Summary
פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות מרדית
Abstract
טיפול בתאי גזע התפתחה משיכת מרגש טיפולית, אך שיטת אספקה אופטימלים נשאר לא ברור. בעוד בטכניקה של microinjection שימש במשך עשרות שנים כדי לספק תאי גזע במודלים שבץ, טכניקה זו מוגבל על ידי חוסר היכולת לתפעל את תאי הגזע לפני ההזרקה. מאמר זה מפרט שיטה של שימוש בפיגומים פולימר מוליך חשמלי של תאי גזע למסירה. גירוי חשמלי של תאי גזע באמצעות לפיגום פולימר מוליך הפיצולים של התא גזע גנים המעורבים ב הישרדות cell, תגובה דלקתית ו שיפוץ סינפטית. לאחר preconditioning חשמליים, תאי גזע על הגרדום מושתלים intracranially במודל חולדה סגר דיסטלי עורק המוח התיכון. פרוטוקול זה מתאר טכניקה חזקה לתמרן תאי גזע דרך לפיגום פולימר מוליך ויוצר כלי חדש כדי להמשיך ולפתחו טיפול המבוסס על תאי גזע.
Introduction
שבץ מוחי הוא הסיבה המובילה השניה של מוות בעולם, הגורם המוביל החמישי המוות בארצות הברית. למרות אלה שיעורי התמותה גבוהים, טיפולים להחלמה שבץ נותרו כיום אתגר עם אפשרויות רפואי קיימא זמין כעת1. כרגע יש כ 300 ניסויים קליניים העוסקים שבץ איסכמי, מהם 40 רק לנצל את תאי גזע. מחקרים קודמים הראו כי תאי הגזע טיפולים יש השפעה מיטיבה על קו-תיקון-2,-3. גורמים Paracrine כמו neurotrophic המוח-derived factor (BDNF) ו- thrombospondin-1 (THBS-1) שוחררו המושתלים האנושי עצבית ובתאים (hNPCs) הראו התאוששות פונקציונליות משופרת באמצעות מנגנונים הקשורים עם עלייה סינפסה היווצרות, אנגיוגנזה, מסעף דנדריטים, תחזיות עצב חדשים, כמו גם הכוח ויסות מערכת החיסון4,5,6. עם זאת, השיטות אספקה אופטימלים של תאי גזע נשארים חמקמקים.
משלוח מוצלח בתאי גזע המוח נשאר אתגר. כיום, הידרוג להזרקה ומערכות פיגומים פולימריים הוכנסו להעביר תאי גזע. שיטות משלוח אלה להגן על תאי גזע במהלך ההשתלה, כמו גם להציע הגנה מפני הקשים שלאחר שבץ כולל תגובה דלקתית של המחשב המארח, תנאים ובשפתיים-7,-8,-9 , 10. עם זאת, החומרים הנפוצים הם ללא ניע, אשר מגביל את השימוש אפנון רציפה (קרי, גירוי חשמלי) של תאים11. גירוי חשמלי הוא רמז המשפיע בידול, יון ערוץ צפיפות ו- neurite המוצלח תאי גזע12. לעומת פולימרים אינרטי, פולימרים מוליכים יכול לשאת הנוכחי המאפשר גירוי חשמלי ומניפולציה של תאי גזע2. עם זאת, המנגנון המדויק שבו גירוי חשמלי ממיקרו neurotrophic גורם לשחרור (קרי, BDNF ו- THBS-1) הוא חקר עדיין לא לגמרי.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים כדי לבנות מערכת התרבות התא המורכב לפיגום פולימר מוליך, polypyrrole (PPy), המאפשר במבחנה גירוי חשמלי. בשל האופן שבו מערכת התרבות התא הוא מפוברק, אפשרי בהמשך השרשת לגרדום נזרע תאי גזע על גבי קליפת פרי-לאוטם. למערכת זו, אנחנו חשמלית כתנאי תאי גזע על הגרדום פרק זמן קצר לפני ההשתלה. בעקבות גירוי חשמלי, לגרדום פולימר מוליך נושא את התאים בהצלחה קטנטנים intracranially באמצעות שיטת פולשנית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל תאי גזע והתהליכים בעלי חיים, אושרו על ידי ועדת הפיקוח מחקר תאי הגזע של סטנפורד על ידי פאנל ניהול באוניברסיטת סטנפורד על מעבדה חיה על עצמך (SCRO-616 ו APLAC-31909).
1. תחריט של זכוכית ITO
- להכין את תחמוצת בדיל אינדיום (ITO)-שקופיות זכוכית מכוסה על ידי הנחת סוכן מיסוך בצד ואטימה של הזכוכית.
הערה: מרבית הקלטות שקוף יכול לשמש כמסכה.- להסיר את המסכה עודף באמצעות להב, להשאיר רק את הצורה הרצויה של העיצוב הסופי של איטו מכוסה על הזכוכית.
- לשלב 5% (v/v) של חומצה חנקתית 45% (v/v) של HCl ב גביע זכוכית בתוך ברדס fume להכין את הפתרון תחריט.
- השתמש צלחת חמה, מד חום כדי להבטיח כי הטמפרטורה של תחריט הפתרון נשמר ב- 70 מעלות צלזיוס.
- מרגע שהתמיסה איכול 70 מעלות צלזיוס, למקם את השקופית רעולי פנים-ITO זכוכית בתוך תמיסת למשך 2 דקות להסיר את שכבת איטו עודף.
הערה: הקלטת מיסוך מגן השכבה איטו החשיפה תמיסה חומצית. - הסר את השקופית של הפתרון, לשטוף אותו עם יונים (DI) H2O.
- הסר בזהירות את ההתנגדות מסכת ולמדוד באמצעות multimeter על מנת להבטיח כי קריטון שנותרו ללא פגע. המפרט של חרוט באזור הרצוי צריך להיות כ 0 Ω.
2. הכנת פירול פתרון
- בבקבוק זכוכית 1000 מ ל, להמיס 70 גר' נתרן dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) ב- 600 מ"ל של DI H2O.
- ברגע NaDBS מחוסלת, להוסיף 14 מ"ל של פירול 0.2 מ' ו- mL 386 DI H2O הפתרון.
- לכסות את הפתרון עם רדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 º C.
3. electroplating של Polypyrrole על זכוכית ITO
- לחמם את הפתרון פירול לטמפרטורת החדר עד NaDBS הוא redissolved באופן מלא.
הערה: זה לוקח בערך 15-20 דקות. - שופכים 25 מ של הפתרון פירול לתוך גביע.
- להתחבר הזכוכית איטו חרוט multimeter ויציפו את השקופית לתוך הפתרון פירול.
- ודא כי הצד בהתנגדות Ω 0 פונה לכיוון האלקטרודה הפניה רשת פלטינה.
- החל זרם חשמלי ליזום electroplating של PPy על פני השטח איטו באמצעות של multimeter (שוטף נשלטת על אמא/ס מ 32 למשך 4 שעות).
- הסר את הזכוכית איטו multimeter ואת כביסה electroplated-PPy DI H2O כדי להסיר שאריות חומרים פעילי שטח.
- ניתוק בעדינות את הצלחת electroplated PPy מהזכוכית איטו באמצעות סכין גילוח.
- אחסן את הצלחת PPy בטמפרטורת החדר.
4. הכנת Polydimethylsiloxane (PDMS)
- בעזרת מרית וקערית שוקלים, לערבב 18 גרם של סוכן הבסיס עם דור 2 של ריפוי סוכן, שופכים את התערובת לתוך תבניות זכוכית שני 10 ס"מ 8 ס"מ.
- הסר את הבועות התבניות באמצעות תא ואקום במשך 15-20 דקות.
- מניחים את התבניות בתנור 70 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.
- לאחר מקורר, להשתמש במרית שטוחה כדי להסיר את PDMS מן התבניות.
5. ייצור לשכת גירוי חשמלי במבחנה
- אוטוקלב לוחות מתכת (WxL, 2.5 ס"מ x 12.5 ס"מ) ואת זרימת שסתומים ב 120 מעלות צלזיוס במשך שעה.
- באמצעות שקופית קאמרית כתבנית, לחתוך שתי חתיכות של PDMS.
הערה: חתיכה אחת של PDMS משמש להיקף של התא לתא עם מגזרות של שני ריבועים צמודים מ בתוך תא התא. החלק השני PDMS היא חלוקה של השטח של התא.- לחתוך החוצה הבתוך תא קאמרית כך שהוא מרובע בצורת ומתאימה את הצורה של התא לתא. ודא כי הצורה הכללית של שני החלקים של PDMS הוא מלבני המתאים של השקופית קאמרית.
- שכבה של החומרים כמו הבאות מלמטה למעלה: (1), לוחית מתכת (2) PDMS (ללא עמלות), (3) PPy צלחת (בניצב PDMS), (4) PDMS (עם מגזרות), ו- (5) תא קאמרית.
- תהדק את המנגנון ביחד ברגע שיהיה מיושר לגמרי.
- לחתוך שתי פיסות 60 ס מ של חוט מתכת ולהשתמש הדבק כסף לחבר חוט אחד בכל קצה של צלחת PPy המגיחה מתוך החלק החיצוני של החדר. ודא החוטים מספיק זמן כדי להאריך מן המנגנון אל מחוץ אינקובטור.
- לאחר ההדבקה כסף הוא נרפא, לחזק, לאטום את החיבור חוט עם אפוקסי.
- להקליט את ההתנגדות משתמש multimeter כדי לוודא כי השדה יישומית הוא זהה בכל אחד.
- להשתלה, להסיר את החוטים; unclamp התאים תא, PDMS, ולאחר מכן אותם להפריד לגרדום מוליך. המימד של פיגומים מושתל הוא בערך 1 מ מ x 3 מ"מ x 0.25 מ"מ.
6. ציפוי האנושי עצבית ובתאים (hNPCs) ב- PPy
- לעקר את התאים מורכבים תחת אור UV למשך שעתיים.
- לאחר שעה אחת, לסובב את שהורכב צ'יימברס 90°.
- לאחר עיקור, מעיל השטח של PPy בחלק התחתון של החדר עם 800 µL של מצע ציפוי ולאפשר את המצע שבמהלכו בצלחת PPy בתוך אינקובטור ב 37 ° C-5% CO2 לשעה.
- לאחר שעה אחת, הסר את תגובת שיקוע של צ'יימברס, לשטוף בעדינות עם 1 מ"ל של DPBS + Ca + Mg לכל טוב.
הערה: להימנע לשטוף את פני השטח של PPy בכוח כמו זה יגרום להתנתקות המצע ציפוי. - באמצעות מדיה תא טריים, מכנית מביצועם בתרבית תאים לשימוש עם התאים מצלחת תרביות רקמה עם pipetting עדין.
הערה: תאים צריך להיות 90-100% confluent על דיסוציאציה. - לאסוף את כדורי hNPC באמצעות צנטריפוגה ב 8000 x g במשך 5 דקות.
- שימוש של hemocytometer, לספור, resuspend את התאים בווליום של תאים/ס מ 100,0002.
- צלחת 100,000 התאים לתא בכל טוב (100,000 תאים/cm2 ב 1 מ"ל של מדיה).
- לחזור צ'יימברס חממה-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2-
7. גירוי חשמלי של hNPCs
- יום אחד לאחר זריעה התאים על התאים, השתמש מחולל גל כדי להחיל גירוי חשמלי לתאים.
- לפני גירוי, להסיר מדיה זקן אחד טוב, לחדש עם 800 µL של התקשורת טריים.
- לאחר שינוי בתקשורת, במקום התאים בחזרה לתוך החממה, להרחיב את החוטים מתוך החממה, לצרף אותם גנרטור גל
- להחיל את הגירוי התאים עם אות גל מרובע ב mV ±400 עם 100 הרץ לשעה.
- לאחר הגירוי, להסיר את החוטים, תקופת דגירה של התא להוצאה של עוד יום בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 ° C עם 5% CO2.
- לבצע לאחר מכן ניתוח הביולוגי כולל הכדאיות התא, כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) ע פ הפרוטוקול של היצרן.
8. in Vivo PPy השרשה
- מבצע דיסטלי עורק המוח התיכון (dMCA) סגר קו הדגמים תא T לקויה למבוגרים זכר עירום חולדות (NIH-RNU 230 ± 30 g) כפי שתוארה קודם לכן2. ביצוע ההשתלה שבוע אחד פוסט-dMCA סגר.
- יום אחד לפני הניתוח, לתת אמפיצילין (1 מ"ג/מ"ל) לעכברושים במים הכלוב שלהם.
- עזים ומתנגד העכברוש באמצעות לשכת אינדוקציה 0.5 - 3% מ"ג/ק"ג של איזופלוריין מנוהל באמצעות אינהלציה.
- לאשר ההרדמה של העכברוש על ידי חוסר תגובת רפלקס של קמצוץ הבוהן.
- בעוד החיה תחת הרדמה, להמשיך לפקח שלה ממברנה צבע דפוס הנשימה, טמפרטורה רקטלית כל 15 דקות.
- לאחר ההרדמה הוא אישר, החל דמעות מלאכותיות על עיני עכברוש למניעת יובש.
- ודא כי הטכניקה aseptic תישמר במהלך הליך זה על-ידי שימוש בכפפות סטריליות, מאסו כירורגי סטרילי13. לשמור על כלי כירורגי סטרילי בתוך שדה סטרילי.
- בעוד העכברוש הוא בהרדמה, תרגיל של craniectomy מעל קליפת המוח השמאלי. פתח את השכבה הקשה של המוח.
- הסר את הדורה המוח באמצעות מחט דק מיקרו כירורגי.
- שתל פיגומים מוליך ממערכת במבחנה על גבי קליפת חולדה.
הערה: לניסויים שלנו, אנחנו מושתלים פיגומים מיום במבחנה 3 לאחר ציפוי hNPC.- למקם את השתל בעיקר על קליפת penumbral המדיאלי כדי הנגע שבץ.
- לאחר לגרדום מושם, הצב surgicel מעל השתל כדי למנוע תנועה עם העור סגירה.
- לתפור הפצע סגור, subcutaneously להחדיר את החולדות. הבופרנורפין SR במינון של 1 מ ג/ק ג כדי לנהל את הכאב קשור dMCA סגר ובבית stereotaxic.
- מקום העכברוש בכלוב שחזור זה להכרתו.
- לעולם לא תעזוב את החיה ללא התערבות כשהוא מחוסר הכרה.
- אין למקם את החיה עם אחרים עד מלא זכה להכרה.
- יפקח חיות מדי יום עבור סימנים של כאב כולל ירידה במשקל הגוף, צריכת מזון ירידה/מים, המעיל פרוע/לטפח מופחתת, ירד/מוגברת פעילות ספונטנית, יציבה נורמלית, התייבשות/עור להקים אוהל, עיניים שקועות, מסתור, השחתה עצמית נשימה מהירה נשימה בפה פתוח, מתעוות, רועדת, רעד, הניקוד.
- לנטר את החיות מדי יום עד שיופיע כי הם לאכול, לשתות, טיפוח, לעלות במשקל; ואז שבועי לאחר עלייה במשקל.
- Euthanization מוקדמת דרך שאיפת2 CO ואישור משני euthanization (על מנת להבטיח את החיה לא ישוב כתוצאה מהשאיפה של2 CO פוסט של חמצן נורמלית האספקה) יחולו כל חיה שמופיע כדי לא לאכול, לשתות, לעלות במשקל לאחר ההליך הכירורגי הראשוני; מופיע כאב; או מופיעה אפשרות להשלים את הבדיקות התנהגותיות עקב גדול יותר מאשר צפוי גירעון של קורטקס מוטורי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התרשים המוצג באיור 1 מייצג את זרימת העבודה הכוללת של גירוי חשמלי של hNPCs והיישומים פוטנציאלית במורד הזרם. מגבלה הנוכחי של טיפול בתאי גזע הוא כי תאי גזע נחשפים סביבת שלאחר השתלת קשים כולל דלקת ותנאים איסכמי. אלה התנאים הקשים סביר להגביל את היעילות הטיפולית14,15. השימוש לפיגום מוליך על hNPCs מפני סביבה זו עשוי להגדיל את היתרונות הטיפוליים hNPCs דרך preconditioning חשמל. הצעד הראשון בטכניקה זו מסירה תאי גזע הוא התפתחות לפיגום מוליך באמצעות מטוס2,אלקטרוליטי הגישה16. אנו שאפיינה את הביו פיגומים, אופטימיזציה המאפיינים החשמליים preconditioning עם hNPCs. פקדים הוגדרו unstimulated תאי גזע גדל על צלחת תרביות רקמה.
המתחים השונים הוערכו כדי לקבוע את הבטיחות של גירוי חשמלי וכדי למקסם את היעילות preconditioning. כדי להבטיח כי השדה יישומית תהיה זהה בכל אחד, resistivity לשכת שהורכב נמדדה באמצעות multimeter (התנגדויות (אוהם, Ω) של צ'יימברס היו כ 10 kΩ, resistivity≈3 Ωm). לפי הספק מסחרי, הראו hNPCs בשימוש אין cytotoxicity משמעותי במערכות תרבות נורמלי. hNPCs עם או בלי חשיפה גירוי חשמלי היו מוכתמים תא הכדאיות מבחני (Live: ירוקים; המתים: אדום) (איור 2). תוצאות אלו מצביעות על כי hNPCs היו קיימא לאחר גירוי חשמלי (mV ±400, 100 הרץ לשעה). לאימות וזמינותו הכדאיות תא, ביצענו תא הכדאיות בדיקת שימוש assay resazurin. התוצאות גם להוכיח אין cytotoxicity משמעותית של גירוי חשמלי ב- hNPCs.
הנתונים שלנו אין ויוו הקודמים הוכיח כי גורמים paracrine שוחררה מבית hNPCs (SD56, NPCs שמקורם בתאי גזע עובריים) עם חשיפה גירוי חשמלי לשפר את ההתאוששות לאחר קו2. כדי לחקור יותר גורמים המועמד ידוע להיות חשוב בהחלמה שבץ משתחררים מן hNPC (ביו ארונה, NPCs שמקורם בתאי גזע עובריים), הוערכו BDNF ו- THBS-1. גורמים אלה נחקרו בהרחבה בשל התפקיד שמילאו תוצר עצביים ולהגדיל -לתא אינטראקציות17,18. כדי לחקור את היעילות של גירוי חשמלי על שינויים transcriptome BDNF ו- THBS-1, לרביעיית-PCR בוצעה כולל גנים BDNF ו- THBS-1 עם GAPDH כמו גן משק בית. µG כ 1 של RNA הכולל היה הפוך-עיבד לתוך cDNA לפי הפרוטוקול של היצרן. קיפול מנורמל-שינוי יחס חושבו בשיטה ΔΔCt השוואה בין גנים hNPCs על PPy, hNPCs על PPy עם חשיפה גירוי חשמלי. ניתוח סטטיסטי הראה upregulations משמעותית בביטוי הגנים של BDNF ו- THBS-1 בין קבוצות שהיו חשמלית גירוי מותנה (p ≤0.01) (איור 3). נתונים אלה עולה שאופטימיזציה אפשרית למקסם את יעילות hNPC ללא מוות בתא משמעותיים.
איור 1 . במבחנה פולימר מוליך מערכת לגרדום סטימולציה חשמלית. (א) תא שקופית מונחת על גבי צלחת PPy. (B) התרשים מראה הזיוף של התא גירוי חשמלי במבחנה עם hNPCs מצופה על פני השטח של PPy. זרימה שסתומים משמשים כדי להחזיק את התא שקופיות, PDMS, PPy, מתכת צלחת ביחד. (ג) תמונה של החדר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . תא assay הכדאיות ב hNPCs עם או בלי גירוי חשמלי. (א) גרף הממחיש תא חי מוכתם Calcein-am. נתונים שהוצגו הם זאת אומרת ± ש; n = 4. (B) התא assay הכדאיות באמצעות resazurin. גרף מציגה שהיה לא cytotoxicity של גירוי חשמלי-hNPCs; n = 4. (ג) תמונות של תא הכדאיות assay לפני ואחרי טיפול גירוי חשמלי. אות ירוק מציין תאים חיים (Calcein-am), ואילו האות אדום מציין תאים מתים (EtHD-1). ES מצביע על גירוי חשמלי. ES + או - מצביע על נוכחות או היעדרות של גירוי חשמלי על תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . שינויים בביטוי הגנים עם גירוי חשמלי- גרף הממחיש מקפלים שינויים ג'ין ביטויים של BDNF (א) ו- THBS1 (B) hNPCs (* * מציין משמעותי סטטיסטית בין חשמלית preconditioned וכל שאר הקבוצות, p < 0.01, שגיאה ברים הצג ש; n = 4, חד-כיווני אנובה ). שלילי מציין את הפקד שבו התאים היו תרבותי על צלחת רגילה תרביות רקמה. ES + או - מצביע על נוכחות או היעדרות של גירוי חשמלי על תאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
גדל ראיות הוכיחה את ההבטחה של תאי גזע כטיפול קו הרומן. הבטחה זו הובילה מאמץ גדול כדי להתקדם תאי גזע הרפוי המיטה לפחות 40 הניסויים הקליניים מתמשכים או שהושלמו. קו פתולוגיה מציע הפרעה נוירולוגית ייחודי זה הוא משאיל את עצמו טיפול בתאי גזע כי לאחר העלבון חריפה, שום תהליך ניווניות מניעת שחזור. המנגנון המדויק של התאוששות משופרת תאי גזע שבץ עדיין לא ברור. אנגיוגנזה, synaptogenesis וסינפטית שיפוץ כל הוכחו להיות חשוב. כאשר מולקולות חשוב עבור סינפסה היווצרות כגון BDNF ו- THBS-1 אינן מוסרות, קו שחזור הוא לקוי6,19. hNPCs השתפרו שחזור פונקציונלי לאחר שבץ בבעלי חיים רבים20,21. המנגנון של hNPCs אפקט שרידים לא הבנתי, שיטת המשלוח אידיאלי עבור תאים אלה אינו ידוע. על ידי פיתוח מערכת המאפשר אחד כדי לתפעל מולקולות חשוב שוחררה מבית hNPCs, אחד יכול לעזור להבדיל את מנגנוני התאוששות אינטגרלי ולמטב את טיפול בתאי גזע.
תא מוצלחת משלוח אל המוח נשאר אתגר. כיום, מספר טכנולוגיות אלו פותחו מערכות פיגומים biomaterial שונים לספק בתאי גזע כדי לשפר את ההישרדות ושילוב של תאי גזע9,10. עם זאת, בשל המאפיינים אינרטי של חומרים אלה, קשה לווסת את תאי הגזע לאחר ההשתלה שלהם.
מאמר זה מתאר שיטה באמצעות לפיגום PPy חשמלית לתפעל את transcriptome של hNPCs, כפי שמוצג על ידי קולטנים upregulation של BDNF ו- THBS-1 בהנתונים שלנו לרביעיית-PCR. המחקר הקודם שלנו גילה כי עלייה בביטוי VEGFA על hNPCs, לאחר חשיפה גירוי חשמלי פונקציונלי שחזור משופר לאחר קו2. כאן אנחנו מדגימים שאת neurotrophic נוספים גורמים כגון BDNF ו- THBS-1 גם מאופנן לאחר חשיפה גירוי חשמלי בקו תא hNPC שונים, מראה כי המערכת שלנו יכולה לשמש עם שורות תאים רבים.
במהלך ייצור לשכת גירוי חשמלי במבחנה , חיוני כי החוט מתכת לגמרי מחובר לצלחת PPy באמצעות כסף צבע אפוקסי. אם חיבור זה הוא לא קול, היא גורמת שדות חשמליים שונים אפילו עם אותם פרמטרים. יתר על כן, לעיתים התקשורת עלול לדלוף לאחר ההרכבה של מערכת פיגומים. כדי לפתור בעיה זו, ניתן להחיל משחה ואקום כדי לאטום את הרווח בין את PDMS ואת PPy לצלחת עם טיפול לא תחול פני זורעות תא. מגבלה אחת בשל אופיו שאינם שקופים של צלחת PPy הוא בדיקת confluency של תאים עם מיקרוסקופ אור רגיל הוא מוגבל.
היתרון של השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה מאפשר אפנון של hNPCs כדי לקבוע את השינויים מכניסטית של התאים. כיום, אפנון חשמל לא היה פנה באמצעות הידרוג קונבנציונאלי או מערכות פיגומים אינרטי. לאחר גירוי חשמלי באמצעות לגרדום PPy, hNPCs יכולים להינתן ללא הסרת מהמשטח פולימר למודל ויוו . פיתוח שיטות ללמוד עוד דגמים מחלה של תאי גזע יישומים מאפשר לנו עיצוב טוב יותר translational יישומים. הגישה preconditioning חשמל, מתאפשרת על ידי מערכת פולימר מוליך, שניתן להחיל על סוגי תאים שונים ומאפשר הבנה טובה יותר של ההשפעה של גירוי חשמלי על תא. היכולת לייעל את תאי במבחנה , אז בלי עוד מניפולציה (כגון passaging או הסרת) מאפשר בדיקה של אלה מניפולציות במבחנה בויוו מצבי מחלה כגון שבץ מוחי. המטרה היא לנצל את טכניקות חדשות, כגון לגרדום פולימר מוליך המתואר, כדי לקדם קו הרפוי ולשפר את ההבנה של מנגנונים שחזור שבץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להצהיר עם עבודה זו.
Acknowledgments
אנו מודים Andreasson קטי ד ר (מחלקת נוירולוגיה ו נוירולוגיות המדע, אוניברסיטת סטנפורד) לשימוש של המכונה לרביעיית-PCR. העבודה נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים K08NS098876 (ל P.M.G.) בתר של סטנפורד הספר לרפואה דין (כדי ריח רע).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
References
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- George, P. M., et al. Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery. Biomaterials. 142, 31-40 (2017).
- Steinberg, G. K., et al. Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study. Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).
- George, P. M., Steinberg, G. K. Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
- Schabitz, W. R., et al. Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis. Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).
- Liauw, J., et al. Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).
- Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype. Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).
- Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
- Ballios, B. G., et al. A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation. Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).
- Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).
- Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. Implant Biomaterials: A Comprehensive Review. World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).
- Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair. Front Hum Neurosci. 9, (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Abdelwahid, E., et al. Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair. Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).
- Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- George, P. M., et al. Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics. Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).
- Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells. J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).
- Lopes, N., et al. Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling. Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).
- Ploughman, M., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats. Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).
- Baker, E. W., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model. Sci Rep. 7 (1), 10075 (2017).
- Bacigaluppi, M., et al. Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes. J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).
