Summary
يصف هذا البروتوكول تلفيق نظام الثقافة الخلية للسماح بزرع الخلايا الجذعية في سقالة البوليمرات موصلة للتحفيز الكهربائي في المختبر وزرع اللاحقة في فيفو من السقالة الخلايا الجذعية المصنف باستخدام تقنية كسبها.
Abstract
العلاج بالخلايا الجذعية وبرز بالسكتة دماغية مثيرة العلاجية، ولكن أسلوب التسليم الأمثل لا يزال غير واضح. بينما استخدمت تقنية microinjection لعقود تسليم الخلايا الجذعية في نماذج السكتة الدماغية، وهذا الأسلوب يحد الافتقار إلى القدرة على التعامل مع الخلايا الجذعية قبل الحقن. تفاصيل هذه الورقة طريقة استخدام سقالة البوليمرات موصلة كهربائياً لإيصال الخلايا الجذعية. التحفيز الكهربائي للخلايا الجذعية باستخدام سقالة البوليمرات موصلة يغير الجينات للخلايا الجذعية تشارك في بقاء الخلية والاستجابة الالتهابية، وإعادة عرض متشابك. بعد preconditioning الكهربائية، يتم زرع الخلايا الجذعية على السقالة إينتراكرانيالي في نموذج الفئران انسداد شريان دماغي الأوسط البعيدة. توضح هذه المقالة تقنية قوية للتلاعب بالخلايا الجذعية عبر سقالة البوليمرات موصلة هذا البروتوكول وإنشاء أداة جديدة لزيادة تطوير العلاج القائم على الخلايا الجذعية.
Introduction
السكتة الدماغية هي السبب الرئيسي الثاني للوفاة في العالم، والسبب الخامس للوفيات في الولايات المتحدة. على الرغم من هذه معدلات الوفيات المرتفعة، تظل علاجات للسكتة الدماغية الاسترداد حاليا تحديا مع لا خيارات قابلة للتطبيق الطبية المتاحة حاليا1. يوجد حاليا حوالي 300 من التجارب السريرية التي تتعامل مع السكتات الدماغية، منها 40 فقط استخدام الخلايا الجذعية. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن الخلايا الجذعية العلاج تأثيراً مفيداً على السكتة الدماغية إصلاح2،3. وقد أظهرت Paracrine عوامل مثل عامل نيوروتروفيك المستمدة من المخ (BDNF) وثرومبوسبوندين-1 (ثبس-1) أطلق سراحهم من الخلايا المزروعة السلف العصبية البشرية (هنبكس) تحسين استرداد الفنية من خلال الآليات المرتبطة بزيادة في المشبك تشكيل والأوعية والتفريع الجذعية والإسقاطات محواري الجديدة، فضلا عن تحوير المناعي4،،من56. ومع ذلك، أساليب التسليم الأمثل للخلايا الجذعية لا تزال بعيدة المنال.
إنجاز نجاح الخلايا الجذعية للدماغ لا يزال يمثل تحديا. حاليا، قد أدخلت المائية القابلة للحقن ونظم السقالات البوليمرية لتسليم الخلايا الجذعية. هذه طرق التسليم حماية الخلايا الجذعية من خلال زرع، فضلا عن توفر الحماية من بيئة ما بعد السكتة الدماغية قاسية بما في ذلك استجابة للمضيف التحريضية وظروف التاكسج7،،من89 , 10-ومع ذلك، المواد الأكثر استخداماً خاملة، مما يحد من استخدام التعديل المستمر (أي, التحفيز الكهربائي) من الخلايا11. التحفيز الكهربائي هو أحد الرموز التي يؤثر التمايز، وأيون قناة الكثافة، وثمرة نورت من الخلايا الجذعية البالغة12. مقارنة بالبوليمرات الخاملة، ويمكن أن تحمل البوليمرات الموصلة السماح الحالي للتحفيز الكهربائي والتلاعب بالخلايا الجذعية2. ومع ذلك، لا تزال غير كاملة هو استكشاف الآلية الدقيقة التي ينظم التحفيز الكهربائي نيوروتروفيك عامل الإصدار (أي، بدنف وثبس-1).
في هذا البروتوكول، يصف لنا الخطوات اللازمة لبناء نظام ثقافة خلية يتكون من السقالة البوليمرات الموصلة، بوليبيرولي (بي)، الذي يسمح للتحفيز الكهربائي في المختبر . بسبب الطريقة التي مختلق في منظومة الثقافة الخلية، غرس اللاحقة من السقالة المصنف الخلايا الجذعية على القشرة المحيطة--احتشاء الممكنة. لهذا النظام، ونحن كهربائياً مسبق الخلايا الجذعية على السقالة لفترة زمنية قصيرة قبل غرس. في أعقاب التحفيز الكهربائي، هو نجاح مزروع سقالة البوليمرات الموصلة تحمل الخلايا إينتراكرانيالي باستخدام أسلوب مينيملي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أقر جميع الخلايا الجذعية والحيوان إجراءات لجنة "الرقابة أبحاث الخلايا الجذعية" في جامعة ستانفورد و "الفريق" جامعة ستانفورد الإداري في "مختبر رعاية الحيوان" (سكرو-616 وأبلاك-31909).
1-النقش من الزجاج إيتو
- تحضير أكسيد إنديوم قصدير (إيتو)-الشريحة الزجاجية المغطاة بوضع عامل إخفاء الجانب موصلة من الزجاج.
ملاحظة: يمكن استخدام الأشرطة التجارية الأكثر شفافية كعامل تقنيع.- إزالة قناع الزائدة باستخدام شفرة، تاركاً فقط بالشكل المرغوب من التصميم النهائي إيتو غطت على الزجاج.
- الجمع بين 5% (v/v) من حمض النتريك و 45% (v/v) من HCl في كوب زجاج داخل غطاء دخان لإعداد الحل النقش.
- استخدم لوحة الساخن ومقياس حرارة لضمان المحافظة على درجة حرارة النقش الحل عند 70 درجة مئوية.
- بمجرد حل الحفر تصل إلى 70 درجة مئوية، ضع الشريحة الزجاجية إيتو ملثمين في المحلول لمدة دقيقتين لإزالة طبقة إيتو الزائدة.
ملاحظة: إخفاء الشريط يحمي طبقة إيتو من التعرض لحمض الحل. - إزالة الشريحة من الحل وشطفه مع منزوع (دي) ح2o.
- بعناية إزالة قناع وقياس مقاومة استخدام متعدد للتأكد من أن إيتو المتبقية سليمة. قراءات منطقة محفوراً المرجوة ينبغي أن تكون Ω حوالي 0.
2-إعداد الحل بيرول
- في زجاجة زجاج 1000 مل، حل 70 غ من الصوديوم دوديسيلبينزينيسولفونيت (نادبس) في 600 مل ح دي2o.
- حالما يتم حل في نادبس، إضافة 14 مل من بيرول 0.2 M و 386 مل ح دي2س إلى الحل.
- تغطية الحل مع رقائق الألومنيوم وتخزينها في 4 درجات مئوية.
3-الطلي من بوليبيرولي على الزجاج إيتو
- الحارة الحل بيرول إلى درجة حرارة الغرفة حتى نادبس هو ريديسولفيد تماما.
ملاحظة: هذا يستغرق حوالي 15 إلى 20 دقيقة. - صب 25 مل الحل بيرول في كوب.
- الاتصال الزجاج إيتو محفوراً متعدد وغمر الشريحة إلى الحل بيرول.
- التأكد من أن تواجه الجانب مع 0 Ω المقاومة تجاه مسرى إشارة شبكة البلاتين.
- تطبيق تيار كهربائي الشروع في الطلي من بي على سطح إيتو استخدام متعدد (الحالية التي تسيطر على 3 mA/سم2 لمدة 4 ساعات).
- إزالة الزجاج إيتو من متعدد ويغسل مطلي-بي في دي ح2س لإزالة السطح المتبقية.
- فصل لوحة بي مطلي من الزجاج إيتو باستخدام شفرة حلاقة بلطف.
- تخزين لوحة بي في درجة حرارة الغرفة.
4-إعداد بولي دايمثيل سيلوكسان (PDMS)
- باستخدام ملعقة وطبق تزن، مزيج ز 18 عامل أساسي مع ز 2 عامل التجفيف وصب الخليط في قوالب الزجاج اثنين 10 × 8 سم.
- إزالة الفقاعات من قوالب استخدام فراغ غرفة لمدة 15-20 دقيقة.
- مكان القوالب في فرن 70 درجة مئوية ح 3.
- عندما يبرد، استخدام ملعقة مسطحة لإزالة PDMS من القوالب.
5-تصنيع الدائرة الكهربائية التحفيز في المختبر
- اﻷوتوكﻻف بلوحات معدنية (وكسل، 2.5 سم × 12.5 سم) وتدفق صمامات على 120 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
- استخدام شريحة دائرة كقالب، قطع قطعتين من PDMS.
ملاحظة: قطعة واحدة من PDMS بمثابة محيط الدائرة الخلية مع القواطع المربعات المجاورة اثنين من داخل قاعة الخلية. PDMS قطعة أخرى من مخطط تفصيلي محيط الدائرة.- قطع الداخل الدائرة الخلية حيث تكون مربعة على شكل ويطابق الشكل دائرة الخلية. ضمان مستطيلة الشكل العام لكل قطعة من PDMS ويتطابق مع الشريحة الدائرة.
- طبقة المواد كالآتي من الأسفل إلى الأعلى: (1) معدنية لوحة، (2) PDMS (بدون القواطع)، لوحة (3) بي (عمودي PDMS)، (4) PDMS (مع القواطع) والدائرة (5) الخلية.
- المشبك الجهاز معا فور محاذاته تماما.
- قص قطعتين 60 سم من الأسلاك المعدنية واستخدام اللصق الفضي لإرفاق سلك واحد لكل نهاية من لوحة بي أن يبرز من خارج الدائرة. التأكد من أن الأسلاك طويلة بما يكفي تمتد من الجهاز إلى خارج حاضنة.
- متى يشفي لصق الفضة، تعزز وختم الاتصال سلك مع الإيبوكسي.
- سجل المقاومة استخدام متعدد للتأكد من أن الحقل التطبيقي هو نفسه في كل دائرة.
- لغرس، إزالة الأسلاك؛ أونكلامب الدوائر الخلية و PDMS ومن ثم لهم منفصلة من السقالة موصلة. بعد السقالات مزروع هو حوالي 1 مم × 3 مم × 0.25 مم.
6-طلاء "الخلايا السلف" البشرية العصبية (هنبكس) في بي
- تعقيم الدوائر المجتمعة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة ساعتين.
- بعد 1 ساعة، تدوير تجميع الدوائر 90°.
- بعد التعقيم، معطف سطح بي في الجزء السفلي من الدائرة مع 800 ميليلتر من الركازة طلاء والسماح للركيزة ترسيخ على لوحة بي في حاضنة في 37 درجة مئوية في 5% CO2 ح 1.
- بعد 1 ساعة، إزالة المادة طافية من الدوائر وشطف بلطف مع مل 1 ملغ + دببس + Ca في البئر.
ملاحظة: تجنب غسل سطح بي قوة كما سيؤدي هذا مفرزة الركازة طلاء. - استخدام وسائط خلية جديدة، ننأى ميكانيكيا بالخلايا المزروعة للاستخدام مع الدوائر من صفيحة زراعة الأنسجة مع بيبيتينج لطيف.
ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا روافد 90-100% عند الانفصال. - جمع الكريات هنبك استخدام الطرد المركزي في 8000 x ز لمدة 5 دقائق.
- استخدام هيموسيتوميتير، عد وريسوسبيند الخلايا في وحدة تخزين من 100,000 الخلايا/سم2.
- لوحة 100,000 الخلايا في كل دائرة جيدا (100,000 الخلايا/سم2 في 1 مل من وسائل الإعلام).
- عودة الدوائر إلى حاضنة في 37 درجة مئوية في 5% CO2-
7-الكهربائية تحفيز هنبكس
- يوم واحد بعد زرع الخلايا في الدوائر، واستخدام مولد الموجي لتطبيق التحفيز الكهربائي للخلايا.
- قبل التحفيز، قم بإزالة الوسائط القديمة من كل دائرة أيضا، وتجديد مع 800 ميليلتر من وسائط جديدة.
- بعد أن يتم تغيير وسائط الإعلام، مكان الدوائر مرة أخرى إلى الحاضنة، وتمديد الأسلاك خارج الحاضنة، وإرفاقها بمولد الموجي
- تطبيق التحفيز على الخلايا مع إشارة موجه مربعة في mV ±400 مع 100 هرتز ح 1.
- بعد التحفيز، وإزالة الأسلاك واحتضان الدوائر ليوم آخر في حاضنة في 37 درجة مئوية مع شركة 5%2.
- إجراء التحليل البيولوجي اللاحقة بما في ذلك بقاء الخلية والكمية في الوقت الحقيقي تفاعل البوليميراز المتسلسل (قرة-PCR) يتبع البروتوكول الخاص بالشركة المصنعة.
8- في فيفو غرس بي
- تنفيذ نماذج السكتة الدماغية انسداد الشريان الدماغي الأوسط البعيدة (dMCA) على خلية T-قصور الكبار عارية ذكور الفئران (± 230 المعاهد الوطنية للصحة-دعايتهم ز 30) كما هو موضح سابقا2. تنفيذ غرس أسبوع بوست-dMCA الانسداد.
- يوم واحد قبل الجراحة، إعطاء الأمبيسلّين (1 ملغ/مل) على الفئران في مياههم القفص.
- تخدير الفئران في الدائرة التعريفي استخدام 0.5-3% ملغ/كغ من isoflurane تدار عن طريق الاستنشاق.
- تأكيد أنيسثيتيزيشن الفئران بالافتقار إلى أخمص القدمين قرصه استجابة منعكس.
- وبينما الحيوان تحت التخدير، مواصلة رصد لها غشاء لون ونمط التنفس ودرجة حرارة المستقيم كل 15 دقيقة.
- حالما يتم التأكد من أنيسثيتيزيشن تطبيق الدموع الاصطناعية في عيون الفئران لمنع جفاف.
- ضمان المحافظة على الأسلوب العقيم خلال هذا الإجراء باستخدام قفازات معقمة وثني جراحية معقمة13. تبقى الأدوات الجراحية المعقمة داخل حقل عقيمة.
- بينما الفأر تحت التخدير، حفر كرانيكتومي فوق قشرة الأيسر. فتح في بلده دوراً.
- إزالة الأم الجافية من الدماغ باستخدام إبرة رقيقة الجزئي جراحية.
- زرع السقالات موصلة من النظام في المختبر على قشرة الفئران.
ملاحظة: لتجاربنا، نحن مزروع السقالات في المختبر يوم 3 بعد الطلاء هنبك.- مكان الزرع أساسا على قشرة penumbral الآنسي للآفة السكتة الدماغية.
- بعد أن يتم وضع السقالة، ضع سورجيسيل على عملية الزرع لمنع الحركة مع إغلاق الجلد.
- خياطة الجرح أغلقت وتحت الجلد حقن الفئران البوبرينورفين ريال في جرعة من 1 مغ/كغ لإدارة الألم المرتبطة بجراحه ستيريوتاكسيك وانسداد dMCA.
- وضع الفئران في قفص انتعاش كما أنه يستعيد وعيه.
- لا تترك الحيوان غير المراقب في حين أنها فاقد الوعي.
- لا تضع هذا الحيوان مع الآخرين حتى أنه اكتسب كامل وعيه.
- مراقبة الحيوانات يوميا لعلامات ألم بما في ذلك فقدان وزن الجسم، كمية نقص الغذاء والمياه، معطف الاستمالة/غير مهذب انخفاض، انخفضت زيادة النشاط العفوي، الموقف الشاذ، التخييم الجفاف/الجلد، العيون الغارقة، الاختباء، تشويه الذات، التنفس السريع، فتح الفم في التنفس، والوخز، ويرتجف، والزلزال وحناجرهم.
- مراقبة الحيوانات يوميا حتى أنه يبدو أن هذه هي الأكل والشرب، والاستمالة، واكتساب الوزن؛ واسبوعيا ثم بعد زيادة الوزن.
- يوثانيزيشن المبكر عن طريق استنشاق أول أكسيد الكربون2 وتأكيد ثانوية من يوثانيزيشن (بما يكفل عدم أحياء الحيوان جراء استنشاقهم2 CO وظيفة لإمدادات الأوكسجين العادي) سوف يحدث لأي الحيوان الذي يظهر بأن عدم تناول الطعام، الشرب و زيادة الوزن بعد العملية الجراحية الأولى؛ يظهر في الألم؛ أو يبدو غير قادر على إكمال الاختبارات السلوكية بسبب أكبر من المتوقع العجز القشرة الحركية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التخطيطي هو مبين في الشكل 1 يمثل سير العمل الإجمالي للتحفيز الكهربائي هنبكس وتطبيقاتها المحتملة من المتلقين للمعلومات. قيد الحالية في العلاج بالخلايا الجذعية أن الخلايا الجذعية معرضون لبيئة ما بعد زرع قاسية بما في ذلك الالتهاب والشروط السكتة. تحد هذه الظروف الصعبة المحتمل على الفعالية العلاجية14،15. قد زيادة استخدام السقالة موصلة لحماية هنبكس من هذه البيئة هنبكس الفوائد العلاجية من خلال preconditioning الكهربائية. الخطوة الأولى في هذا الأسلوب إيصال الخلايا الجذعية هو تطوير السقالة موصلة باستخدام الطلاء الكهربائي2،نهج16. نحن تتسم توافق مع السقالات الحياة وتحسين الخصائص الكهربائية preconditioning مع هنبكس. تم تعريف عناصر التحكم ك unstimulated الخلايا الجذعية تزرع على طبق استنبات الأنسجة.
وقيمت الفولتية المختلفة لتحديد سلامة التحفيز الكهربائي وتعظيم فعالية بريكونديتيونينج. للتأكد من أن الحقل التطبيقي نفسه في كل دائرة، وتم قياس المقاومة للدائرة المجمعة متعدد باستخدام (مقاومات (أوم، Ω) من الدوائر كانت حوالي 10 kΩ، و resistivity≈3 Ωm). وفقا للمورد التجاري، أظهرت هنبكس استخدام لا سيتوتوكسيسيتي كبيرة في نظم الاستزراع العادي. هنبكس مع أو بدون التعرض للتحفيز الكهربائي كانت ملطخة بفحوصات سلامة الخلية (حية: الخضراء؛ الميت: الأحمر) (الشكل 2). تشير هذه النتائج إلى أن هنبكس كانت قابلة للتطبيق بعد التحفيز الكهربائي (mV ±400، 100 هرتز لمدة 1 ساعة). للتحقق من صحة الفحص بقاء الخلية، أجرينا اختبار خلايا صلاحية استخدام الإنزيم ريسازورين. كما تبين النتائج لا سيتوتوكسيسيتي كبيرة للتحفيز الكهربائي في هنبكس.
بياناتنا في فيفو السابقة أظهرت أن العوامل paracrine صدر من هنبكس (SD56، الشخصيات المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية) مع تعرض للتحفيز الكهربائي تحسين الانتعاش بعد السكتة الدماغية2. لاستكشاف المزيد من عوامل مرشح من المعروف أن المهم في السكتة الدماغية الاسترداد التي تم إصدارها من هنبك (أرونا الطبية، الشخصيات المستمدة من الخلايا الجذعية الجنينية)، قيمت بدنف وثبس-1. هذه العوامل قد درست على نطاق واسع بسبب دورها في نمو الخلايا العصبية، وزيادة التفاعلات خلية إلى17،18. وأجرى qRT-بكر للتحقيق في مدى فعالية التحفيز الكهربائي على التغييرات الترنسكربيتوم بدنف وثبس-1، بما في ذلك الجينات بدنف وثبس-1 مع جابده كجين التدبير المنزلي. وكان حوالي 1 ميكروغرام من مجموع الجيش الملكي النيبالي عكس نسخها إلى كدنا وفقا للبروتوكول الخاص بالشركة المصنعة. حسبت نسب التغيير حظيرة طبيعية بأسلوب ΔΔCt مقارنة التعبير الجيني في هنبكس في بي وهنبكس في بي مع تعرض للتحفيز الكهربائي. وأظهر التحليل الإحصائي أوبريجوليشنز كبيرة في التعبير الجيني بدنف وثبس-1 بين المجموعات التي كانت تعتمد التحفيز (ف ≤0.01) كهربائياً (الشكل 3). هذه البيانات تشير إلى أن التحسين الممكنة تحقيق أقصى قدر من الفعالية هنبك دون موت الخلية كبيرة.
الشكل 1 . في المختبر نظام سقالة البوليمرات الموصلة للتحفيز الكهربائي. (أ) هو وضع دائرة شريحة أعلى لوحة بي. (ب) يبين التخطيطي تلفيق الدائرة الكهربائية التحفيز في المختبر مع هنبكس مطلي على سطح بي. تدفق صمامات تستخدم لعقد قاعة الشريحة، PDMS، بي، والمعادن لوحة معا. (ج) صورة الدائرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . خلية مقايسة البقاء في هنبكس مع أو بدون التحفيز الكهربائي. (أ) شريطي إظهار الخلايا الحية الملون مع كالسين-ص. يتم عرض البيانات يعني ± التنمية المستدامة؛ n = 4. (ب) خلية تحليل جدوى استخدام ريسازورين. يظهر الرسم البياني بار كان هناك لا سيتوتوكسيسيتي للتحفيز الكهربائي في هنبكس؛ n = 4. (ج) الاعتداء صوراً لبقاء الخلية قبل وبعد العلاج التحفيز الكهربائي. إشارة خضراء تشير إلى الخلايا الحية (كالسين-ص)، بينما يشير إشارة حمراء إلى الخلايا الميتة (اتهد-1). وفاق يشير إلى التحفيز الكهربائي. وفاق + أو--يشير إلى وجود أو عدم وجود التحفيز الكهربائي في الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . تغييرات التعبير الجيني بالتحفيز الكهربائي. إظهار شريطي أمثال التغيرات في تعبيرات الجين بدنف (A) و THBS1 (ب) في هنبكس (* * يشير إلى يعتد به إحصائيا بين مجموعات اشترطت كهربائياً وغيرها، ف < 0.01، تظهر أشرطة خطأ المرسوم العالي؛ n = 4، ANOVA أحادي الاتجاه ). سلبي يشير إلى عنصر التحكم حيث كانت الخلايا المستزرعة على طبق استنبات الأنسجة عادية. وفاق + أو--يشير إلى وجود أو عدم وجود التحفيز الكهربائي في الخلايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تزايد الأدلة أظهرت الوعد بالخلايا الجذعية كعلاج السكتة دماغية رواية. وادي هذا الوعد جهدا كبيرا للنهوض بعلاجات الخلايا الجذعية للسرير مع التجارب السريرية الجارية أو المستكملة على الأقل 40. أمراض السكتة الدماغية يقدم اضطراب عصبي فريد الذي يفسح المجال للعلاج بالخلايا الجذعية لأنه بعد إهانة حادة، لا توجد الأعصاب عملية منع الاسترداد. الآلية الدقيقة للخلايا الجذعية--تعزيز السكتة الدماغية الاسترداد لا يزال غير واضح. الأوعية، وسينابتوجينيسيس، وإعادة عرض متشابك كل قد أظهرت أن تكون هامة. عندما تتم إزالة الجزيئات الهامة لتشكيل المشبك مثل بدنف وثبس-1 هو السكتة الدماغية الاسترداد البصر6،19. هنبكس تحسنت وظيفية الانتعاش بعد السكتة الدماغية في نماذج حيوانية عديدة20،21. تأثير آليات هنبكس ما زالت غير مفهومة تماما، وطريقة التسليم المثالي لهذه الخلايا غير معروف. بوضع نظام يسمح بالتلاعب بالجزيئات هام صدر من هنبكس، واحد يمكن أن تساعد في التفريق بين آليات الاسترداد لا يتجزأ وتحسين العلاج بالخلايا الجذعية.
تسليم خلية ناجحة للدماغ لا يزال يمثل تحديا. حاليا، وضعت عددا من تكنولوجيات استخدام أنظمة السقالات مادة بيولوجية مختلفة لإيصال الخلايا الجذعية لتحسين بقاء وتكامل الخلايا الجذعية9،10. ومع ذلك، نظراً لخصائص هذه المواد الخاملة، من الصعب تعديل الخلايا الجذعية بعد ما زرع.
توضح هذه المقالة طريقة استخدام سقالة بي للتعامل مع الترنسكربيتوم هنبكس كهربائياً كما هو موضح من قبل upregulation بدنف وثبس-1 في بياناتنا qRT-PCR. وكشفت الدراسة السابقة أن زيادة في التعبير فيجفا في هنبكس بعد التعرض للتحفيز الكهربائي الوظيفي الاسترداد المحسن بعد السكتة الدماغية2. هنا علينا أن نظهر أن نيوروتروفيك إضافية عوامل مثل بدنف وثبس-1 أيضا التضمين بعد التعرض للتحفيز الكهربائي في خط خلية هنبك مختلفة، تبين أن نظامنا يمكن استخدامها مع العديد من خطوط الخلايا.
أثناء تصنيع الدائرة الكهربائية التحفيز في المختبر ، من الأهمية بمكان أن سلك معدني متصل تماما بلوحة بي استخدام الطلاء الفضة والايبوكسي. إذا كان هذا الاتصال غير سليمة، فإنه يتسبب اختلاف المجالات الكهربائية حتى مع نفس المعلمات. وعلاوة على ذلك، في بعض الأحيان قد تسرب وسائل الإعلام بعد الجمعية العامة لنظام السقالات. لحل هذه المشكلة، يمكن تطبيق الشحوم فراغ لختم المسافة بين لوحة بي مع الرعاية و PDMS لا تنطبق على سطح الخلية البذر. حد واحد نظراً للطبيعة غير شفافة من لوحة بي أن فحص كونفلوينسي خلايا مع الفحص المجهري الخفيفة القياسية محدودة.
وميزة الطريقة الموصوفة في هذا البروتوكول يسمح لتحوير هنبكس للمساعدة في تحديد التغييرات الميكانيكية للخلايا. حاليا، التحوير الكهربائية لا قد اتصل باستخدام أنظمة السقالات خاملة أو المائية التقليدية. بعد التحفيز الكهربائي باستخدام سقالة بي، يمكن تسليمها هنبكس دون إزالة من على سطح البوليمر إلى نموذج في فيفو . تطوير الأساليب لمواصلة دراسة المرض نماذج تطبيقات الخلايا الجذعية يسمح لنا بتصميم أفضل التطبيقات متعدية الجنسيات. النهج بريكونديتيونينج الكهربائية، بفضل النظام البوليمرات الموصلة، يمكن تطبيقها على أنواع مختلفة من الخلايا ويسمح بفهم أفضل لتأثير التحفيز الكهربائي في خلية. القدرة على تحسين الخلايا في المختبر وبعد ذلك دون مزيد من التلاعب (مثل باساجينج أو إزالة) يسمح لاختبار هذه التلاعبات في المختبر في فيفو الولايات الأمراض مثل السكتة الدماغية. ويهدف في نهاية المطاف الاستفادة من تقنيات جديدة، مثل سقالة وصف البوليمرات الموصلة، للنهوض بالسكتة الدماغية المداواة وتحسين فهم آليات استرداد السكتة الدماغية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في المصالح تعلن بهذا العمل.
Acknowledgments
ونحن نشكر الدكتور خالد الطيب أندرياسن (قسم طب الأعصاب والعلوم العصبية، وجامعة ستانفورد) لاستخدام الجهاز قرة-PCR. كان يدعمها العمل المعاهد الوطنية للصحة منح K08NS098876 (إلى P.M.G.)، وزمالات عميد "كلية الطب بجامعة ستانفورد" في ما بعد الدكتوراه (ل B.O.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
References
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- George, P. M., et al. Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery. Biomaterials. 142, 31-40 (2017).
- Steinberg, G. K., et al. Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study. Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).
- George, P. M., Steinberg, G. K. Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
- Schabitz, W. R., et al. Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis. Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).
- Liauw, J., et al. Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).
- Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype. Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).
- Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
- Ballios, B. G., et al. A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation. Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).
- Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).
- Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. Implant Biomaterials: A Comprehensive Review. World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).
- Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair. Front Hum Neurosci. 9, (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Abdelwahid, E., et al. Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair. Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).
- Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- George, P. M., et al. Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics. Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).
- Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells. J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).
- Lopes, N., et al. Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling. Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).
- Ploughman, M., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats. Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).
- Baker, E. W., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model. Sci Rep. 7 (1), 10075 (2017).
- Bacigaluppi, M., et al. Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes. J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).
