Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um einem Rattenmodell der zentralen Ermüdung unter Verwendung der modifizierten vorstellen mehrere Plattform Methode (MMPM).
Abstract
In diesem Artikel vorgestellt wir einem Rattenmodell der zentralen Ermüdung unter Verwendung der modifizierten mehrere Plattform Methode (MMPM). Feld mehrere Plattform wurde als ein Wassertank mit engen Plattformen auf der Unterseite entworfen. Die Modell-Ratten wurden in den Tank setzen und Stand auf den Plattformen für 14 h (18:00-08:00) pro Tag für 21 Tage, mit einer leeren Kontrollgruppe für Kontrast gesetzt. Am Ende der Modellierung zeigten Ratten in der Modellgruppe ein offensichtlich müde aussehen. Um das Modell zu beurteilen, haben wir mehrere Verhaltens Tests durchgeführt, einschließlich das Freiland testen (OFT), die erhöhte plus Labyrinth (EPM)-Test und die erschöpfende Schwimmtest (ES). Die Ergebnisse zeigten, dass Angst, raumkognition Beeinträchtigung, Armen Muskelleistung und abgelehnte Freiwilligentätigkeit im Modell Ratten präsentiert die Diagnose der zentralen Ermüdung zu bestätigen. Änderungen der zentralen Neurotransmitter überprüft auch das Ergebnis. Abschließend das Modell erfolgreich simuliert zentrale Ermüdung und Zukunftsstudie mit dem Modell kann helfen, den Pathomechanismus der Krankheit zeigen.
Introduction
Müdigkeit ist einer der wichtigsten Faktoren, die die menschliche Gesundheit1bedrohen. In den vergangenen Jahrzehnten haben verschiedene Untersuchungen bewiesen, dass die Ermüdung peripher ausgelöst, sondern zentral gesteuert und immer begleitet mit emotionaler und kognitiver Störungen ist. Italienischer Physiologe A. Mosso schlug zuerst das Wort zentrale Ermüdung2. Es wird allgemein als begrenzte ehrenamtliche Tätigkeit und Kognition Beeinträchtigung durch Dysfunktion des Impuls-Übertragung in das zentrale Nervensystem (ZNS)3definiert. Verglichen mit peripheren Muskelermüdung, betont die zentrale Ermüdung Veränderungen im ZNS, als auch die daraus resultierende emotionale/Verhaltensstörungen, einschließlich Depression, Angst, Beeinträchtigung der Kognition und Gedächtnisverlust. Eine Studie zeigt, dass viele Faktoren zentrale Müdigkeit hervorrufen können, unter denen übermäßige körperliche Aktivität und psychischen Stress ganz unverzichtbar4sind. Für die Pathogenese erklären Theorien wie die Tryptophan-Kynurenin Weg Hypothese5 Änderungen in bestimmte Bahnen; Weitere vertiefende Studien sind jedoch immer noch erforderlich, die zentral-periphere Zusammenhänge der zentralen Ermüdung zu offenbaren.
Da der zugrunde liegende Mechanismus der zentralen Ermüdung noch unklar ist, ist ein effektives Tiermodell sehr wichtig für die weitere Forschung. Die vorhandene Müdigkeit-Modelle sind meist durch übermäßige Bewegung, wie Laufbänder6 und Gewicht Beladen Schwimmen7, mit wenig Sorge auf psychische Faktoren induziert. Um die Entwicklung der zentralen Ermüdung besser zu simulieren, hat unsere Gruppe einem Rattenmodell mit der MMPM entwickelt. Während des Modellierungsprozesses bleiben Ratten für lange Stunden, einschließlich eines Teils der Schlafzeit auf den schmalen Plattformen im Feld mehrere Plattform stehen. Anders als übermäßige Bewegung Modelle, verwendet das MMPM Modell partiellen Schlafentzug als ein geistiger Faktor unter Berücksichtigung der komplexen Pathogenese der zentralen Ermüdung.
Für Modellevaluierung verwenden wir die Tests OFT und EPM, um Angst Stimmung und ehrenamtliche Tätigkeit zu bestimmen. Der ES-Test wird durchgeführt, um die peripheren Muskelleistung messen. Darüber hinaus wir nehmen die Ratte Gehirn und Dopamin (DA) zu erkennen / Serotonin (5-HT) Inhalt in beiden Hypothalamuses, die zentrale Neurotransmitter Unterschiede zu beobachten.
Die unten dargestellte Protokoll soll Modell zentrale Ermüdung induziert durch wiederholte körperliche Aktivität und Mangel an Schlaf, imitiert eine häufige Erkrankung im menschlichen Leben. Jedoch kann durch Anpassung der Modell-Dauer, es in vielen anderen Bereichen, wie im Schlaf Beobachtung und Stress-Studien verwendet werden. In Zukunft Forschung, hoffen wir, dass dieses Modell mehr CNS Änderungen und deren Verbindung mit dem peripheren System hilft, um den Mechanismus der Pathogenese der zentralen Ermüdung zu offenbaren zu entdecken.
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Protocol
Alle Tiere wurden nach den Richtlinien von der chinesischen Gesetzgebung über die ethische Verwendung und Pflege von Versuchstieren beibehalten.
1. Pre-Modellierung-Vorbereitung
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Labor-Vorbereitung
- Führen Sie die UV-Lampe für mindestens 30 min vor dem Experiment.
- Die Lab-Temperatur bei 25 ± 3 ° C und die Relative Luftfeuchtigkeit ca. 30 % Steuern.
- Das Labor Licht am 06:00 schalten Sie und schalten Sie ihn aus, um 18:00, einen 12 h/12 h Hell/Dunkel-Zyklus zu etablieren.
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Mehreren Plattform Kastenkonstruktion
- Konstruieren Sie eine undurchsichtige Kunststofftank ohne Abdeckung von 110 × 60 × 40 cm3.
- Fünfzehn kreisförmige Plattformen zu beheben (h = 8 cm, d = 6,5 cm) auf der Unterseite des Tanks, welche ordentlich in drei Zeilen und 5 Spalten verteilen. Lassen Sie genügend Platz zwischen jeder Plattform, etwa 10 cm zwischen Spalten und 13 cm zwischen den Reihen.
- Legen Sie einen Wasseraustritt an der lateralen Seite des Tanks und installieren Sie einen Wasserhahn zu.
- Machen Sie ein Eisen-Maschendraht-Cover für den Tank mit einer Lebensmittel-Box hängen.
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Gruppierung und Gehäuse Ratten
Hinweis: Männliche Wistar Ratten 8 Wochen alt, mit einem Gewicht von ca. 200-210 g werden im Experiment verwendet. Die Ratten Leben in Gruppen während des Modellierungsprozesses.- Nummerieren Sie die Ratten Schweif Wurzeln mit einem Filzstift.
- Wiegen Sie die Ratten, schließen Sie die extrem leichte oder schwere aus und teilen Sie den Rest nach dem Zufallsprinzip in das Modell und Kontrollgruppen.
- Legte die Ratten sanft in die saubere Käfige und es ihnen ermöglichen, an das Labor für mindestens 3 Tage akklimatisieren. Stellen Sie ausreichend Wasser und Verpflegung.
2. Modellierung mit MMPM
Hinweis: Der Prozess beginnt um 18:00 und endet um 08:00 am nächsten Tag, für eine Gesamtmenge von 14 h pro Tag, über 21 Tage. Zur Vermeidung von Störfaktoren ist die gleiche Person erforderlich, um das gesamte Experiment während des Tragens der gleichen Laborkittel durchzuführen. Im Experiment werden 10 Wistar-Ratten verwendet.
- Platzieren Sie den Tank auf einer flachen Oberfläche, z. B., der Boden. Dann füllen Sie den Tank mit ca. 7 cm von Warmwasser (25 ± 3 ° C) ca. 1 cm unterhalb der flachen Plattform.
- Bereiten Sie genug Essen und trinken für alle Ratten im Tank für 1 Tag. Futter und Wasser in der Lebensmittel-Box und hängen Sie es auf dem Cover.
Hinweis: Einige intelligente Ratten lernen, auf die Lebensmittel-Box zu ruhen. Wenn ja, fahren sie zurück in den Tank. - Die Model Gruppe Ratten aus dem Käfig nehmen, greifen sie am Schwanz und legte sie sanft in den Tank. Die Ratten im Wasser anstelle von den Plattformen zu motivieren, ihre Angst vor dem Wasser zu starten. Stellen Sie sicher, dass jede Ratte eine Plattform bekommt auf, zu stehen, während Ratten der Kontrollgruppe in ihren ursprünglichen Käfigen mit ausreichend Nahrung und Wasser bleiben.
- Decken Sie den Tank. Überwachen Sie die Ratten um Verletzungen zu vermeiden. Wenn eine Ratte im Wasser für mehr als 1 h bleibt ohne Klettern auf der Plattform, wählen Sie es aus dem Tank und entfernen Sie sie aus dem Test.
- Nehmen Sie ab 14 Uhr die Modell-Ratten aus dem Tank und trocknen Sie ihre Haare mit einem Trockner. Neu markieren Sie die Ratten Schwänzen wenn es verblasst. Zurückkehren Sie die Ratten zu ihren ursprünglichen Käfigen und Ihnen Sie ausreichend Nahrung und Wasser.
- Spülen Sie jede Ecke des Tanks. Heben Sie eine Seite des Tanks zu und öffnen Sie den Wasserhahn, um das Abwasser Abfluss.
- Den Tank mit einem 75 % Ethanol Spray zu sterilisieren und das UV-Licht aussetzen.
3. Modell: Behavioral Feststellungsprüfung
Hinweis: Alle Tests werden in der Verhaltenstherapie Labor durchgeführt. Zusätzliches Licht und Lärm während der Prüfung dürfen nicht um Störungen zu vermeiden. Verwenden Sie nach Möglichkeit die gleichen Personen, jeder Test durchzuführen. Einen dunklen Mantel und Handschuhe sind Voraussetzung für die Anerkennung der Graustufen in der Bildverarbeitung. Führen Sie das OFT zuerst, da es die geringsten Auswirkungen auf Ratte Verhalten hat.
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OFT
- Überprüfen Sie den Recorder über offenes Feld um sicherzustellen, dass es ordnungsgemäß an die Workstation angeschlossen und deckt jede Ecke des Feldes. Passen Sie die Beleuchtung um Schatten im Feld zu beseitigen.
- Verschieben Sie die Ratten in behavioral Labor in ihren ursprünglichen Käfigen. Lassen sie für mindestens 1 h vor dem Test zu akklimatisieren.
- Reinigen Sie und Desinfizieren Sie die Box mit 75 % Ethanol um sicherzustellen, dass es keinen Kot oder Geruch aus früheren Experiment verließ.
- Entfernen Sie eine Ratte aus dem Käfig, indem den Rücken und legen Sie es sanft in den zentralen Bereich des Feldes. Schnell ziehen Arme aus Feld, nicht um die Aufnahme zu blockieren.
- Geben Sie die Nummer der Ratte und Aufnahme starten. Zählen Sie und erfassen Sie die Häufigkeit der Ratte vertikale Aktivitäten, einschließlich der Aufzucht und Klettern.
- Beenden Sie nach 5 min die Aufnahme, die Ratte aus der Verpackung nehmen und in den Käfig zurück.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.1.3 - 3.1.6, bis die Ratten den Test beendet haben.
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EPM
- Der Pre-Check und Akklimatisierung Schritte wie bei dem OFT (Schritte 3.1.1 - 3.1.2).
- Eine Ratte aus dem Käfig entfernen, indem den Rücken und legte sie sanft auf die Kreuzung der beiden Arme. Die Ratte in Richtung der linken offenen Arm landen und lassen Sie schnell um die Aufnahme zu blockieren.
- Geben Sie die Nummer der Ratte und Aufnahme starten. Zählen Sie und erfassen Sie die Häufigkeit der verschiedenen Arm-Eingänge. Sinkt die Ratte aus dem Labyrinth im Test, holen Sie es und senden Sie es an das Labyrinth zurück. Detaillierte Informationen zur Datenanalyse.
- Beenden Sie nach 5 min die Aufnahme, die Ratte heraus zu nehmen und in den Käfig zurück.
- Entfernen Sie die Exkremente und wischen Sie das Labyrinth mit 75 % Ethanol, die ehemalige Ratte Geruch zu beseitigen.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.2 - 3.2.5 bis die Ratten den Test beendet haben.
-
ES test
- Füllen Sie den Swimming Tank (70 × 30 × 110 cm3) mit 80 cm Warmwasser (25 ± 3 ° C).
Hinweis: Ist ein Thermostat im Tank, sollte die Wassertemperatur ca. 37 ° C, festgelegt werden, die Ratte Körpertemperatur ähnelt. Ist dies nicht der Fall, setzen Sie ihn auf Zimmertemperatur, es konstant zu halten. - Stellen eine Belastung für jede Ratte mit Pin Trauben und binden Sie es sanft auf seine Rute Wurzel. Die Last wiegt 10 % des Gewichts der Ratte.
- Greifen Sie eine Ratte am Schwanz zu und werfen Sie es in den Tank schwimmen. Wenn die Ratten drängen oder Klammern sich an die Wand, auseinander gesetzt und fahren sie zurück ins Wasser.
- Starten der Zeitmessung im Moment wenn die Ratte ist ins Wasser und Stop timing, wenn er erschöpft ist, beweist die als Misserfolg zu kämpfen, aus Wasser mit dem Mund und Nase unter dem Wasser für mehr als 10 s.
Hinweis: Manchmal, Erschöpfung und ertrinken plötzlich auftreten. Achten Sie darauf, genügend Experimentatoren, aufnehmen und speichern das Tier zur gleichen Zeit haben. - Entfernen Sie die erschöpften Ratten aus dem Wasser ohne andere zu unterbrechen. Trocknen Sie ihre Haare wieder markieren Sie ihre Zahlen und schicken sie zurück zum Käfig.
- Wechseln Sie das Wasser im Tank, nachdem eine Gruppe beendet wurde. Nachdem die Ratten fertig sind, leeren Sie den Tank Schwimmen und sauber und mit Ethanol und UV-Licht sterilisiert.
- Füllen Sie den Swimming Tank (70 × 30 × 110 cm3) mit 80 cm Warmwasser (25 ± 3 ° C).
4. Modell Bewertung: Zentrale Neurotransmitter Erkennung
- Betäuben Sie die Ratte mit Intra peritoneale Injektion von 10 % Chloral Hydrate (3 mL/kg), bis sie bewusstlos ist.
- Die Ratte zu enthaupten.
- Eine longitudinale Einschnitt entlang der Post-mediale, der Schädel beidseitig zu öffnen und aussetzen des Gehirns. Umdrehen Sie der Schädel, entfernen Sie das Gehirn zu und setzen Sie das Gehirn auf einen Eisbeutel.
- Trennen Sie und entfernen Sie den Hypothalamus, die rautenförmigen Bereich im zentralen Teil der Basis des Gehirns, die eine klare Grenze mit umgebenden Gewebe hat. Legen Sie sie in ein steriles Röhrchen und fixieren Sie sie mit flüssigem Stickstoff. Alle Proben im Kühlschrank-80 ° C aufbewahren.
- Erkennen Sie den Inhalt der DA und 5-HT im Hypothalamus mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)8.
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Representative Results
Wir beschreiben einem Rattenmodell der zentralen Ermüdung mit MMPM. 24 Wistar-Ratten sind zufällig in der Kontrollgruppe und der Modellgruppe mit 12 Ratten in den einzelnen Gruppen unterteilt. Das Modell Gerät dient als ein Wassertank mit engen Plattformen auf der Unterseite (Abbildung 1). Modell Ratten stehen auf den Plattformen für 14 h pro Tag, inklusive teilweise Schlafzeit, für 21 Tage (Abbildung 2).
Verhaltensstörungen werden nach der Modellierung zu beurteilen, die emotionalen und körperlichen Veränderungen bei den Ratten durchgeführt. Das OFT Ergebnis (Abbildung 3) zeigt, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe (n = 10), gibt es eine signifikante Abnahme der Aufzucht Bewegung und durchschnittliche Geschwindigkeit der Freiwilligentätigkeit (p < 0,05, p < 0,01) im Modell Ratten (n = 10), und eine offensichtliche Zunahme der Latenz der Out-ring Eingang (p < 0,01). Die EPM-Test (Abbildung 4) zeigt, dass 21 Tage der Modellierung sowohl Frequenz von offenen Arm Einträge und Dauer in offenen Arm im Vergleich zu der Kontrollgruppe deutlich zurückgegangen (n = 10) (p < 0,05, p < 0,01), zwar gab es eine Zunahme sowohl Häufigkeit der enge Arm Einträge und Dauer in enger Arm (p < 0,05). Das Ergebnis des Tests ES (Abbildung 5) zeigt, dass die schwimmen Dauer der Model-Gruppe (n = 10) ist deutlich kürzer als die Kontrollgruppe (n = 10) (p < 0,001).
Als nächstes erkennen wir DA und 5-HT-Inhalt in beiden Hypothalamuses, die zentrale Neurotransmitter Unterschiede zu beobachten. Führt (Abbildung 6) zeigen, dass die DA in den Hypothalamus und das Verhältnis von DA an 5-HT in der Modellgruppe deutlich verringert (n = 10) im Vergleich zur Kontrollgruppe (n = 10) (p < 0,05, p < 0,01), während die 5-HT-Gehalt erhöht signifikant (p < 0,05).
Abbildung 1: Schematische des Feldes mehrere Plattform. (A) Vorderansicht. (B) Ansicht von oben. Die mehrere Plattform-Box ist eine deckellose Kunststofftank (110 × 60 × 40 cm3) mit fünfzehn Acryl-Plattformen auf der Unterseite und einen Wasserhahn an der lateralen Seite fixiert. Jede Plattform besteht aus einer Säule und einem runden flachen (d = 6,5 cm) größer als die Säule oben Plattform. Die Plattformen (h = 8 cm) in drei Zeilen und 5 Spalten verteilen. Die angrenzenden Plattformen sind in Spalten und Zeilen 13 cm Abstand von 10 cm. Der Tank fasst maximal 15 Ratten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: ein Foto der Modellierung. Die Ratte auf der Plattform Stand am 15. Tag des Modellierens. Seine trockenes Haar und trüben Augen deuten auf einen offensichtliche Müdigkeit Zustand.
Abbildung 3: Analyse der OFT. (A) Vergleich der Häufigkeit der vertikalen Aktivitäten. Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert (n = 10). Mit ungleiche Varianz (F = 9.877, p = 0,006 < 0,05), Bedeutung wurde bestimmt durch unabhängige Stichproben t-Test, t = 2.226, p = 0.049 < 0,05. Die Häufigkeit der vertikale Aktivität (Aufzucht) sinkt im Modell Ratten (n = 10) im Vergleich mit Kontrolle Ratten (n = 10). (B) ein Vergleich auf die durchschnittliche Geschwindigkeit der freiwilligen Tätigkeit. Daten werden als mittlere ± IQR dargestellt (n = 10). Bedeutung wurden ermittelt, indem Mann-Whitney U Test, Z =-2.685, p = 0,007 < 0,01. Die durchschnittliche Geschwindigkeit der freiwilligen Tätigkeit in der Modell-Ratten verringert sich im Vergleich zur Kontrolle Ratten. (C) Vergleich auf die Latenz der Out-ring Eingang. Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert (n = 10). Mit ungleiche Varianz (F = 5.748, p = 0.028 < 0,05), Bedeutung wurde bestimmt durch t-Test, t =-3.724, p = 0,03 < 0,01. Die Latenz der Out-ring Eingang Anstieg Modell Ratten, was bedeutet, dass sie verbringen mehr Zeit vor dem Eintritt in die nach außen Ring im Vergleich zur Kontrolle Ratten. Hinweis: p< 0,05 (*); p <0,01 (*); p < 0,001 (*).
Abbildung 4: Analyse der EPM-Test (A) Vergleich auf Frequenz der offenen Arm Einträge. Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert (n = 10). Mit gleicher Varianz (F = 0,982, p = 0.348 > 0,05), Bedeutung wurde bestimmt durch t-Test, t = 2.710, p = 0,014 < 0,05. Die Häufigkeit der offenen Arm Einträge im Modell Ratten (n = 10) sinkt im Vergleich zu Kontrolle Ratten (n = 10). (B) Vergleich auf Dauer in offenen Arm. Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert (n = 10). Mit gleicher Varianz (F = 0,100, p = 0.755 > 0,05), Bedeutung wurde bestimmt durch t-Test, t = 3.304, p = 0,004 < 0,01. Die offenen Arm-Dauer im Modell Ratten sinkt im Vergleich zu Kontrolle Ratten, was bedeutet, dass die Modell Ratten verbringen weniger Zeit in den offenen Arm. (C) Vergleich auf Frequenz der enge Arm Einträge. Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert (n = 10). Mit gleicher Varianz (F = 0.141, p = 0.712 > 0,05), Bedeutung wurde bestimmt durch t-Test, t =-2.466, p = 0,024 < 0,05. Die Häufigkeit der enge Arm Einträge im Modell Ratten erhöht verglichen mit Kontrolle Ratten. (D) Vergleich auf Dauer in enger Arm. Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert (n = 10). Mit ungleiche Varianz (F = 4.796, p = 0,042 < 0,05), Bedeutung wurde bestimmt durch t-Test, t =-2.736, p = 0,0016 < 0,05. Die enge Arm-Dauer im Modell Ratten erhöht verglichen mit Kontrolle Ratten, was bedeutet, dass die Modell-Ratten verbringen mehr Zeit im Studienarm mit enger. Hinweis: p < 0,05 (*); p <0,01 (*); p < 0,001 (*). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Analyse der erschöpfende Schwimmen Test Daten werden als mittlere ± IQR präsentiert (n = 10), und sind als p < 0,05 (*) p < 0,01 (*) p < 0,001 (*). Bedeutung wurden ermittelt, indem Mann-Whitney U Test, Z =-3.326, p = 0,001. Die Badezeit von Modell-Ratten (n = 10) ist deutlich kürzer als die Kontrolle Ratten (n = 10).
Abbildung 6: Analyse der zentralen Neurotransmitter Inhalt. (A) Vergleich auf DA Inhalte. Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert (n = 10). Mit gleicher Varianz (F = 0.088, p = 0.771 > 0,05), Bedeutung wurde bestimmt durch t-Test, t = 3.717, p = 0,002 < 0,01. DA Inhalte in beiden Hypothalamuses verringert sich im Modell Ratten (n = 10), verglichen mit den Ratten Kontrolle (n = 10). (B) Vergleich auf 5-HT-Inhalte. Daten werden als ± SEM bedeuten präsentiert (n = 10). Mit ungleiche Varianz (F = 5.282, p = 0,034 < 0,05), Bedeutung wurde bestimmt durch t-Test, t =-2.997, p = 0,012 < 0,05. Der 5-HT-Inhalt in beiden Hypothalamuses sinkt im Modell Ratten, im Vergleich zu der Kontrolle Ratten. (C) Verhältnis Vergleich. Daten werden als mittlere ± IQR dargestellt (n = 10). Bedeutung wurden ermittelt, indem Mann-Whitney U Test, Z =-3.175, p = 0,001. Das Verhältnis von DA an 5-HT verringert erheblich in die Modell-Ratten, im Vergleich zu der Kontrolle Ratten. Hinweis: p < 0,05 (*); p <0,01 (*); p < 0,001 (*).
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Discussion
Die MMPM ist ursprünglich für Schlaf Entzug9. Ratten sind in einen Wassertank mit Plattformen auf der Unterseite fest ins Leben gerufen. Angetrieben durch die instinktive Angst vor dem Wasser, Ratten auf den Plattformen stehen bleiben und keinen Schlaf auftritt. Die Studie zeigt, dass verschiedene Stunden Schlafentzug zu verschiedenen Veränderungen der Ratte Verhalten und Stimmung, einschließlich Anerkennung Beeinträchtigung10, negative Emotionen11und zentraler Ermüdung führen. Einige Forscher beweisen, dass Chronischer Schlafentzug mit der Plattform-Methode (SPM) zentrale Müdigkeit auslösen kann, mit Anerkennung Beeinträchtigungen und soziale Störungen12. Andere Untersuchungen zeigen, dass intermittierende Entbehrung an aufeinander folgenden Tagen verursachen kann, emotionale Störungen und zentraler Ermüdung, die mit Endorphinen13behandelt werden können. Unsere früheren Studie beweist, dass im Vergleich mit 5 Tagen und 14 Tage, 21 Tage Entzug zentraler Ermüdung induziert anstatt Emotion Stressbedingte Störungen14. Viele Faktoren der MMPM können dazu führen, dass zentrale Ermüdung, einschließlich der stundenlangen stehend, engen Unterschlupf Raum, mühsam und wiederholte Umwelt sowie der Mangel an Schlaf. Die zugrunde liegenden Korrelation zwischen Schlafentzug und zentraler Ermüdung kann der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (HPA) Achse in verschiedenen Ebenen zugeordnet werden unter welchen Monoamin Neurotransmitter Veränderungen eine wichtige Rolle spielen können.
In diesem Protokoll wir entwickeln eine zentrale Ermüdung-Modell mit MMPM und mit Verhaltensstörungen Tests und Neurotransmitter-Erkennung zu beurteilen. Zunächst erstellen wir einen 12 h/12 h Hell/Dunkel-Zyklus (06:00-18:00) im Labor, um den natürlichen zirkadianen Rhythmus des Wistar-Ratten zu imitieren, deren durchschnittliche Schlafzeit 12,6 h, ca. 2.4 - 4.2 h in der Nacht und 8.2-9,6 h um tagsüber15ist. Dann werden die Modell-Ratten Feld mehrere Plattform für 14 h (18:00-08:00) stehen pro Tag an 21 aufeinanderfolgenden Tagen, mit einer Kontrollgruppe für Kontrast gesetzt zugeführt. Am Ende des Experiments zeigen Ratten in der Modellgruppe einen offensichtlichen Müdigkeit auftritt, einschließlich glanzloses Haar, schwache Schweif Farbe, trüben Augen und verminderte Aktivität in den Käfig.
Die Ergebnisse der behavioral Tests zeigen Veränderungen in der körperlichen und emotionalen Aspekte. OFT ist in Nagetier-Modell Bewertung verbreitet, um Exploration Verhalten und Freiwilligentätigkeit16zu bewerten. Nagetiere haben den Instinkt des Thigmotaxis, das heißt, sobald sie in ein offenes Feld gesetzt werden, sie neigen dazu, schnell in den nach außen Ring nahe der Wand zu bewegen. Zur gleichen Zeit sie sind neugierig auf die neue Umgebung und sind bestrebt, den zentralen Bereich von Aufzucht vertikale und horizontale Bewegungen zu erkunden. Der Konflikt der zwei Motivationen spiegelt die Angst Stimmung17. Das Ergebnis der OFT schlägt abgelehnte ehrenamtliche Tätigkeit in der Modell-Ratten anhand ihrer verminderte durchschnittliche Geschwindigkeit. Darüber hinaus ist die Häufigkeit der Aufzucht in die Modell-Ratten deutlich sinkt im Vergleich zu der Kontrolle Ratten, die was Angst Emotion bedeuten können. Darüber hinaus das Modell Ratten neigen dazu, mehr Zeit vor dem Eintritt in die Out-ring keine offensichtliche Vorliebe für Exploration, was darauf hindeutet raumkognition Störungen in die Modell-Ratten. Die EPM-Test ist ein klassischer Test Angst zu beurteilen. Ratten mit Angst neigen dazu, in die enge Arm für Sicherheit statt Erkundung der offenen Arm18bleiben. Das Resultat zeigt, die mit der Kontrolle Ratten verglichen, die Modell-Ratten verbringen mehr Zeit in den engen Armen und weniger Zeit in die offenen Arme, und dies entspricht die Eingang Frequenz der verschiedenen Arme, und insgesamt überprüft die Angst Stimmung in die Modell-Ratten. Im Test ES ist Schwimmen Dauer der Modell Ratten viel kürzer als die Kontrolle Ratten, was auf schlechte Muskelleistung durch Müdigkeit verursacht. Abschließend werden Angst, Beeinträchtigung der Kognition, schlechte Muskelleistung und begrenzte ehrenamtliche Tätigkeit in Modell Ratten, alle anzeigenden zentrale Ermüdung.
Was die CNS schlage alle Änderungen in der zentralen Neurotransmitter zentrale Ermüdung. Wir finden eine signifikante Abnahme der DA Inhalt und eine Erhöhung in 5-HT des Hypothalamus. 5-HT ist ein Monoamin-Neurotransmitter synthetisiert aus der Aminosäure Tryptophan (TRP). Intensiver Aktivität erhöht 5-HT-Generation durch die Freigabe mehr kostenlose TRP ins Blut; die kumulierte 5-HT zurückhält im Gegenzug die zentrale Steuerung der Lok-Motor-System, führt zu schlechten Muskel Porformance19. DA ist ein leicht erregbaren Neurotransmitter, die zu Beginn des Lok-Motor Aktivität erhöht und durch das Auftreten von Müdigkeit20Tropfen. DA und 5-HT korrelieren und interagieren als Erregung-Hemmung System, dass die Auswirkungen die zentrale Steuerung der Lok-Motor System21. Damit ist die Tropfen auf das Verhältnis von DA an 5-HT ein wichtiger Indikator der zentralen Ermüdung.
Es gibt einige Hinweise im Protokoll, die entscheidend für den Erfolg sind. Erstens sind die Modell-Dauer und die Bedingungen mit männliche Wistar-Ratten getestet. Unterscheiden Sie die Temperatur-Präferenz und Schlaf-Dauer zwischen Stämmen und Geschlechtern14. Zweitens die Ratten sollten in Gruppen mit höchstens 6 Ratten in einem Käfig Leben und mit ausreichend Nahrung und Wasser in das Experiment zur Verfügung gestellt. Während der ersten zwei Wochen der Modellierung die Ratten sind ziemlich gereizt und können kämpfen im Tank und in den Käfigen. Halten Sie überwachen und verhindern, dass die verletzten Ratten vor dem Tod. Beachten Sie außerdem, die Ratten Haar zu trocknen, nachdem sie aus dem Tank, vor allem im Winter entfernt werden, Kälte zu vermeiden.
Obwohl das Modell für zentrale Ermüdung konzipiert ist, ist es möglich, komplexe Faktoren um seine Verwendung zu vergrößern. Zum Beispiel installieren wir Vibrationsmotoren und Federn auf die Plattform zu imitieren die Wellen im Meer und Entbehrung Muster zu ändern, im Versuch, ein Navigationsmodell Müdigkeit zu etablieren. Durch Anpassung der Modell-Dauer, kann es in vielen anderen Bereichen verwendet werden. Als Tiermodell Studie hat die Forschung seine Beschränkung. Erstens gibt es keinen Beweis in prädiktive Gültigkeit des Modells. In einer zukünftigen Studie sollten wir führen Anti-Müdigkeit Behandlung auf Ratten und bewerten ihre Genesung um das Modell Gültigkeit zu beweisen. Außerdem konzentriert sich aktuelle Einschätzung des Modells mehr auf negative Emotionen und CNS Änderungen; Zentrale Ermüdung manifestiert sich jedoch auch als lernen Schwierigkeiten und soziale Vermeidung12. Verhaltens-Tests wie Morris Wasser-Irrgarten und Sozialinteraktion Test kann in der Zukunft durchgeführt werden, um ein umfassendes Verständnis der Krankheit zu erhalten. Wir hoffen, das zentrale Ermüdung-Modell eingeführt, hier kann dazu beitragen, um den Pathomechanismus der zentralen Ermüdung zu erkunden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Natural Science Foundation of Beijing (No.7162124) und Xin-Ao-Stiftung für die Peking-Universität der chinesischen Medizin unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| multiple platform sleep deprivation water tank | Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine | 110cm x 60cm x 40cm. There are 15 plastic small platforms at the bottom. The small platform is 6.5cm in diameter and 8cm high | |
| Wistar rats | Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Company | license number SYXK (Beijing) 2016-0011 | Use 32 Wistar healthy male rats ,8 week old (200-210 g) |
| Agilent 1100LC high performance liquid chromatograph | Agilent | G1379A, G1311A, G1313A , G1316A | G1379A, G1311A type chromatographic pump, G1313A automatic sampler, G1316A column temperature box |
| DECADE II SDC electrochemical detector | Dutch ANTEC company | glassy carbon electrode, Ag/AgCl reference electrode, workstations (Clarity CHS) | |
| Biofuge Stratos high-speed refrigeration centrifuge | HERAEUS | ||
| VCX130 ultrasonic fracturing instrument | SONICS | ||
| ACS-ZEAS electronic scale | Phos technology development, Beijing. | The weight of the weighing rats can be accurate to 0.1g. | |
| Open Field Box | Customization,it is provided by the neuroimmunological laboratory of Beijing University of Chinese Medicine | wooden box of open field 100 cm by 100 cm x 40 cm, inside wall and bottom as the gray.The bottom is divided into 25 equal area squares, each of which is 20cm x 20cm, and the 16 grids along the outer wall are the external ones, and the other 9 grids are central.The camera is mounted above the median. | |
| Elevated Plus-maze | Beijing zhongshi dechuang technology development co. LTD. | The open arms and close arms of the cross are composed of 30cm x 5cm x 15cm, and the central area is 5cm x 5cm, with a camera mounted above the center and 45cm high. | |
| rat swimming bucket. | Zhenhua biological instrument equipment co., LTD. Anhui,China. | The volume of plastic drum is 70cm x 30cm x 110cm, which is used for swimming in rats. | |
| Thermometer | Shiya instrument co., LTD., changzhou,China. | Control water temperature | |
| Small water pump | Xincheng technology co., LTD., chengdu,China. | Used for water tank and swimming behavior. | |
| Ethovition3.0 behavioral software. | Nuldus,Netherlands | Measurement analysis of rat behavior videos. |
References
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