I øjeblikket er immunfluorescent farvning på faste celler metoden til bestemmelse af protein udtryk niveauer, når morfologiske oplysninger er også nødvendige. Denne protokol præsenteres heri giver en alternativ metode til immuncytokemi på paraffin-embedded celle blokke.
Immunfluorescent farvning er den foretrukne metode til bestemmelse af protein udtryk niveauer i cellekultur systemer når morfologiske oplysninger er også nødvendige. Protokollen af andre pletter på paraffin-embedded celle blokke, præsenteres heri, er et glimrende alternativ til immunfluorescent farvning på paraffin-integreret fast celler. I denne protokol, en paraffin cellen blok fra HeLa celler blev udarbejdet ved hjælp af metoden tromboplastintid-plasma og immuncytokemi blev udført til vurdering af to spredning markører, CKAP2 og Ki-67. Kerner og cytoplasmatisk morfologi af HeLa celler var velbevarede i celle-blok dias. På samme tid var de CKAP2 og Ki-67 farvning mønstre i immuncytokemi meget lig dem i immunhistokemisk farvning i paraffin kræft væv. Med modificerede cellekultur betingelser, herunder præ-inkubation af HeLa celler serumfrit betingelser kunne effekten evalueres samtidig bevare arkitektoniske oplysninger. Afslutningsvis er immuncytokemi på paraffin-embedded celle blokke et glimrende alternativ til immunfluorescent farvning.
I de fleste laboratorier anvendes paraffin-embedded celle blokke ikke almindeligvis. Tværtimod ansættes fast kulturperler celler, ikke paraffin-embedded celler, i subcellulært lokalisering undersøgelser. De faste kulturperler celler, er fluorescens i stedet for kromogen blevet anvendt. Derfor er immunfluorescent farvning i øjeblikket metoden til bestemmelse af protein udtryk niveauer i forskning beskæftiger celle kulturer1. Dias forberedt til immunfluorescent farvning, dog kan overholdes kun under immunfluorescent mikroskopi, som kan vise billeder helt forskellige fra dem, der er anført under flyet mikroskopi2. Derudover bevarelse af dias til immunfluorescent farvning kræver beskyttelse mod lys og fluorescerende signaler bliver svagere med gentagen eksponering for billedbehandling på grund af tabet af fluorescerende signal3. Resultater fra immuncytokemi på paraffin-embedded celle blokke er meget lig dem fra Immunhistokemi på paraffin-embedded væv4, og de kan let oversættes til kliniske oplysninger. Immuncytokemi kan derfor være et udmærket alternativ. Imidlertid har celle-blok forberedelse ikke været populære i grundlæggende forskningslaboratorier. I denne protokol, derefter, er celle-blok forberedelse og andre farvning fastsat til fremme af anvendelsen af denne metode inden for celle kultur studier.
Celle-blok forberedelse og immuncytokemi er ikke entydige metoder, og de er allerede blevet anvendt fra klinisk diagnose til grundforskning4,5. Selv om forskellige celle-blok forberedelse metoder har været rapporteret4,er6 plasma tromboplastintid-metoden enkel, omkostningseffektiv og let kan tilpasses. Derfor, i den protokol, der præsenteres i dette papir, plasma tromboplastintid-metode4,5,6,7,8 der bruges til forberedelse af paraffin-embedded celle blokke.
I den foreliggende undersøgelse, blev de detaljerede procedurer for udarbejdelse af tromboplastintid-plasma celle blokke og metoden immuncytokemi beskæftiger to spredning markører demonstreret. En markør er cytoskeleton-forbundet protein 2 (CKAP2), som er for nylig blevet rapporteret som en mitotiske markør9,10,11; den anden er Ki-67, som er den mest kendte spredning markør12. Repræsentative ordningen er vist i figur 1.
Immunfluorescent farvning på faste kulturperler celler er i øjeblikket metoden til bestemmelse af protein udtryk niveau i cellerne samtidig bevare morfologiske oplysninger1. Immuncytokemi på paraffin-embedded celle blokke kan dog være et udmærket alternativ. De detaljerede procedurer for udarbejdelse af paraffin-embedded celle blokke og immuncytokemi er blevet beskrevet i denne protokol, og vi håber, det kan lette anvendelsen af immuncytokemi i celle undersøgelser.
Immuncytokemi har flere fordele over immunfluorescent farvning. Immunfluorescent farvning for celler som regel kræver frisk kulturperler celler, men paraffinblokke celle kan opbevares ved stuetemperatur for flere år13. Derudover kan immuncytokemi på celle blokke udforske intracellulære udtryk mønstre ved at ansætte de samme antistof bruges i rutinemæssige Immunhistokemi på humane væv4. Derudover kan det undersøge ændringer i protein niveauer eller posttranslationelle ændringer enten af pre inkubere celler med forskellige stoffer eller under forskellige kultur betingelser11.
I modsætning til fordelene ved andre farvning, udarbejdelse af paraffin-embedded celle blokke tager tid og er dyre14. Også, de fleste forskningslaboratorier mangler erfaring i denne teknik, og tekniske fejl under sådanne omstændigheder er fælles. De mest almindelige fejl er dårlig bevarelse af celle morfologi og dårlig eller uregelmæssig andre farvning på cellen blok paraffinsnit. Disse og de fleste andre kan undgås ved at gøre celle blokke på de bedste betingelser, celle og bruger nok opløsning til at danne celle blodpropper.
Som en demonstration af denne protokol, celle blokke blev udarbejdet for HeLa celler, og andre pletter blev udført to spredning markører, CKAP2 og Ki-67, som tidligere rapporteret11. Immuncytokemi, cellerne blev manipuleret ved inkubering i medier med og uden føtal bovint serum, og effekten af serum sult kunne observeres. Disse tilberedte paraffin-embedded celle blokke kan være ansat for et stort antal af antistoffer, fordi mange dias kan fremstilles af en celle blok ved hjælp af kun en 4-5 µm tykt celle-blok sektion pr. slide. Derfor kan udtrykket mønstre svarende til to forskellige forhold evalueres med flere forskellige antistoffer. Immunfarvning mønstre for CKAP2 og Ki-67 i kræft væv er allerede blevet rapporteret9,10,11,12, og de andre farvning resultaterne kunne vurderes nemt, fordi de farvning mønstre var meget lig dem fra Immunhistokemi.
Afslutningsvis, kan andre farvning på paraffinblokke celle være et glimrende alternativ til immunfluorescent farvning; Desuden, det kan være nemt og pålideligt ansat i grundforskning til udtryk profilering i cellelinjer samtidig bevare morfologiske oplysninger.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger til K.-M.H. fra National Cancer Center, Korea (1510121) og National Research Foundation, Korea (nr. NRF-2015R1A2A2A04007432).
HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
Paraffin | Leica | 39601006 | |
Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
Microscope | Olympus | CX-21 | |
Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |