वर्तमान में, immunofluorescent स्थिर कोशिकाओं पर दाग प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के निर्धारण के लिए पसंद की विधि है जब रूपात्मक जानकारी भी आवश्यक है । इस के साथ प्रस्तुत प्रोटोकॉल आयल पर immunocytochemistry की एक वैकल्पिक पद्धति के लिए प्रदान करता है-सेल ब्लॉक एंबेडेड ।
Immunofluorescent धुंधला वर्तमान में सेल में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के निर्धारण के लिए पसंद की विधि-संस्कृति प्रणालियों जब रूपात्मक जानकारी भी आवश्यक है । immunocytochemical आयल पर दाग-एंबेडेड सेल ब्लॉकों के प्रोटोकॉल, यहां प्रस्तुत, गैर पर धुंधला immunofluorescent के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है-आयल-एंबेडेड फिक्स्ड सेल । इस प्रोटोकॉल में, हेला कोशिकाओं से एक आयल सेल ब्लॉक thromboplastin-प्लाज्मा विधि का उपयोग कर तैयार किया गया था, और immunocytochemistry दो प्रसार मार्करों, CKAP2 और Ki-६७ के मूल्यांकन के लिए प्रदर्शन किया गया था । कक्ष-अवरोधित स्लाइड्स में हेला कक्षों की नाभिक और cytoplasmic आकृतियां अच्छी तरह से संरक्षित की गई हैं । एक ही समय में, CKAP2 और Ki-६७ immunocytochemistry में धुंधला पैटर्न immunohistochemical में उन लोगों के लिए काफी समान थे आयल कैंसर के ऊतकों में धुंधला । संशोधित कोशिका-संस्कृति शर्तों के साथ, सीरम मुक्त शर्तों के तहत हेला कोशिकाओं की पूर्व-मशीन सहित, वास्तु जानकारी के संरक्षण के दौरान प्रभाव का मूल्यांकन किया जा सकता है । अंत में, आयल पर immunocytochemistry-एंबेडेड सेल ब्लॉकों immunofluorescent धुंधला करने के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प है ।
अधिकांश प्रयोगशालाओं में, आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉक आमतौर पर इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं । बल्कि, फिक्स्ड प्रसंस्कृत कोशिकाओं, नहीं आयल-एंबेडेड कोशिकाओं, उपसेलुलर स्थानीयकरण अध्ययन में कार्यरत हैं । उन निश्चित प्रसंस्कृत कोशिकाओं के लिए, chromogen के बजाय प्रतिदीप्ति इस्तेमाल किया गया है. इसलिए, immunofluorescent धुंधला वर्तमान में अनुसंधान सेल संस्कृतियों को रोजगार में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर के निर्धारण के लिए पसंद की विधि है1। immunofluorescent धुंधला के लिए तैयार स्लाइड, तथापि, केवल immunofluorescent माइक्रोस्कोपी के तहत देखा जा सकता है, जो विमान माइक्रोस्कोपी2के तहत संकेत उन लोगों से काफी अलग छवियों को दिखा सकता है. इसके अतिरिक्त, immunofluorescent धुंधला के लिए स्लाइड का संरक्षण चमकदार रोशनी से सुरक्षा की आवश्यकता है, और फ्लोरोसेंट संकेतों फ्लोरोसेंट संकेत के नुकसान के कारण इमेजिंग के लिए दोहराया प्रदर्शन के साथ कमजोर हो3। आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉक पर immunocytochemistry से परिणाम काफी immunohistochemistry से तेल पर एंबेडेड ऊतकों को उन लोगों के समान है4, और वे आसानी से नैदानिक जानकारी में अनुवाद किया जा सकता है । इसलिए, immunocytochemistry एक उत्कृष्ट विकल्प हो सकता है । हालांकि, सेल-ब्लॉक की तैयारी बुनियादी अनुसंधान प्रयोगशालाओं में लोकप्रिय नहीं हुई है । इस प्रोटोकॉल में, फिर, सेल-ब्लॉक तैयारी और immunocytochemical धुंधला सेल-संस्कृति अध्ययन के क्षेत्र में इस पद्धति के उपयोग को बढ़ावा देने के लिए प्रदान की जाती हैं ।
सेल-ब्लॉक तैयारी और immunocytochemistry अद्वितीय तरीके नहीं हैं, और वे पहले से ही नैदानिक निदान से बुनियादी अनुसंधान के लिए लागू किया गया है4,5. हालांकि विभिंन सेल-ब्लॉक तैयारी तरीकों4रिपोर्ट किया गया है,6 thromboplastin-प्लाज्मा विधि सरल, लागत प्रभावी है, और आसानी से अनुकूलनीय है । इसलिए, इस पत्र में प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, thromboplastin-प्लाज्मा विधि4,5,6,7,8 आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉकों की तैयारी के लिए प्रयोग किया जाता है ।
वर्तमान अध्ययन में, thromboplastin-प्लाज्मा सेल ब्लॉकों और दो प्रसार मार्करों को रोजगार immunocytochemistry विधि की तैयारी के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं का प्रदर्शन किया गया । एक मार्कर cytoskeleton-जुड़े प्रोटीन 2 (CKAP2) है, जो हाल ही में एक mitotic मार्कर9,10,11के रूप में सूचित किया गया है; दूसरे एक है Ki-६७, जो सबसे प्रसिद्ध प्रसार मार्कर12है । प्रतिनिधि योजना चित्रा 1में दिखाई गई है ।
Immunofluorescent स्थिर प्रसंस्कृत कोशिकाओं पर दाग वर्तमान में कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर के निर्धारण के लिए विकल्प की विधि है, जबकि रूपात्मक जानकारी1संरक्षण । हालांकि, आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉकों पर immunocytochemistry एक उत्कृष्ट विकल्प हो सकता है । आयल एंबेडेड सेल ब्लॉक और immunocytochemistry की तैयारी के लिए विस्तृत प्रक्रियाओं इस प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है, और हमें उंमीद है कि यह सेल अध्ययन में immunocytochemistry के आवेदन की सुविधा कर सकते हैं ।
Immunocytochemistry immunofluorescent धुंधला पर कई फायदे हैं । कोशिकाओं के लिए Immunofluorescent धुंधला आम तौर पर नए सिरे से प्रसंस्कृत कोशिकाओं की आवश्यकता है, लेकिन आयल सेल ब्लॉक कई साल13के लिए कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है । इसके अतिरिक्त, सेल ब्लॉकों पर immunocytochemistry मानव ऊतकों पर दिनचर्या immunohistochemistry में इस्तेमाल किया एक ही एंटीबॉडी को रोजगार के द्वारा intracellular अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाने कर सकते हैं4. इसके अलावा, यह प्रोटीन के स्तर या posttranslational संशोधनों में या तो विभिन्न दवाओं के साथ या विभिन्न संस्कृति शर्तों के तहत पूर्व-मशीनिंग के द्वारा परिवर्तन का पता लगाने कर सकते हैं11.
immunocytochemical धुंधला के फायदों के विपरीत, आयल एंबेडेड सेल ब्लॉकों की तैयारी में समय लगता है और14महंगा है । इसके अलावा, सबसे अनुसंधान प्रयोगशालाओं इस तकनीक में अनुभव की कमी है, और ऐसी परिस्थितियों के तहत तकनीकी त्रुटियों आम हैं । सबसे आम त्रुटियों सेल आकृति विज्ञान और गरीब या अनियमित immunocytochemical आयल सेल ब्लॉक वर्गों पर दाग के गरीब संरक्षण कर रहे हैं । इन और सबसे दूसरों को सेल ब्लॉक सबसे अच्छा सेल शर्तों के तहत बनाने और पर्याप्त समाधान का उपयोग करने के लिए सेल थक्के फार्म से बचा जा सकता है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल के एक प्रदर्शन के रूप में, सेल ब्लॉकों हेला कोशिकाओं के लिए तैयार थे, और immunocytochemical धुंधला दो प्रसार मार्करों, CKAP2 और Ki-६७ के लिए प्रदर्शन किया गया था, के रूप में पहले11की सूचना दी । immunocytochemistry के लिए, कोशिकाओं के साथ और भ्रूण गोजातीय सीरम के बिना मीडिया में मशीन द्वारा हेरफेर किया गया, और सीरम भुखमरी के प्रभाव को देखा जा सकता है. इन तैयार आयल-एंबेडेड सेल ब्लॉक एंटीबॉडी की एक बड़ी संख्या के लिए नियोजित किया जा सकता है, क्योंकि कई स्लाइड स्लाइड प्रति केवल एक 4-5 µm-मोटी सेल ब्लॉक खंड का उपयोग कर एक सेल ब्लॉक से तैयार किया जा सकता है । इसलिए, अभिव्यक्ति दो विभिंन स्थितियों के अनुरूप पैटर्न कई अलग एंटीबॉडी के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । CKAP2 और कैंसर के ऊतकों में ६७ के लिए immunostaining पैटर्न पहले से ही सूचित किया गया है9,10,11,12, और immunocytochemical धुंधला परिणाम आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है, क्योंकि धुंधला पैटर्न काफी immunohistochemistry से उन लोगों के समान थे ।
अंत में, immunocytochemical आयल सेल ब्लॉकों पर धुंधला दाग immunofluorescent के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प हो सकता है; इसके अलावा, यह आसानी से और मज़बूती से किया जा सकता है रूपात्मक जानकारी के संरक्षण जबकि सेल लाइनों में अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए बुनियादी अनुसंधान में कार्यरत ।
The authors have nothing to disclose.
यह काम K.-M.H. राष्ट्रीय कैंसर केंद्र, कोरिया (१५१०१२१) और नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, कोरिया (सं. के लिए अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । एनआरएफ-2015R1A2A2A04007432) ।
HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
Paraffin | Leica | 39601006 | |
Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
Microscope | Olympus | CX-21 | |
Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |