करने के लिए सभी चूहों को प्लेटफार्मों के बजाय पानी में ही लांच करें । सुनिश्चित करें कि हर चूहे को एक मंच पर खड़ा हो जाता है, जबकि नियंत्रण समूह के चूहों पर्याप्त भोजन और पानी के साथ अपने मूल पिंजरों में रहते हैं ।
  4. टैंक कवर । आकस्मिक चोट से बचने के लिए चूहों पर नजर रखें । यदि एक चूहा मंच पर चढ़ाई के बिना अधिक से अधिक 1 ज के लिए पानी में रहता है, यह टैंक से बाहर लेने और इसे परीक्षण से हटा दें ।
  5. 14 घंटे के बाद, मॉडल चूहों टैंक से बाहर ले और एक ड्रायर के साथ अपने बाल सूख । चूहों की पूंछ को फिर से निशाना करें यदि यह फ़ेड करें । उनके मूल पिंजरों के लिए चूहों वापस और उन्हें पर्याप्त भोजन और पानी के साथ प्रदान करते हैं ।
  6. टैंक के हर कोने फ्लश । टैंक के एक तरफ तरक्की और नल खोलने के लिए सीवेज बहिर्वाह ।
  7. एक ७५% इथेनॉल स्प्रे के साथ टैंक निष्फल और यह यूवी प्रकाश को बेनकाब ।

3. मॉडल मूल्यांकन: व्यवहार टेस्ट

नोट: सभी परीक्षण व्यवहार प्रयोगशाला में प्रदर्शन कर रहे हैं । अशांति से बचने के लिए परीक्षण के दौरान शोर और अतिरिक्त प्रकाश की अनुमति नहीं है । यदि संभव हो, तो प्रत्येक परीक्षण का संचालन करने के लिए एक ही व्यक्ति (ओं) का उपयोग करें । एक काले कोट और दस्ताने छवि प्रसंस्करण में ग्रे पैमाने पर मांयता के लिए आवश्यक हैं । पहले के रूप में यह चूहे के व्यवहार पर सबसे कम प्रभाव पड़ता है अक्सर प्रदर्शन करते हैं ।

  1. बहुधा
    1. सुनिश्चित करें कि यह कार्यस्थान से ठीक से कनेक्टेड है और बॉक्स के प्रत्येक कोने को शामिल करने के लिए खोलें फ़ील्ड बॉक्स पर रिकॉर्डर की जांच करें । बॉक्स में छाया को समाप्त करने के लिए प्रकाश को समायोजित करें ।
    2. उनके मूल पिंजरों में व्यवहार प्रयोगशाला में चूहों हटो । उन्हें टेस्ट से पहले कम से acclimate 1 ज के लिए अनुमति दें ।
    3. स्वच्छ और ७५% इथेनॉल के साथ बॉक्स को साफ करने के लिए सुनिश्चित करें कि वहां कोई मलमूत्र या पिछले प्रयोग से छोड़ दिया गंध है ।
    4. अपनी पीठ से पिंजरे से एक चूहा निकालें और इसे धीरे बक्से के मध्य क्षेत्र में डाल दिया । जल्दी से बॉक्स से हथियारों की वापसी इतनी के रूप में गोली ब्लॉक नहीं है ।
    5. चूहे का नंबर इनपुट करें और रिकॉर्डिंग शुरू कर दें । गिनती और रियर और चढ़ाई सहित चूहे की ऊर्ध्वाधर गतिविधियों, की आवृत्ति रिकॉर्ड ।
    6. 5 मिनट के बाद, रिकॉर्डिंग बंद करो, चूहे बॉक्स से बाहर ले, और यह पिंजरे में वापस ।
    7. दोहराएं कदम 3.1.3-3.1.6 जब तक सभी चूहों परीक्षण समाप्त हो गया है ।
  2. Epm
    1. पूर्व जाँच करें और acclimation के रूप में बहुधा (चरण 3.1.1-3.1.2) के लिए चरणों का प्रदर्शन ।
    2. अपनी पीठ से पिंजरे से एक चूहा निकालें और यह दो हथियारों के जंक्शन भाग पर धीरे से डाल दिया । वाम खुले हाथ की ओर चूहा भूमि और जल्दी से छोड़ तो के रूप में गोली ब्लॉक नहीं है ।
    3. चूहे का नंबर इनपुट करें और रिकॉर्डिंग शुरू कर दें । गिनती और अलग हाथ प्रवेश द्वार की आवृत्ति रिकॉर्ड । चूहा परीक्षण में भूलभुलैया से गिरता है, तो इसे लेने के लिए और भूलभुलैया के लिए इसे वापस भेज. डेटा विश्लेषण के लिए विस्तृत जानकारी रिकॉर्ड है ।
    4. 5 मिनट के बाद, रिकॉर्डिंग बंद करो, चूहा बाहर ले, और यह पिंजरे में वापस ।
    5. मलमूत्र निकालें और ७५% इथेनॉल के साथ भूलभुलैया पोंछ करने के लिए पूर्व चूहे की गंध को खत्म ।
    6. दोहराएं कदम 3.2.2-3.2.5 जब तक सभी चूहों परीक्षण समाप्त हो गया है ।
  3. ES test
    1. गर्म (25 ± 3 डिग्री सेल्सियस) पानी की ८० सेमी के साथ तैराकी टैंक (७० × 30 × ११० सेमी3) भरें ।
      नोट: यदि टैंक में थर्मोस्टेट है, तो पानी का तापमान ३७ डिग्री सेल्सियस के आसपास सेट किया जाना चाहिए, जो चूहे के शरीर के तापमान के समान है । यदि नहीं, तो यह स्थिर रखने के लिए कमरे के तापमान के लिए सेट ।
    2. पिन गुच्छे के साथ प्रत्येक चूहे के लिए एक भार बनाओ और इसे धीरे से अपनी पूंछ जड़ पर टाई । लोड चूहे के वजन का 10% वजन ।
    3. पूंछ से एक चूहा पकड़ो और यह तैराकी टैंक में फेंक देते हैं । यदि चूहों huddle या दीवार से चिपके हुए, उंहें सेट के अलावा और उंहें पानी में वापस चलाओ ।
    4. समय जब चूहे पानी में डाल दिया है और समय रोक जब यह समाप्त हो गया है, जो पानी के मुंह और नाक से अधिक 10 एस के लिए पानी के नीचे के साथ संघर्ष करने की विफलता के रूप में प्रदर्शन किया है समय शुरू करो ।
      नोट: कई बार, थकावट और डूबने अचानक होते हैं । एक ही समय में पशु को रिकॉर्ड करने और सहेजने के लिए पर्याप्त experimenters सुनिश्चित करें ।
    5. दूसरों को दखल दिए बिना पानी से निकल चुक चूहों को बाहर निकालें । उनके बाल सूखी, फिर से उनकी संख्या के निशान, और उंहें पिंजरे में वापस भेजें ।
    6. एक समूह के खत्म होने के बाद टैंक में पानी बदल जाता है । सभी चूहों के बाद किया जाता है, स्विमिंग टैंक खाली है, और साफ और इथेनॉल और यूवी प्रकाश के साथ यह निष्फल ।

4. मॉडल मूल्यांकन: केंद्रीय न्यूरोट्रांसमीटर का पता लगाने

  1. Anesthetize 10% chloral हाइड्रेट के इंट्रा-पेरिटोनियल इंजेक्शन के साथ चूहा (3 मिलीलीटर/जब तक वह बेहोश न हो जाए ।
  2. चूहा Decapitate ।
  3. पोस्ट-औसत दर्जे का लाइन के साथ एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाओ, दोनों पक्षों के लिए cranium खुला है, और मस्तिष्क का पर्दाफाश । cranium पर मुड़ें, मस्तिष्क को हटाने, और एक आइस बैग पर मस्तिष्क डाल दिया ।
  4. अलग और hypothalamus है, जो मस्तिष्क के आधार के मध्य भाग में हीरे के आकार का क्षेत्र है कि आसपास के ऊतकों के साथ एक स्पष्ट सीमा है हटा दें । यह एक बाँझ ट्यूब में रखें और यह तरल नाइट्रोजन के साथ फ्रीज । एक-८० डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटर में सभी नमूनों की दुकान ।
  5. उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (HPLC)8का उपयोग कर hypothalamus में डीए और 5-एचटी की सामग्री का पता लगाने ।

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Representative Results

हम MMPM का उपयोग कर केंद्रीय थकान का एक चूहा मॉडल का वर्णन । 24 Wistar चूहों बेतरतीब ढंग से नियंत्रण समूह और मॉडल समूह में विभाजित कर रहे हैं, प्रत्येक समूह में 12 चूहों के साथ. मॉडल उपकरण नीचे (चित्रा 1) पर संकीर्ण प्लेटफार्मों के साथ एक पानी की टंकी के रूप में बनाया गया है । मॉडल चूहों प्रति दिन 14 घंटे के लिए प्लेटफार्मों पर खड़े, आंशिक नींद समय सहित, 21 दिनों के लिए (चित्रा 2) ।

चूहों में भावनात्मक और शारीरिक परिवर्तन का आकलन करने के लिए मॉडलिंग के बाद व्यवहार परीक्षण किए जाते हैं. बहुधा परिणाम (चित्र 3) से पता चलता है कि, नियंत्रण समूह (n = 10) की तुलना में, दोनों के पीछे के आंदोलन और स्वैच्छिक गतिविधि के औसत वेग में एक महत्वपूर्ण कमी है (p < 0.05, p < 0.01) मॉडल चूहों में (n = 10), और एक बाहर की अंगूठी प्रवेश के विलंबता में स्पष्ट वृद्धि (पी < 0.01) । EPM टेस्ट (चित्रा 4) से पता चलता है कि मॉडलिंग के 21 दिनों ओपन आर्म प्रविष्टियों की दोनों आवृत्ति में कमी आई और खुले हाथ में अवधि काफी नियंत्रण समूह (n = 10) (p < 0.05, p < 0.01) की तुलना में घटी, जबकि दोनों में वृद्धि हुई थी बंद बांह प्रविष्टियों की आवृत्ति और करीबी बांह में अवधि (p < 0.05) । ES test (figure 5) के परिणाम से पता चलता है कि मॉडल समूह (n = 10) की तैराकी अवधि नियंत्रण समूह (n = 10) (p < 0.001) की तुलना में काफी कम है ।

अगला, हम दा और 5 दोनों hypothalamuses में एचटी सामग्री का पता लगाने के लिए केंद्रीय न्यूरोट्रांसमीटर मतभेदों का निरीक्षण । परिणाम (चित्रा 6) बताते हैं कि hypothalamus में डीए और 5-एचटी को डीए का अनुपात काफी कम हो जाता है मॉडल समूह (n = 10) की तुलना में नियंत्रण समूह (n = 10) (p < 0.05, p < 0.01), जबकि 5-एचटी सामग्री बढ़ जाती है उल्लेखनीयतया (p < 0.05) ।

Figure 1
चित्र 1: एकाधिक प्लेटफ़ॉर्म बॉक्स की योजनाबद्ध । (A) सामने वाला दृश्य । (ख) शीर्ष दृश्य । एकाधिक मंच बॉक्स एक कवर प्लास्टिक की टंकी (११० × ६० × ४० सेमी3) पंद्रह एक्रिलिक प्लेटफार्मों के साथ नीचे और पार्श्व ओर एक नल पर तय की है । प्रत्येक मंच स्तंभ शीर्ष से बड़ा एक स्तंभ और एक परिपत्र फ्लैट (डी = ६.५ सेमी) मंच के होते हैं । प्लेटफार्मों (एच = 8 सेमी) तीन पंक्तियों और पांच कॉलम में वितरित । आसंन प्लेटफार्मों कॉलम और पंक्तियों में 13 सेमी में अलग से 10 सेमी हैं । टैंक अधिकतम 15 चूहे पकड़ कर सकते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: मॉडलिंग की एक तस्वीर । प्लेटफॉर्म पर खड़ा चूहा मॉडलिंग के 15वें दिन पर था । इसके शुष्क बाल और मंद आंखें एक स्पष्ट थकान राज्य का सुझाव है ।

Figure 3
चित्रा 3: बहुधा का विश्लेषण । (क) ऊर्ध्वाधर गतिविधियों की आवृत्ति की तुलना । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (n = 10) । असमान प्रसरण (F = ९.८७७, p = ०.००६ < 0.05) के साथ, महत्व स्वतंत्र-नमूना t-परीक्षण, t = २.२२६, p = ०.०४९ < 0.05 द्वारा निर्धारित किया गया था । ऊर्ध्वाधर गतिविधि की आवृत्ति (पालन) मॉडल चूहों में कम हो जाती है (n = 10) नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में (n = 10). (ख) स्वैच्छिक कार्यकलाप के औसत वेग पर एक तुलना. डेटा माध्य ± IQR (n = 10) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । महत्व मान द्वारा निर्धारित किया गया था-Whitney यू टेस्ट, जेड =-२.६८५, पी = ०.००७ < 0.01. मॉडल चूहों में स्वैच्छिक गतिविधि का औसत वेग नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में कम हो जाती है. (ग) बाहर की अंगूठी प्रवेश द्वार के विलंबता पर तुलना । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (n = 10) । असमान प्रसरण (F = ५.७४८, p = ०.०२८ < 0.05) के साथ, महत्व t-test, t =-३.७२४, p = ०.०३ < 0.01 द्वारा निर्धारित किया गया था । मॉडल चूहों, जिसका अर्थ है कि वे बाहर की अंगूठी में प्रवेश करने से पहले चूहों पर नियंत्रण की तुलना में अधिक समय बिताने में बाहर की अंगूठी प्रवेश द्वार बढ़ जाती है की विलंबता । नोट: p< 0.05 (*); p <०.०१ (* *); p < 0.001 (* * *) ।

Figure 4
चित्रा 4: EPM टेस्ट का विश्लेषण । (A) ओपन आर्म प्रविष्टियों की आवृत्ति पर तुलना. डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (n = 10) । बराबर प्रसरण (F = ०.९८२, p = ०.३४८ > 0.05) के साथ, महत्व t-test, t = २.७१०, p = ०.०१४ < 0.05 द्वारा निर्धारित किया गया था । मॉडल चूहों में ओपन आर्म प्रविष्टियों की आवृत्ति (n = 10) नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में कम हो जाती है (n = 10). (ख) खुले हाथ में अवधि की तुलना में । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (n = 10) । बराबर प्रसरण (F = ०.१००, p = ०.७५५ > 0.05) के साथ, महत्व t-test, t = ३.३०४, p = ०.००४ < 0.01 द्वारा निर्धारित किया गया था । मॉडल चूहों में खुले हाथ अवधि नियंत्रण चूहों, जिसका मतलब मॉडल चूहों खुले हाथ में कम समय बिताने के साथ तुलना में घट जाती है । (ग) बंद बांह प्रविष्टियों की आवृत्ति पर तुलना । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (n = 10) । बराबर प्रसरण (F = ०.१४१, p = ०.७१२ > 0.05) के साथ, महत्व t-test, t =-२.४६६, p = ०.०२४ < 0.05 द्वारा निर्धारित किया गया था । मॉडल चूहों में करीबी बांह प्रविष्टियों की आवृत्ति नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में बढ़ जाती है. (घ) करीबी बांह में अवधि पर तुलना. डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (n = 10) । असमान प्रसरण (F = ४.७९६, p = ०.०४२ < 0.05) के साथ, महत्व t-test, t =-२.७३६, p = ०.००१६ < 0.05 द्वारा निर्धारित किया गया था । मॉडल चूहों में बंद बांह की अवधि नियंत्रण चूहों, जिसका मतलब है मॉडल चूहों बंद बांह में अधिक समय बिताने के साथ तुलना में बढ़ जाती है । नोट: p < 0.05 (*); p <०.०१ (* *); p < 0.001 (* * *) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: संपूर्ण तैराकी परीक्षण का विश्लेषण । डेटा माध्य ± IQR (n = 10) के रूप में प्रस्तुत किया गया है, और p < 0.05 (*) , p < 0.01 (* *) , p < 0.001 (* * *) के रूप में रिपोर्ट की गई है । महत्व मान द्वारा निर्धारित किया गया था-Whitney यू टेस्ट, जेड =-३.३२६, पी = ०.००१ । मॉडल चूहों (n = 10) के तैराकी समय काफी नियंत्रण चूहों (n = 10) की तुलना में कम है ।

Figure 6
चित्रा 6: केंद्रीय न्यूरोट्रांसमीटर सामग्री का विश्लेषण. (क) डीए की सामग्री पर तुलना । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (n = 10) । बराबर प्रसरण (F = ०.०८८, p = ०.७७१ > 0.05) के साथ, महत्व t-test, t = ३.७१७, p = ०.००२ < 0.01 द्वारा निर्धारित किया गया था । दोनों hypothalamuses में दा सामग्री मॉडल चूहों में कम हो जाती है (n = 10), नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में (n = 10). (ख) 5-एचटी सामग्री पर तुलना । डेटा मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे है (n = 10) । असमान प्रसरण (F = ५.२८२, p = ०.०३४ < 0.05) के साथ, महत्व t-test, t =-२.९९७, p = ०.०१२ < 0.05 द्वारा निर्धारित किया गया था । दोनों hypothalamuses में 5-एचटी कंटेंट, कंट्रोल चूहों की तुलना में मॉडल चूहों में कम हो जाता है । (ग) अनुपात की तुलना । डेटा माध्य ± IQR (n = 10) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । महत्व मान द्वारा निर्धारित किया गया था-Whitney यू टेस्ट, जेड =-३.१७५, पी = ०.००१ । 5-एचटी के लिए दा का अनुपात काफी मॉडल चूहों में कम हो जाती है, नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में. नोट: p < 0.05 (*); p <०.०१ (* *); p < 0.001 (* * *) ।

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Discussion

MMPM मूल रूप से सोने के अभाव9के लिए डिज़ाइन किया गया है । चूहों नीचे पर तय प्लेटफार्मों के साथ एक पानी की टंकी में शुरू कर रहे हैं । पानी के सहज भय से चालित, चूहे प्लेटफार्मों पर खड़े रहते हैं और कोई नींद नहीं आती. अध्ययन से पता चलता है कि नींद अभाव के विभिंन घंटे चूहे व्यवहार और मांयता हानि10, नकारात्मक भावनाओं11, और केंद्रीय थकान सहित मूड, में विभिंन परिवर्तनों के लिए सीसा । कुछ शोधकर्ताओं ने एक मंच विधि (एसपीएम) के साथ पुरानी नींद अभाव साबित होता है केंद्रीय थकान पैदा कर सकते हैं, मांयता हानि और सामाजिक विकारों12के साथ । अंय अनुसंधान से पता चलता है कि लगातार दिनों पर आंतरायिक अभाव भावनात्मक विकारों और केंद्रीय थकान, जो13endorphins के साथ इलाज किया जा सकता है पैदा कर सकता है । हमारे पिछले अध्ययन साबित होता है कि 5 दिन और 14 दिनों के साथ तुलना में, 21 दिनों के अभाव अधिक केंद्रीय थकान के बजाय तनाव से संबंधित भावना विकारों14लाती है । MMPM के कई कारकों केंद्रीय थकान, खड़े, संकीर्ण आश्रय स्थान, थकाऊ और दोहराया पर्यावरण, साथ ही साथ सोने की कमी के लंबे समय सहित कारण हो सकता है । नींद अभाव और केंद्रीय थकान के बीच अंतर्निहित सहसंबंध हाइपोथैलेमस के साथ संबद्ध कर सकते हैं-पिट्यूटरी-अधिवृक्क (HPA) विभिन्न स्तरों में अक्ष, जो बीच में monoamine न्यूरोट्रांसमीटर परिवर्तन एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है.

इस प्रोटोकॉल में, हम MMPM का उपयोग कर एक केंद्रीय थकान मॉडल विकसित और व्यवहार परीक्षण और न्यूरोट्रांसमीटर का पता लगाने के साथ यह आकलन. सबसे पहले, हम Wistar चूहे की प्राकृतिक circadian लय की नकल करने के लिए लैब में 12 एच/12 एच प्रकाश/अंधेरे चक्र (6:00-18:00) बनाने, जिसका औसत नींद समय १२.६ एच, लगभग २.४-४.२ घंटे रात में है, और दिन में ८.२-९.६ एच15। तो मॉडल चूहों एकाधिक मंच बॉक्स में डाल रहे है प्रति दिन 14 घंटे के लिए (18:00-8:00) लगातार 21 दिनों के लिए, एक नियंत्रण समूह के साथ इसके विपरीत के लिए सेट । प्रयोग के अंत में, मॉडल समूह में चूहों सुस्त बाल, बेहोश पूंछ रंग, मंद आंखें, और पिंजरे में कमी गतिविधि सहित एक स्पष्ट थकान उपस्थिति, दिखा ।

व्यवहार परीक्षणों के परिणाम शारीरिक और भावनात्मक दोनों पहलुओं में बदलाव दिखाते हैं । अक्सर व्यापक रूप से कुतर मॉडल मूल्यांकन में प्रयोग किया जाता है अंवेषण व्यवहार और स्वैच्छिक गतिविधि16का मूल्यांकन । कुतर thigmotaxis की वृत्ति है, कि है, एक बार वे एक खुले मैदान में डाल रहे हैं, वे दीवार के पास बाहर की अंगूठी में जल्दी से स्थानांतरित करने के लिए करते हैं । एक ही समय में, वे नए वातावरण के बारे में उत्सुक है और दोनों ऊर्ध्वाधर पालन और क्षैतिज आंदोलनों द्वारा केंद्रीय क्षेत्र का पता लगाने के लिए उत्सुक हैं । दोनों की प्रेरणाओं का संघर्ष चिंता का मिजाज17को दर्शाता है । बहुधा के परिणाम से पता चलता है उनके कम औसत वेग के आधार पर मॉडल चूहों में स्वैच्छिक गतिविधि अस्वीकृत । इसके अतिरिक्त, मॉडल चूहों में पालन की आवृत्ति काफी नियंत्रण चूहों की तुलना में कम हो जाती है, जो चिंता भावना का संकेत हो सकता है. इसके अलावा, मॉडल चूहों को अंवेषण में कोई स्पष्ट वरीयता के साथ बाहर की अंगूठी में प्रवेश करने से पहले अधिक समय बिताना, मॉडल चूहों में स्थानिक अनुभूति विकार का सुझाव देते हैं । EPM परीक्षण चिंता का आकलन करने के लिए एक शास्त्रीय परीक्षण है । चिंता के साथ चूहों के लिए सुरक्षा के लिए बंद बांह में रहने के बजाय खुले हाथ18की खोज करते हैं । परिणाम से पता चलता है कि नियंत्रण चूहों के साथ तुलना में, मॉडल चूहों के पास हथियार और खुले बाहों में कम समय में अधिक समय खर्च करते हैं, और यह विभिन्न हथियारों के प्रवेश आवृत्ति समानताएं, और समग्र मॉडल चूहों में चिंता मूड की पुष्टि. ES परीक्षण में, मॉडल चूहों की तैराकी अवधि के नियंत्रण चूहों की तुलना में बहुत कम है, खराब मांसपेशी प्रदर्शन थकान की वजह से सुझाव. अंत में, चिंता, अनुभूति हानि, गरीब मांसपेशी प्रदर्शन, और सीमित स्वैच्छिक गतिविधि मॉडल चूहों में दिखाई देते हैं, सभी केंद्रीय थकान का संकेत है ।

सीएनएस के लिए के रूप में, केंद्रीय न्यूरोट्रांसमीटर में सभी परिवर्तन केंद्रीय थकान का सुझाव. हम दा सामग्री में एक महत्वपूर्ण कमी और 5 में वृद्धि-hypothalamus के एचटी पाते हैं । 5-एचटी एमिनो एसिड tryptophan (टीआरपी) से संश्लेषित एक monoamine न्यूरोट्रांसमीटर है । तीव्र गतिविधि 5-एचटी पीढ़ी को रक्त में अधिक मुक्त टीआरपी जारी करके वृद्धि होगी; वापसी में संचित 5-एचटी, लोको-मोटर प्रणाली के मध्य नियंत्रण को नियंत्रित करती है, जो कि19porformance गरीब मांसपेशी के लिए अग्रणी है । दा एक उत्तेजित न्यूरोट्रांसमीटर है, जो लोको मोटर गतिविधि की शुरुआत में बढ़ जाती है और20थकान की उपस्थिति से गिरता है. दा और 5-एचटी सहसंबंधी और एक उत्तेजना-अवरोध प्रणाली है कि लोको मोटर प्रणाली21के केंद्रीय नियंत्रण प्रभाव के रूप में बातचीत । इस प्रकार 5-एचटी को मंहगाई के अनुपात में गिराना केंद्रीय थकान का अहम संकेतक है ।

वहां प्रोटोकॉल है कि सफलता के लिए महत्वपूर्ण है में कुछ नोट कर रहे हैं । सबसे पहले, मॉडल अवधि और शर्तों पुरुष Wistar चूहों के साथ परीक्षण कर रहे हैं । तापमान वरीयता और नींद की अवधि उपभेदों और लिंग14के बीच अलग है । दूसरे, चूहों समूहों में रहना चाहिए, एक पिंजरे में सबसे अधिक 6 चूहों के साथ, और प्रयोग भर में पर्याप्त भोजन और पानी के साथ प्रदान की । मॉडलिंग के पहले दो हफ्तों के दौरान चूहे काफी चिढ़ते हैं और टैंक में और पिंजरों में दोनों आपस में झगड़ा कर सकते हैं । इनकी निगरानी रखें और घायल चूहों को मौत से बचाएं । इसके अलावा, चूहों के बालों को सूखने के बाद उन्हें टैंक से निकाल दिया जाए, खासकर सर्दियों में ठंड की स्थिति से बचने के लिए याद रखें ।

हालांकि मॉडल केंद्रीय थकान के लिए बनाया गया है, यह जटिल कारकों को जोड़ने के लिए अपने उपयोग में इजाफा संभव है । उदाहरण के लिए, हम कंपन मोटर्स स्थापित करें और समुद्र में लहरों की नकल और एक नेविगेशन थकान मॉडल स्थापित करने की कोशिश में अभाव पैटर्न को बदलने के लिए मंच के लिए स्प्रिंग्स । मॉडल अवधि समायोजित करके, यह कई अंय क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है । एक पशु मॉडल के अध्ययन के रूप में, अनुसंधान अपनी सीमा है । सबसे पहले, मॉडल की भविष्यवाणी वैधता में कोई सबूत नहीं है । भविष्य के अध्ययन में, हम चूहों पर विरोधी थकान उपचार प्रदर्शन और उनके वसूली का आकलन करने के लिए मॉडल की वैधता साबित करना चाहिए । इसके अलावा, मॉडल का वर्तमान मूल्यांकन नकारात्मक भावना और सीएनएस परिवर्तन पर अधिक ध्यान केंद्रित करता है; हालांकि, केंद्रीय थकान भी एक सीखने की कठिनाई और सामाजिक परिहार12के रूप में प्रकट होता है । मॉरिस पानी भूलभुलैया और सामाजिक संपर्क परीक्षण की तरह व्यवहार परीक्षण भविष्य में आयोजित किया जा सकता है रोग का एक और अधिक व्यापक समझ प्राप्त करते हैं । हमें उंमीद है कि केंद्रीय थकान मॉडल यहां शुरू की केंद्रीय थकान के रोग तंत्र का पता लगाने में मदद कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था बीजिंग (No. 7162124), और Xin-ए. ए. बीजिंग विश्वविद्यालय चीनी चिकित्सा के लिए फाउंडेशन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
multiple platform sleep deprivation water tank Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine 110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high
Wistar rats Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company license number SYXK (Beijing) 2016-0011 Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g)
Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph  Agilent  G1379A, G1311A, G1313A , G1316A   G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box
DECADE II SDC electrochemical detector Dutch ANTEC company glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS)
Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge HERAEUS
VCX130 ultrasonic fracturing instrument SONICS
ACS-ZEAS electronic scale Phos technology development, Beijing. The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g.
Open Field Box Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine wooden box of open field  100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median.
Elevated Plus-maze Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD. The open arms and close  arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high.
rat swimming bucket. Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China. The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats.
Thermometer Shiya instrument co., LTD., changzhou,China. Control water temperature
Small water pump Xincheng technology co., LTD., chengdu,China. Used for water tank and swimming behavior.
Ethovition3.0 behavioral software. Nuldus,Netherlands Measurement analysis of rat behavior videos.

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तंत्रिका विज्ञान मुद्दा १३८ संशोधित एकाधिक मंच विधि (MMPM) चूहा मॉडल केंद्रीय थकान व्यवहार परीक्षण
केंद्रीय थकान का एक चूहा मॉडल एक संशोधित एकाधिक प्लेटफ़ॉर्म विधि का उपयोग
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Zhang, W., Zhang, W., Dai, N., Han,… More

Zhang, W., Zhang, W., Dai, N., Han, C., Wu, F., Wang, X., Tan, L., Li, J., Li, F., Ren, Q. A Rat Model of Central Fatigue Using a Modified Multiple Platform Method. J. Vis. Exp. (138), e57362, doi:10.3791/57362 (2018).

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