В настоящее время immunofluorescent окрашивание на фиксированные клетки является методом выбора для определения уровнях выражения протеина при морфологическом информация также необходима. Этот протокол, представленная в настоящем документе предоставляет альтернативный метод immunocytochemistry на ячейку парафин врезанных блоков.
Immunofluorescent окрашивание в настоящее время методом выбора для определения уровнях выражения протеина в системах культуры клеток при морфологическом информация также необходима. Протокол иммуноцитохимическое окрашивания клеток парафин врезанных блоков, представленных в настоящем документе, является отличной альтернативой immunofluorescent окрашивания на не парафин врезанных фиксированные клетки. В этом протоколе парафин ячейки блока от клеток HeLa был подготовлен с использованием метода тромбопластина плазмы, и immunocytochemistry была выполнена для оценки двух маркеров распространения, CKAP2 и Ki-67. Ядра и цитоплазмы морфологию клеток НеЬа были хорошо сохранились в камере слайды. В то же время окрашивания моделей CKAP2 и Ki-67 в immunocytochemistry были очень похожи на тех, кто в иммуногистохимическое окрашивание в парафин ткани рака. С изменение культуры клеток условия, в том числе предварительной инкубации клеток HeLa сыворотки свободных условиях эффект может быть вычислено при сохранении архитектурных информации. В заключение immunocytochemistry на клетки, парафин врезанных блоков является отличной альтернативой для immunofluorescent окраски.
В большинстве лабораторий парафин врезанных клеток блоки обычно не используются. Скорее фиксированный культивируемых клеток, не парафин врезанных клетки, заняты в исследования внутриклеточных локализации. Для тех, кто фиксированной культивируемых клеток был использован вместо хромогена флуоресценции. Таким образом immunofluorescent окрашивание в настоящее время является методом выбора для определения уровнях выражения протеина в исследованиях, используя ячейку культуры1. Слайды, подготовленный для immunofluorescent окрашивание, однако, может наблюдаться только под immunofluorescent микроскопии, который может показывать изображения отличаются от тех, которые указаны в плоскости микроскопии2. Кроме того сохранение слайдов для immunofluorescent окраски требует защиты от яркого света, и флуоресцентные сигналы становятся слабее с повторяющегося воздействия для изображений из-за потери флуоресцентного сигнала3. Результаты от immunocytochemistry на клетки, парафин врезанных блоков очень похожи на тех, от иммуногистохимия парафин врезанных тканей4, и они могут быть легко переведены на клинической информации. Таким образом immunocytochemistry может быть отличной альтернативой. Однако подготовка клетки блок не был популярен в основных исследовательских лабораториях. В этом протоколе затем, клетки блок подготовки иммуноцитохимическое окрашивание предоставляются и содействовать использованию этого метода в области исследований культуры клеток.
Подготовка клетки блок и immunocytochemistry не уникальные методы, и они уже применялись от клинической диагностики для фундаментальных исследований4,5. Хотя различные клетки блок подготовки методы были сообщили о4,6 тромбопластина плазменный метод простой, экономически эффективным и легко адаптируемыми. Таким образом в протоколе, представленных в настоящем документе, тромбопластиновое плазменный метод4,5,6,7,8 используется для приготовления клеток парафин врезанных блоков.
В настоящем исследовании были продемонстрированы подробные процедуры для подготовки тромбопластина плазмы клеток блоков и immunocytochemistry метод, используя два распространения маркеров. Один маркер является белок цитоскелета связанные 2 (CKAP2), который недавно сообщалось как митотической маркер9,10,11; другой-Ki-67, который является известным маркер распространения12. Представитель схема показана на рисунке 1.
Immunofluorescent окрашивания на фиксированные клетки культивировали в настоящее время является методом выбора для определения уровня выражения белка в клетках при сохранении морфологической информации1. Однако immunocytochemistry на клетки, парафин врезанных блоков может быть отличной альтернативой. Подробные процедуры для подготовки клетки парафин врезанных блоков и immunocytochemistry были описаны в настоящем Протоколе, и мы надеемся, что это может облегчить применение immunocytochemistry в ячейке исследований.
Immunocytochemistry имеет ряд преимуществ перед immunofluorescent окрашивание. Immunofluorescent пятная для клеток обычно требует свежих культивируемых клеток, но парафиновые блоки ячеек может храниться при комнатной температуре в течение нескольких лет13. Кроме того immunocytochemistry на ячейку блоки могут исследовать шаблоны внутриклеточных выражений, используя же антитела, используемые в обычных иммуногистохимия на тканях человека4. Кроме того он может исследовать изменения в уровни белка или Посттрансляционная изменений либо по предварительной инкубации клеток с различными препаратами или под различные культуры условия11.
В отличие от преимущества иммуноцитохимическое окрашивание подготовка клетки парафин врезанных блоков занимает время и дорогостоящих14. Кроме того большинство научно-исследовательских лабораторий не хватает опыта в этой технике, и технические ошибки в таких обстоятельствах являются общими. Наиболее распространенные ошибки являются бедные сохранение морфологии клеток и бедных или нерегулярных иммуноцитохимическое окрашивание парафиновых срезах ячейку блока. Эти и многие другие можно избежать, сделав клеток блоков на лучших условиях клетки и используя достаточно решение сформировать ячейку сгустки.
Как проявление настоящего протокола для клеток НеЬа были подготовлены блоки ячеек, и иммуноцитохимическое окрашивание была выполнена для двух маркеров распространения, CKAP2 и Ki-67, как сообщалось ранее11. Для immunocytochemistry клетки были манипулируют инкубации в СМИ с и без плода бычьим сывороточным, и можно наблюдать эффект сыворотки голода. Эти подготовленные ячейки парафин врезанных блоков могут быть использованы для большое количество антител, потому что многие слайды можно приготовить из блока ячейки, используя только 4-5 микрон толщиной клеток-блоке каждого слайда. Таким образом выражение шаблоны, соответствующие два разных условиях может вычисляться с нескольких различных антител. Иммуноокрашивания шаблонов для CKAP2 и Ki-67 в раковых тканей уже сообщили9,10,11,12и иммуноцитохимическое, пятнать результаты можно было бы легко оценить, потому что Окрашивание шаблоны были очень похожи на те, от иммуногистохимия.
В заключение иммуноцитохимическое окрашивание парафиновых блоков ячеек может быть отличной альтернативой immunofluorescent окрашивание; Кроме того она может быть легко и надежно занятых в фундаментальных исследований для выражения профилирования в клеточных линиях при сохранении морфологической информации.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана исследовательских грантов K.-м.х. Национальный онкологический центр, Кореи (1510121) и Национальный исследовательский фонд, Корея (no. NRF-2015R1A2A2A04007432).
HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
Paraffin | Leica | 39601006 | |
Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
Microscope | Olympus | CX-21 | |
Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |