För närvarande är Immunofluorescerande färgning på fasta celler vald analysmetod för bestämning av protein uttryck nivåer när morfologisk information är också nödvändig. Detta protokoll som presenteras häri föreskrivs en alternativ metod för immuncytokemi på paraffin-inbäddat cell block.
Immunofluorescerande färgning är för närvarande metoden för bestämning av protein uttryck nivåer i cellkultur system när morfologisk information är också nödvändig. Protokollet av immunocytochemical färgning på paraffin-inbäddat cell block, presenteras häri, är ett utmärkt alternativ till Immunofluorescerande färgning på icke-paraffin-inbäddat fast celler. I detta protokoll, ett paraffin cell block från HeLa cells var beredd med metoden thromboplastin-plasma och immuncytokemi utfördes för utvärdering av två markörer för spridning, CKAP2 och Ki-67. De kärnor och cytoplasmiska morfologi av HeLa cellerna var väl bevarad i de cell-block-bilderna. Samtidigt var CKAP2 och Ki-67 färgning mönstren i immuncytokemi ganska liknande dem i immunhistokemisk färgning i paraffin cancer vävnader. Med modifierad cell-kultur villkor, inklusive före inkubering av HeLa cells serumfritt villkor kunde effekten utvärderas samtidigt bevara arkitektoniska information. Sammanfattningsvis är immuncytokemi på paraffin-inbäddat cell block ett utmärkt alternativ till Immunofluorescerande färgning.
I de flesta laboratorier används paraffin-inbäddat cell block vanligtvis inte. Snarare, fast odlade celler, inte paraffin-inbäddat celler, anställda i subcellulär lokalisering studier. För de fasta odlade celler, har fluorescens i stället för kromogen använts. Immunofluorescerande färgning är därför för närvarande vald analysmetod för bestämning av protein uttryck nivåer i forskning som sysselsätter cell kulturer1. Bilder förberedd för Immunofluorescerande färgning, kan dock observeras endast under Immunofluorescerande mikroskopi, som kan visa bilder helt annorlunda än de som anges under planet mikroskopi2. Dessutom bevarandet av diabilder för Immunofluorescerande färgning kräver skydd från ljus och fluorescerande signaler blir svagare med upprepad exponering för imaging på grund av förlusten av den fluorescerande signal3. Resultat från immuncytokemi på paraffin-inbäddat cell block är ganska lika de från immunohistokemi på paraffin-inbäddat vävnader4, och de kan enkelt översättas till klinisk information. Immuncytokemi kan därför vara ett utmärkt alternativ. Dock har cell-block beredning inte varit populära i grundläggande forskningslaboratorier. I detta protokoll, sedan ingår cell-block förberedelse och immunocytochemical färgning för att främja användningen av denna metod i fältet i cell-kultur och samhälle.
Cell-block förberedelse och immuncytokemi är inte unika metoder, och de har redan tillämpats från klinisk diagnos till grundforskning4,5. Även om olika cell-block förberedelse metoder har varit rapporterade4,är6 thromboplastin-plasma metoden enkel, kostnadseffektiv och lätt anpassningsbar. Därför i det protokoll som presenteras i detta papper, tromboplastintid-plasma metod4,5,6,7,används8 för beredning av paraffin-inbäddat cell block.
I den aktuella studien visades de detaljerade förfarandena för utarbetande av thromboplastin-plasma cell block och metoden immuncytokemi sysselsätter två spridning markörer. En markör är cytoskelettet-associerade protein 2 (CKAP2), som nyligen har rapporterats som en mitotiska markör9,10,11. den andra är Ki-67, som är den mest kända spridning marker12. Det representativa systemet visas i figur 1.
Immunofluorescerande färgning på fasta odlade celler är för närvarande metoden för bestämning av protein uttryck nivå i celler samtidigt bevara morfologisk information1. Immuncytokemi på paraffin-inbäddat cell block kan dock vara ett utmärkt alternativ. De detaljerade förfarandena för utarbetande av paraffin-inbäddat cell block och immuncytokemi har beskrivits i detta protokoll, och vi hoppas det kan underlätta tillämpningen av immuncytokemi i cellstudier.
Immuncytokemi har flera fördelar över Immunofluorescerande färgning. Immunofluorescerande färgning för celler vanligtvis kräver färska odlade celler, men cellen paraffinblock kan förvaras i rumstemperatur i flera år13. Dessutom kan immuncytokemi på cell block utforska intracellulära uttrycksmönster anställa samma antikropp används i rutinmässiga immunohistokemi på mänskliga vävnader4. Det dessutom kan utforska förändringarna i proteinnivåer eller posttranslationell ändringar antingen genom före ruvning celler med olika droger eller under olika kultur villkor11.
I motsats till fördelarna med immunocytochemical färgning, beredning av paraffin-inbäddat cell block tar tid och är kostsamt14. Även de flesta forskningslaboratorier saknar erfarenhet i denna teknik och tekniska fel under sådana omständigheter är vanliga. De vanligaste felen är dålig bevarandet av cellmorfologi och dålig eller oregelbundna immunocytochemical färgning på avsnitten paraffin cell block. Dessa och de flesta andra kan undvikas genom att göra cell block under bästa cell och använda tillräckligt lösning för att bilda cell blodproppar.
Som en demonstration av detta protokoll, cell block var förberedda för HeLa cells och immunocytochemical färgning utfördes för två markörer för spridning, CKAP2 och Ki-67, som tidigare rapporterats11. Cellerna var manipulerade genom inkubation i media med och utan fetalt bovint serum immuncytokemi, och effekten av serum svält kunde observeras. Dessa beredda paraffin-inbäddat cell block kan användas för ett stort antal antikroppar, eftersom många bilder kan framställas från en cell block med endast en 4-5 µm tjock cell-block avsnitt per bild. Uttrycksmönster motsvarar två olika villkor kan därför utvärderas med flera olika antikroppar. Immunfärgning mönster för CKAP2 och Ki-67 i cancer vävnader har redan rapporterat9,10,11,12, och den immunocytochemical färgning resultat kunnat utvärderas enkelt, eftersom den färgning mönster var ganska liknande till de från immunohistokemi.
Avslutningsvis kan immunocytochemical färgning på paraffin cell block vara ett utmärkt alternativ till Immunofluorescerande färgning; Dessutom, det kan vara enkelt och pålitligt anställd i grundforskning för uttryck profilering i cellinjer samtidigt bevara morfologisk information.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av forskningsanslag till K.-M.H. från National Cancer Center, Korea (1510121) och National Research Foundation, Korea (nr. NRF-2015R1A2A2A04007432).
HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
Paraffin | Leica | 39601006 | |
Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
Microscope | Olympus | CX-21 | |
Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |