Summary
Det här protokollet beskriver tillverkning av ett cellodlingssystem att sådd av stamceller på en ledande polymer byggnadsställning för in vitro- elektrisk stimulering och efterföljande i vivo implantation av stamceller-seedade byggnadsställning med en minimalinvasiv teknik.
Abstract
Stamcellsterapi har vuxit fram som ett spännande stroke terapeutiska, men det optimala leveranssättet oklar. Medan tekniken med Mikroskop har använts i årtionden för att leverera stamceller i stroke modeller, är denna teknik begränsad av bristande förmåga att manipulera stamceller före injektion. Detta dokument specificerar en metod för att använda en elektriskt ledande polymer byggnadsställning för stamceller leverans. Elektrisk stimulering av stamceller med en ledande polymer byggnadsställning förändrar stem cellens gener som är involverade i cellöverlevnad, inflammatorisk reaktion och synaptic remodeling. Efter elektriska iordningställande transplanteras stamcellerna på schavotten intracranially i distala mellersta cerebral artär ocklusion råtta modell. Detta protokoll beskriver en kraftfull teknik för att manipulera stamceller via en ledande polymer byggnadsställning och skapar ett nytt verktyg för att ytterligare utveckla stamceller-baserad terapi.
Introduction
Stroke är den andra vanligaste dödsorsaken i världen och den femte vanligaste dödsorsaken, i USA. Trots dessa höga dödstal fortfarande behandlingar för stroke återvinning för närvarande en utmaning med ingen livskraftig medicinska alternativ tillgängliga1. Finns för närvarande omkring 300 kliniska prövningar med ischemisk stroke, varav endast 40 utnyttja stamceller. Tidigare studier har visat att stamceller terapier har en gynnsam effekt på stroke reparation2,3. Parakrin faktorer såsom hjärnan som härrör neurotrofa faktorn (BDNF) och thrombospondin-1 (THBS-1) frigörs från transplanterade mänskliga neurala stamceller (hNPCs) har visat förbättrad funktionell återhämtning genom mekanismer som är associerade med en ökning synaps bildas, angiogenes, dendritiska förgrening och nya axonal prognoser samt modulera immunförsvaret4,5,6. De optimala leveranssätt av stamcellerna kvarstår dock svårfångade.
Framgångsrika stamceller leverans till hjärnan fortfarande en utmaning. För närvarande, har injicerbara hydrogel och polymera ställningssystem införts för att leverera stamceller. Dessa leveransmetoder skyddar stamceller under transplantation samt erbjuder skydd från den hårda efter stroke miljön inklusive värdens inflammatorisk reaktion och hypoxisk villkor7,8,9 , 10. men de vanligaste materialen är inerta, vilket begränsar användningen av kontinuerlig modulering (dvs, elektrisk stimulering) av celler11. Elektrisk stimulering är en cue som påverkar differentiering, ion kanal täthet och neurite utväxt av stamceller12. Jämfört med inerta polymerer, kan ledande polymerer bära en nuvarande möjliggör elektrisk stimulering och manipulation av stamceller2. Den exakta mekanismen genom vilken elektrisk stimulering modulerar neurotrofa faktorn release (dvs BDNF och THBS-1) är dock fortfarande inte helt utforskat.
I detta protokoll beskriver vi stegen för att konstruera en cell kultur system bestående av en ledande polymer byggnadsställning, Polypyrrol (PPy), som möjliggör in vitro- elektrisk stimulering. På grund av det sätt som cellodlingssystem är påhittade, är efterföljande implantation av stamceller-seedade ställningen på peri-infarct cortex möjligt. För detta system förutsättning vi elektriskt stamceller på schavotten för en kort tid före implantation. Efter elektrisk stimulering, ledande polymer schavotten transporterar cellerna implanteras framgångsrikt intracranially med en minimalt invasiv metod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla stamceller och djur förfaranden godkändes av Stanfords Stem Cell Research Oversight kommittén och Stanford University administrativa panelen på laboratorium djur vård (Bolagsverket-616 och APLAC-31909).
1. etsning av ITO-glas
- Förbereda den indium tinoxiden (ITO)-täckt glasskiva genom att placera en maskering agent över ledande sida av glaset.
Obs: De flesta kommersiella transparent tejp kan användas som en maskering agent.- Ta bort överflödigt masken med hjälp av ett blad, lämnar bara önskad form av slutliga ITO design omfattas på glaset.
- Kombinera 5% (v/v) salpetersyra och 45% (v/v) av HCl i en glasbägare inuti ett dragskåp att förbereda etsning lösningen.
- Använd en värmeplatta och en termometer för att säkerställa att temperaturen hos etsning lösning upprätthålls vid 70 ° C.
- När etsning lösningen når 70 ° C, placera den maskerade-ITO glasskiva i lösningen i 2 minuter för att ta bort överflödig ITO lagret.
Obs: Tejp maskering skyddar ITO lagret från exponering för syralösning. - Ta bort bilden från lösningen och skölj med avjoniserat vatten (DI) H2O.
- Ta försiktigt bort masken och mät motståndet med en multimeter för att säkerställa att de återstående ITO är intakt. Avläsning av den önska etsade ytan bör vara cirka 0 Ω.
2. beredning av Pyrrol lösning
- I en 1000 mL glasflaska, lös 70 g natrium dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) i 600 mL DI H2O.
- När NaDBS är upplöst, lägga till 14 mL 0,2 M Pyrrol och 386 mL DI H2O i lösningen.
- Täcka lösningen med aluminiumfolie och förvaras vid 4 ° C.
3. galvanisering av Polypyrrol på ITO-glas
- Varma Pyrrol lösningen till rumstemperatur tills NaDBS är helt löses på nytt upp.
Obs: Detta tar cirka 15 till 20 minuter. - Häll 25 mL av Pyrrol lösningen i en bägare.
- Ansluta det etsade ITO-glaset till en multimeter och sänk bilden i Pyrrol lösning.
- Se till att sidan med 0 Ω motstånd är vänd mot platina mesh referenselektroden.
- Tillämpa en elektrisk ström för att initiera galvanisering av PPy på ITO ytan med en multimeter (nuvarande kontrolleras på 3 mA/cm2 4 timmar).
- Ta bort ITO glaset från den multimetern och tvätta elektropläteras-PPy i DI H2O ta bort kvarvarande tensid.
- Försiktigt loss elektropläteras-PPy plattan från ITO glaset med ett rakblad.
- Lagra PPy plattan vid rumstemperatur.
4. beredning av Polydimetylsiloxan (PDMS)
- Med hjälp av en spatel och en väga maträtt, blanda 18 g bas agent med 2 g härdare och Häll blandningen i två 10 x 8 cm glas formar.
- Ta bort bubblorna från formarna med en vakuumkammare för 15-20 minuter.
- Lägg formarna i en 70 ° C ugn för 3 h.
- När svalnat, Använd en platt Stekspade för att avlägsna PDMS från formarna.
5. tillverkning av elektrisk stimulering In Vitro kammaren
- Autoklav den metallplattor (WxL, 2,5 x 12,5 cm) och flöde ventiler vid 120 ° C i 1 timme.
- Med en kammare-bild som en mall, skär två bitar av PDMS.
Obs: En bit av PDMS fungerar som omkretsen av cell kammaren med utklipp av två angränsande rutor från inom cellen kammaren. Den andra PDMS-bit är en disposition av kammarens omkrets.- Skär ut insidan cellen kammaren så att den är fyrkantig formade och matchar formen på cell kammaren. Se till att den övergripande formen av båda bitar av PDMS är rektangulär och matchar avdelningen bilden.
- Lager material enligt följande från botten till toppen: (1) metall pläterar, (2) PDMS (utan utklipp), (3) PPy plattan (vinkelrätt mot PDMS), (4) PDMS (med utskärningar) och (5) cell kammare.
- Klamma fast apparaten tillsammans när det är fullt i linje.
- Skär två 60 cm bitar av en metalltråd och använda silver pasta för att fästa en tråd till varje ände PPy plattan som sticker ut från utsidan av kammaren. Kontrollera att kablarna är tillräckligt lång för att förlänga från apparaten till utsidan av en inkubator.
- När silver pastan är botad, förstärka och tätning tråd anslutningen med epoxi.
- Spela in motståndet med en multimeter för att se till att fältet tillämpad är detsamma i varje kammare.
- För implantation, ta bort kablarna; klämbygeln cell kamrarna och PDMS och sedan dem separat från ledande ställningen. Dimensionen av de implanterade ställningar är cirka 1 x 3 x 0,25 mm.
6. plätering mänskliga neurala stamceller (hNPCs) på PPy
- Sterilisera monterade kamrarna i UV-belysning i 2 timmar.
- Efter 1 timme, rotera den hopsatta kammare 90°.
- Efter sterilisering belägga ytan av PPy längst ned i kammaren med 800 µL av beläggning substrat och tillåta substratet att stelna på PPy plattan i en inkubator vid 37 ° C 5% CO2 för 1 h.
- Efter 1 timme, avlägsna supernatanten från chambers och skölj försiktigt med 1 mL DPBS + Ca + Mg per brunn.
Obs: Undvik att tvätta ytan av PPy kraftfullt som detta kommer att orsaka avskildheten av beläggning substratet. - Använder färska cell media, mekaniskt separera odlade celler för användning med kamrarna från en vävnadskultur tallrik med mild pipettering.
Obs: Celler bör vara 90 – 100% konfluenta vid dissociation. - Samla hNPC pellets med centrifugering vid 8000 x g i 5 minuter.
- Använder en hemocytometer, räkna och resuspendera cellerna på en volym på 100 000 celler/cm2.
- Tallrik 100 000 celler i varje kammare väl (100 000 celler/cm2 i 1 mL av media).
- Returnera chambers till inkubator vid 37 ° C 5% CO2.
7. elektrisk stimulering av hNPCs
- En dag efter sådd cellerna på avdelningar, använda en vågform generator för att använda elektrisk stimulering till cellerna.
- Innan stimulering, ta bort gamla medier från varje kammare väl och fylla på med 800 µL av färska media.
- Efter media ändras, placera kamrarna tillbaka i inkubatorn, förlänga kablarna ur inkubatorn och bifoga dem till en vågform generator
- Gäller att stimulera cellerna med en Kvadrera vinkar signalerar vid ±400 mV med 100 Hz för 1 h.
- Efter stimulering, ta bort kablarna och inkubera avdelningar för en annan dag i en inkubator inställd vid 37 ° C med 5% CO2.
- Utföra efterföljande biologisk analys inklusive cellernas viabilitet och kvantitativ realtids polymeras-kedjereaktion (qRT-PCR) efter tillverkarens protokollet.
8. in Vivo PPy Implantation
- Utföra distala mellersta cerebral artär (dMCA) ocklusion stroke modeller på T-cell-brist vuxna manliga naken råttor (NIH-RNU 230 ± 30 g) som beskrivs tidigare2. Utföra implantation veckas post-dMCA ocklusion.
- En dag före kirurgi, ge ampicillin (1 mg/mL) till råttorna i deras bur vatten.
- Söva råtta i en induktion kammare med 0,5 - 3% mg/kg av isofluran administreras via inandning.
- Bekräfta anesthetization råttans genom brist på tå nypa reflex svar.
- Djuret är under narkos, fortsätta att övervaka dess membran färg, andningsmönster och rektal temperatur varje kvart.
- När anesthetization har bekräftats, applicera konstgjorda tårar på ögonen på råtta att förhindra torrhet.
- Säkerställa att aseptisk teknik upprätthålls under denna procedur med hjälp av sterila handskar och en steril kirurgiska draperi13. Hålla sterila kirurgiska instrument inom ett sterilt fält.
- Råttan är under narkos, borra ett craniectomy ovanför den vänstra cortexen. Öppna dura.
- Ta bort dura mater från hjärnan med hjälp av mikro-tunn kirurgiska nål.
- Implantat i ledande ställningar från in vitro -system på råtta cortex.
Obs: För våra experiment, vi implanteras ställningar från in vitro- dag 3 efter hNPC plätering.- Placera implantatet primärt på halvskugga cortex mediala till stroke lesionen.
- Efter ställningen är placerad, placera surgicel över att förhindra rörelse med huden stängning.
- Sutur såret stänga och subkutant injicerar råttorna med buprenorfin SR vid en dos av 1 mg/kg att hantera smärta i samband med stereotaxic kirurgi och dMCA ocklusion.
- Placera råtta i en återhämtning bur som det återfår medvetandet.
- Aldrig lämna djuret utan uppsikt medan det är medvetslös.
- Placera inte djuret med andra tills det blivit fullt medvetande.
- Övervaka djur dagligen för tecken på smärta inklusive viktminskning, minskad mat/vattenintag, minskad grooming/ovårdade kappa, minskade/ökade spontan aktivitet, onormal kroppshållning, dehydrering/hud tält, insjunkna ögon, dölja, självstympning, snabb andning, öppen mouthed andas, ryckningar, darrningar, tremor och läte.
- Övervaka djuren dagligen tills det syns att de äter, dricker, grooming, och gå upp i vikt; och sedan vecka efter viktökning.
- Tidiga dödshjälp via CO2 inandning och en sekundär bekräftelse av dödshjälp (att djuret inte kommer återuppliva på grund av normala syre leverans post CO2 inandning) inträffar till något djur som verkar inte äta, dricka och gå upp i vikt efter det initiala kirurgiska ingreppet; visas i smärta; eller visas inte slutföra de beteendemässiga testerna på grund av ett större än väntat motoriska cortex underskott.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den schematiska Figur 1 representerar det totala arbetsflödet för elektrisk stimulering av hNPCs och eventuella efterföljande program. En nuvarande begränsning i stamcellsterapi är att stamceller utsätts för en hård efter transplantation miljö inklusive inflammation och ischemisk villkor. Dessa svåra förhållanden sannolikt begränsa deras terapeutiska effekt14,15. Användning av en ledande ställning att skydda hNPCs från denna miljö kan öka hNPCs terapeutiska fördelar genom elektriska prekonditionering. Det första steget i denna stamceller leverans teknik är utvecklingen av en ledande byggnadsställning med en galvanisering strategi2,16. Vi kännetecknas av ställningar biokompatibilitet och optimerad elektriska prekonditionerande egenskaper med hNPCs. Kontroller definierades som ostimulerade stamceller som odlas på en vävnadskultur tallrik.
Olika spänningar utvärderades att avgöra säkerheten för elektrisk stimulering och maximera prekonditionerande effekten. För att säkerställa att fältet tillämpad är samma i varje kammare, resistivitet monterade avdelningen mättes med en multimeter (motstånd (Ohm, Ω) av kamrarna var ca 10 kΩ och resistivity≈3 Ωm). Enligt kommersiella leverantören, har de hNPCs som används visat inga betydande cytotoxicitet i normala kultur system. hNPCs med eller utan exponering för elektrisk stimulering var målat med cell livskraft-analyser (Live: grön; Döda: röd) (figur 2). Dessa resultat tyder på att hNPCs var livskraftig efter elektrisk stimulering (±400 mV, 100 Hz för 1 h). För att validera cell lönsamhet analysen, utfört vi cell genomförbarhet testning med en resazurin-analys. Resultaten visar också inga betydande cytotoxicitet av elektrisk stimulering på hNPCs.
Våra tidigare i vivo data visat att parakrin faktorer frigörs från hNPCs (SD56, NPCs härrör från embryonala stamceller) med en exponering för elektrisk stimulering förbättra återhämtningen efter stroke2. För att vidare utforska kandidat faktorer som är kända att vara viktigt i stroke återvinning som släpps från hNPC (Aruna biomedicinsk, NPCs härrör från embryonala stamceller), utvärderades BDNF och THBS-1. Dessa faktorer har studerats på grund av deras roll i neuronala utväxt och ökad cell-till-cell interaktioner17,18. För att undersöka effekten av elektrisk stimulering på transkriptom förändringar för BDNF och THBS-1, utfördes qRT-PCR inklusive BDNF och THBS-1 gener med GAPDH som en städning-genen. Cirka 1 µg totalt RNA var omvänd-transkriberas till cDNA enligt tillverkarens protokollet. Normaliserade-faldig förändring nyckeltal beräknades genom ΔΔCt metoden jämföra genuttryck i hNPCs på PPy och hNPCs på PPy med en exponering för elektrisk stimulering. Statistisk analys visade betydande upregulations i genuttryck av BDNF och THBS-1 mellan grupper som var elektriskt stimulering beroende (p ≤0.01) (figur 3). Dessa data tyder på att optimering är möjligt att maximera hNPC effektivitet utan betydande celldöd.
Figur 1 . In vitro ledande polymer byggnadsställning system för elektrisk stimulering. (A) en bild kammare är placerad ovanpå PPy plattan. (B) schematiskt visar tillverkning av elektrisk stimulering i vitro kammaren med hNPCs pläterade på ytan av PPy. Vattenflöde ventiler används för att hålla bilden kammaren, PDMS, PPy, och metall tallrik tillsammans. (C) bild av kammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Cell lönsamhet analysen i hNPCs med eller utan elektrisk stimulering. (A) stapeldiagram som visar levande cellen färgas med Calcein-am. Data som presenteras är medelvärde ± S.D.; n = 4. (B) Cell lönsamhet analysen med hjälp av resazurin. Stapeldiagrammet visar fanns ingen cytotoxicitet av elektrisk stimulering på hNPCs; n = 4. (C) bilder av cellernas viabilitet assay före och efter elektrisk stimulering behandling. Grön signal visar levande celler (Calcein-am), medan röd signal indikerar döda celler (EtHD-1). ES anger elektrisk stimulering. ES + eller - indikerar närvaron eller frånvaron av elektrisk stimulering på celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Genförändringar uttryck med elektrisk stimulering. Stapeldiagrammet visar vik förändringar i genuttryck av BDNF (A) och THBS1 (B) i hNPCs (** visar statistiskt signifikant mellan elektriskt betingade och alla andra grupper, p < 0,01, fel barer Visa S.D.; n = 4, envägs ANOVA ). Negativ anger kontrollen där celler odlades på en vanlig vävnadsodling tallrik. ES + eller - indikerar närvaron eller frånvaron av elektrisk stimulering på celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alltfler bevis visat löftet om stamceller som en roman stroke terapi. Detta löfte har resulterat i en stor ansträngning att avancera stamceller therapeutics till sängkanten med minst 40 pågående eller avslutade kliniska prövningar. Stroke patologi erbjuder en unik neurologisk sjukdom som lämpar sig för stamcellsterapi eftersom efter akut förolämpningen, det finns ingen neurodegenerativ process förhindra återhämtning. Den exakta mekanismen för stamceller-förbättrade stroke återvinning är fortfarande oklart. Angiogenes, synaptogenes och synaptic remodeling har alla visat sig vara viktigt. När viktiga molekyler för synaps bildas såsom BDNF och THBS-1 tas bort, är stroke recovery nedsatt6,19. hNPCs har förbättrat funktionell återhämtning efter stroke i många djurmodeller20,21. Mekanismerna i hNPCs effekt fortfarande inte helt klarlagda, och idealisk leveransmetod för dessa celler är okänd. Genom att utveckla ett system som gör att man kan manipulera de viktiga molekyler frigörs från hNPCs, kan man hjälpa skilja mekanismerna som integrerad återhämtning och optimera stamcellsterapi.
Framgångsrik cell leverans till hjärnan fortfarande en utmaning. För närvarande har ett antal tekniker utvecklats med hjälp av olika biomaterial ställningssystem för att leverera stamceller för att förbättra överlevnad och integration av stamceller9,10. På grund av inert egenskaperna hos dessa material är det dock svårt att differentiera stamceller efter sin transplantation.
Denna artikel beskriver en metod där en PPy byggnadsställning elektriskt manipulera transkriptom av hNPCs som visas av uppreglering av BDNF och THBS-1 i våra qRT-PCR-data. Vår tidigare studie avslöjade att en ökning av VEGFA uttryck på hNPCs efter exponering för elektrisk stimulering bättre funktionell återhämtning efter stroke2. Här visar vi att ytterligare neurotrofa faktorer såsom BDNF och THBS-1 också moduleras efter exponering för elektrisk stimulering i en olika hNPC cellinje, visar att vårt system kan användas med flera cellinjer.
Under tillverkning av elektrisk stimulering in vitro- kammaren är det viktigt att metalltråd är helt ansluten till PPy plattan med silver färg och epoxi. Om denna anslutning inte är sund, orsakar det varierande elektriska fält även med samma parametrar. Dessutom kan ibland media läcka efter montering av byggnadsställningar systemet. Lös problemet, kan vakuum fett appliceras för att täta utrymmet mellan PDMS och PPy plattan med vård inte ska tillämpas på cell-sådd ytan. En begränsning på grund av hur icke-transparenta med PPy plattan är att kontrollera cellernas konfluens med standard ljusmikroskopi är begränsad.
Fördelen med den metod som beskrivs i detta protokoll möjliggör modulering av hNPCs för att avgöra de mekanistiska förändringarna av cellerna. Elektriska modulering har för närvarande inte kontaktats med konventionella hydrogel eller inert ställningssystem. Efter elektrisk stimulering använder PPy schavotten, kan hNPCs levereras utan borttagning från polymer ytan till en in-vivo -modell. Utveckla metoder för att ytterligare studera sjukdomsmodeller för stamceller program tillåter oss att bättre design translationella program. Den elektriska prekonditionerande tillvägagångssätt, som möjliggjorts genom ledande polymer systemet, kan tillämpas på olika celltyper och möjliggör bättre förståelse av effekterna av elektrisk stimulering på en cell. Förmågan att optimera de celler in vitro- och sedan utan ytterligare manipulation (t.ex passaging eller borttagning) medger provning av dessa in vitro- manipulationer i i vivo sjukdomstillstånd som stroke. Slutmålet är att utnyttja nya tekniker, såsom beskrivs ledande polymer schavotten, att avancera stroke therapeutics och förbättra förståelsen av stroke recovery mekanismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera med detta arbete.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Kati Andreasson (Institutionen för neurologi och neurologisk vetenskap, Stanford University) för användning av qRT-PCR-maskinen. Arbetet stöds av nationella institut för hälsa bidrag K08NS098876 (till P.M.G.) och Stanford School of Medicine rektorns postdoktorsstipendium (att B.O.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FGF-Basic | Invitrogen | CTP0261 | 20 ng/mL for working media |
| Matrigel | Corning | cb40234a | 1:200 dilution |
| LIF Protein, Recom. Hum. (10 µg/mL) | EMD Millipore | LIF1010 | 10 ng/mL for working media |
| Sylgard 184 silicone 3.9 kg | Fisherbrand | NC0162601 | |
| Hydrochloric acid | Fisherbrand | SA56-4 | |
| Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical | Fisherbrand | SA95 | |
| ITO Glass | Delta Technologies | CG-40IN-0115 | |
| Sodium dodecylbenzenesulfonate | Sigma | 289957-1KG | |
| Pyrrole | Sigma | 131709-500ML | Protect pyrrole solution from light and room temperature |
| 8 well glass slide chambers | Thermo Sci Nuc | 125658 | Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions |
| Flat-Surface Bracket, 3"x1" | McMaster-Carr | 1030A4 | |
| TWO PART SILVER PAINT 14G | Electron Microscopy Sciences | 1264214 | Mix two parts (1:1) in plastic plate |
| DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red | Genesse | 25-508C | |
| AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit | Aruna Biomedical | ABNS7013.2 | |
| hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit | Aruna Biomedical | hNP7013.1 | |
| Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32" to 5/8" Tube OD | McMaster-Carr | 5330K22 | |
| Multimeter | Keysight | E3641A | |
| Wavefoam generator | Keysight | 33210A-10MHz | |
| Pt meshes | Sigma-Aldrich | 298107-425MG | Reference electrode with dimensions, 1x1 cm |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Thermo Fisher Scientific | L3224 | |
| BDNF | Thermo Fisher Scientific | Hs02718934_s1 | |
| THBS1 | Thermo Fisher Scientific | Hs00962908_m1 | |
| GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs02758991_g1 | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen | 74106 | |
| QIAshredder (250) | Qiagen | 79656 | |
| RNase-Free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 µL rxns | BIORAD | 1708891 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4369510 | |
| 7-8 Week Old, male, RNU Rats | NCI-Frederick | ||
| 4-0 Ethicon Silk Suture | eSutures.com | 683G | |
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Surgicel Original Absorbable Hemostat | Ethicon | 1952 | |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat | Stoelting | 51600 | |
| Kimberly-Clark Professional Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves | Fisherbrand | 19-063-130 | |
| Sterile Drape | Medline | DYNJSD1092 | |
| Thermo Scientific Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades | Fisherbrand | 53-34 | |
| Walter Stern Scalpel Blade Series 300 | Fisherbrand | 17-654-456 | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific | 4484642 | |
| Frazier Micro Dissecting Hook | Harvard Apparatus | 52-2706 |
References
- Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
- George, P. M., et al. Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery. Biomaterials. 142, 31-40 (2017).
- Steinberg, G. K., et al. Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study. Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).
- George, P. M., Steinberg, G. K. Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments. Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).
- Schabitz, W. R., et al. Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis. Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).
- Liauw, J., et al. Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).
- Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype. Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).
- Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity. Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
- Ballios, B. G., et al. A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation. Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).
- Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel. Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).
- Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. Implant Biomaterials: A Comprehensive Review. World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).
- Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair. Front Hum Neurosci. 9, (2015).
- Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon. J Vis Exp. (47), (2011).
- Abdelwahid, E., et al. Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair. Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).
- Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem Cells Int. 2015, (2015).
- George, P. M., et al. Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics. Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).
- Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells. J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).
- Lopes, N., et al. Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling. Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).
- Ploughman, M., et al. Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats. Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).
- Baker, E. W., et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model. Sci Rep. 7 (1), 10075 (2017).
- Bacigaluppi, M., et al. Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes. J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).
