Summary
Este artigo descreve a metodologia detalhada para preparar uma matriz multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) para manipulação de alta produtividade de física e química sugestões imitando na vivo o microambiente celular e para Identifica o ambiente celular ideal para as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) com perfis de célula única.
Abstract
Microambiente celular consiste em uma variedade de pistas, como fatores de crescimento, matrizes extracelulares e interações intercelulares. Estes tacos são bem orquestrados e são fundamentais na regulação de funções de células em um sistema vivo. Embora um número de pesquisadores tentaram investigar a correlação entre fatores ambientais e funções celulares desejadas, muito permanece desconhecido. Isto é principalmente devido a falta de uma metodologia adequada para imitar tais pistas ambientais em vitroe testar simultaneamente diferentes pistas ambientais nas células. Aqui, nós relatamos uma plataforma integrada de canais microfluídicos e uma matriz de nanofibras, seguido de análise de célula única de alto teor, para examinar células estaminais fenótipos alterados por fatores ambientais distintas. Para demonstrar a aplicação desta plataforma, este estudo centra-se sobre os fenótipos de self que renova as células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Aqui, apresentamos os procedimentos de preparação para uma matriz de nanofibras e a estrutura de microfluidic na fabricação de uma matriz de multiplexado Artificial celular microambiente (MACME). Além disso, as etapas gerais da único-célula de criação de perfil, pilha que mancha com vários marcadores fluorescentes, várias imagens de fluorescência e análises estatísticas, são descritas.
Introduction
De1,(hPSCs) as células-tronco pluripotentes humanas2 auto renovar ilimitadamente e se diferenciar em várias linhagens de tecido, que poderiam revolucionar o desenvolvimento de drogas, terapias baseadas em células, engenharia de tecidos e medicina regenerativa 3 , 4 , 5 , 6. pratos de cultura geral e placas de microtitulação, no entanto, não são projetadas para permitir a manipulação de célula precisa de física e química a nível celular, com o intervalo de nano - para micrometros, que é um fator crítico para a expansão celular, auto-renovação e diferenciação. Para resolver este inconveniente, estudos têm investigado os papéis do microambiente celular na regulação da célula-destino decisões e célula funções4. Nos últimos anos, um número crescente de estudos têm sido realizado para reconstruir o microambiente celular em vitro7,8. Processos de fabricação de micro e nano estabeleceram esses microambiente através da manipulação de químicos9,10,11,12,13, 14,15,16,17 e19,de física18,20 pistas ambientais. Até agora, não havia nenhum relatórios sistematicamente, investigar os mecanismos subjacentes de pistas ambientais físicas e químicas na célula destino decisões e funções dentro de uma única plataforma.
Aqui, apresentamos uma estratégia baseada em princípios de design simples, para estabelecer uma plataforma robusta de triagem (Figura 1). Primeiro, descrevemos o processo de desenvolvimento de uma plataforma integrada para a criação artificial, versátil microambiente celular usando uma matriz de nanofibras e uma estrutura de microfluidic: matriz de The multiplexado Artificial celular microambiente (MACME) (Figura 1A e 2A). A matriz de nanofibras tem 12 microambiente diferentes em diferentes combinações de materiais de nanofibras e densidades. Eletrofiação foi usada para fabricar nanofibras. Os materiais de nanofibras, tais como o poliestireno (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22e gelatina (GT)23, foram projetados para testar suas propriedades químicas, que podem afetar a aderência de célula e manutenção da pluripotência ( Figura 2B). Densidades de nanofibras eram variadas, alterando o tempo de eletrofiação e as gerado nanofibras foram definidas de acordo com suas densidades (DNF, com D = XLow/Low/Mid/High). A estrutura de microfluidic é composta de polidimetilsiloxano (PDMS), abrigando 48 câmaras de cultura de células, que podem ser posicionadas junto as dimensões padrão de microplacas de 96 poços. PDMS é um polímero biocompatível e gás-intercambiáveis, geralmente usado para fabricar de dispositivos microfluídicos24. Cada canal microfluidic foi projetado para ser 700-µm de largura e 8,4 mm de comprimento e tinha duas entradas em suas bordas (tabela 1). As câmaras tinham diferentes alturas (250, 500 e 1000 µm) para manipular as iniciais célula-semeadura densidades (0.3, 0.6 e 1.2 × 105 células/cm2), que podem correlacionar com a sobrevivência, proliferação e diferenciação de hPSCs25 (Figura 2C). O número de células semeado em uma câmara é proporcional a densidade da coluna acima do piso da câmara, e, portanto, célula inicial, densidade de semeadura era controlada por introduzir a mesma suspensão de eritrócitos em câmaras de cultura com diferentes alturas. Todos os canais foram projetados para serem ≥ 250 µm-alta26 para minimizar os efeitos da tensão de oxigênio baixo27 e tensão de cisalhamento28 sobre as células. Alturas de canal de 250, 500 e 1000 µm são abreviadas aqui como XCD com X = Low, Mid e alta, respectivamente. Os ambientes com nanofibras distintas densidades e densidades de semeadura de células iniciais foram encurtados como "Densidade de density_Cell de Material_NF" (por exemplo, GT_HighNF_HighCD: um ambiente caracterizado por nanofibras GT de alta densidade e alta inicial célula-semeadura densidade).
Posteriormente, descrevemos como executar análises de célula única para investigar sistematicamente o comportamento da célula em resposta a fatores ambientais (Figura 1B). Como um prova de conceito, identificamos o ambiente celular ideal para hPSC auto-renovação, que é uma função chave para hPSC manutenção (Figura 1B)29. Citometria baseada em imagem, seguida de análises estatísticas, permite a interpretação quantitativa de respostas fenotípicas celulares individuais para ambientes celulares. Entre uma variedade de funções celulares, este artigo fornece um procedimento detalhado para identificar as condições ideais para a manutenção de hPSC auto-renovação.
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Protocol
1. fabricação de matriz MACME
Nota: Todos os materiais e equipamentos estão listados na tabela de materiais.
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Elaboração de máscaras para uma matriz de nanofibras e um molde para uma estrutura microfluídicos
- Crie imagens de tridimensionais (3D) de máscaras usadas para as matrizes de nanofibras e moldes para estruturas microfluidic usando pacotes de software 3D-computação gráfica (tabela 1).
Nota: As imagens 3D são lidos e impressos por uma impressora 3D. O impresso de máscaras e molde têm as mesmas dimensões com imagens 3D, definidas usando o software de gráficos no passo 1.1.1. - Imprima máscaras e um molde baseado sobre estes projetos usando uma impressora 3D.
Nota: Neste protocolo, uma impressora de jato de tinta-como 3D com resina UV-curable foi usado30. A resolução da impressora foi 635 × 400 dpi e 15 µm em X, Y e Z, respectivamente, no entanto, o real X, Y resolução foi aproximadamente quatro vezes inferior.
- Crie imagens de tridimensionais (3D) de máscaras usadas para as matrizes de nanofibras e moldes para estruturas microfluidic usando pacotes de software 3D-computação gráfica (tabela 1).
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Preparação de nanofibras-matriz (Figura 3A)
- Prepare soluções de polímero para eletrofiação.
- Dilua o líquido PMGI 13% com tetrahidrofurano de 9% (p/v)22.
- Dissolver 0,08 g de PS (peso molecular de número médio (Mn): 130.000) em THF:dimethylformamide (relação de volume de 1:1),21e adicionar THF:dimethylformamide para trazer o volume até o final 1 mL (solução a 8% (p/v) PS).
- Dissolver 0,1 g de GT na água: ácido acético: etil acetato de (relação de volume de 1:1.6:2.1) e adicionar água: acetato do ácido acético: etílico para trazer o volume até o final 1 mL (solução a 10% (p/v) GT) como descrito23,31.
- Use um magnetron sputtering máquina, depositar uma fina camada de platina com uma espessura de 5 nm em um poliestireno (PS) placa base (127,7 × 85,5 mm), que serve como um cátodo na configuração da eletrofiação.
- Carrega cada solução de polímero em uma seringa de 5 mL, equipada com uma agulha 23-G aço inoxidável.
- Lugar e a seringa com a agulha em uma bomba de seringa com 12 cm para além do coletor do dispositivo eletrofiação de âncora.
- Conectar a agulha da seringa para uma fonte de alimentação de alta tensão e definir para aplicar a 11 kV.
- Defina a taxa de bombeamento de 0,2 mL/h.
- Manter a temperatura e umidade em 30 ° C e 30 < % (v/v).
- Coloque a máscara sobre a placa de base preparada no passo 1.2.2.
- Fabricar nanofibras na placa de base através dos furos da máscara com densidades distintas, alterando o tempo de eletrofiação (por exemplo, 20, 60, 90 e 180 s).
- Remova a máscara da placa de base.
Nota. Etanol pode ser pulverizado sobre as electrospun GT nanofibras antes de remover a máscara para evitar descascando GT nanofibras juntamente com a máscara. - Repita o passo 1.2.4-1.2.10 até a conclusão da fabricação de nanofibras-matriz.
- Coloca a matriz de nanofibras num exsicador a 25 ° C, durante 16 h para evaporar o solvente restante.
- Crosslink GT nanofibras com 0,2 M 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida cloridrato (EDC) e 0.2 M N-Hidroxisuccinimida (NHS) em etanol a 25 ° C, durante 4 h23.
- Enxágue o GT nanofibras duas vezes com etanol 99,5% (v/v) e vácuo-seco a 25 ° C, durante 16 h.
- Prepare soluções de polímero para eletrofiação.
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Fabricação de estruturas de microfluidic (Figura 3B)
- Misture 2 g de PDMS cura agente e 20 g de base PDMS (01:10 peso ratio; Pre-PDMS). 24
- Despeje a mistura de pre-PDMS para o molde fabricado na etapa 1.2.
- De gás da mistura pre-PDMS em um dessecador por 30 min.
- Cure a mistura pré-PDMS em estufa a 65 ° C durante 16 h.
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Matrizes de montagem de MACME (Figura 3B)
- Descole a estrutura PDMS curada no passo 1.3.4 do molde e limpo com álcool etílico 70% (v/v).
- Trate a descarga de corona atmosférica no lado inferior da estrutura PDMS32.
Nota: Neste protocolo, a corona é alta em toda a superfície de uma camada de 3 ou 4 vezes com um aparelho de descarga de corona "Handy". Tratamento de plasma de oxigênio foi substituído com a descarga de corona atmosférica para alterar a aderência a superfície. - Monte a estrutura PDMS com a matriz de nanofibras rapidamente.
- Forno-asse a 65° C por 2 dias.
2. carregar hESCs na matriz de MACME
- Para a cultura rotineira de H9 células estaminais embrionárias humanas (hESCs), manter as células em xeno-livre quimicamente definidas meio de cultura para hPSC manutenção33 suplementado com 10 µM Y-27632 ROCK inibidor34 (chamado hPSC médio) em uma cultura de pilha 35mm prato revestido com membrana basal matriz do gel (MG).
- Células de passagem em 4 a 7 dias usando uma protease tripsina recombinante.
- Esterilizar uma matriz MACME com 99,5% de etanol, por carregamento para as câmaras por 10 min e em seguida, remover o etanol. Repita este passo 3 vezes.
- Introduzir a 12 µ l de MG, 10 µ g/mL vitronectina (VN), e 0,1% (p/v) GT em controle de câmaras de cultura e incubar as câmaras a 37 ° C por 1 h para revesti-los sobre as superfícies da câmara.
Nota: Neste protocolo, MG, VN e GT foram selecionados como proteínas de referência para a aderência de célula e cultura. Porque MG e VN são matrizes de cultura de pilha padrão usadas para a manutenção de hPSC auto-renovação, eles são usados como controles positivos; revestimento de GT bidimensional (2DGT) ou não-revestimento (NC) foram usados como controles negativos. - Médio pré-aquecido hPSC Introduza todas as câmaras da matriz MACME. Incubar as câmaras por 30 min a 37 ° C.
- Lave H9 hESC cultivada em um prato de 35 mm com DPBS, adicionar 0,5 mL de uma protease tripsina recombinante para o prato e incubar a 37 ° C por 1 min e Aspire cuidadosamente com apenas os sobrenadantes misturados com protease.
Nota: Na etapa de aspiração, as células não são desanexadas. - Imediatamente adicione o hPSC médio, suavemente, dispense o meio contra a superfície do prato repetidamente para dissociar as células e transferir as células destacadas para um tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugar a 200 x g, durante 3 min. Aspire o sobrenadante e suspender as células em um meio hPSC previamente aquecido.
- Introduza cada câmara microfluidic 12 µ l da suspensão celular (1,2 × 106 células/mL).
Nota: Apresente células numa câmara de outro utilizando uma micropipeta. Porque o número de células semeado de câmaras é proporcional a densidade da coluna acima do piso da câmara, a densidade celular-semeadura inicial podia ser controlada mesmo que utilizaram-se amostras da mesma suspensão celular. Certifique-se de pipetagem é feito delicadamente. Remova o excesso de meio das câmaras de usando um bastão com ponta de algodão após o carregamento. A matriz MACME é compatível com pipetas de laboratório comumente usados e sistemas automatizados de pipeta, e não exige qualquer equipamento especial. - Mude hPSC médio cada 12 h e cultura por 4 dias.
Nota: Volumes constantes do meio (1.6, 3.2 e 6.4 µ l) são mantidas por meio de câmaras de tamanhos distintos. Células de cultura sob uma condição estática para minimizar a tensão de cisalhamento, exceto para a troca do meio de cultura celular35,36.
3. quantitativa única célula de criação de perfil
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Na chapa de Coloracao Celular fluorescente
Nota: para analisar as alterações fenotípicas de auto renovação hPSCs, este protocolo selecionado três marcadores fenotípicos chaves para este protocolo: OCT4, 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) e anexina V, para medir o status de pluripotência, proliferação e apoptose , respectivamente (Figura 2b). 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) é usado para identificar o núcleo de células. OCT4 é um dos fatores críticos da transcrição de pluripotência.- Incube H9 hESCs em matrizes MACME no hPSC suplementado com 10 alquino de EdU µM a 37 ° C por 30 min.
- Após a lavagem com tampão de ligação anexina (10 mM HEPES (pH 7,4), 140 mM de NaCl, 2,5 mM CaCl2), mancha as células com um conjugado fluorescente laranja tintura-anexina V a 20 ° C por 15 min.
- Corrigir células em PBS com paraformaldeído 4% (v/v) a 20 ° C por 15 min e depois enxaguar células com PBS duas vezes.
- Permeabilize pilhas usando PBS com 0,3% (v/v) Triton X-100 a 20 ° C, durante 16 h.
Nota: Paraformaldeído enfraquece o vínculo entre uma placa base de plástico e uma estrutura de microfluidic PDMS. Assim, o desprendimento da camada de matriz em passo 3.2.1 PDMS também pode ser realizado logo após esta etapa. - Incube as células no buffer Tris base reação com uma azida de corante fluorescente-vermelho a 20 ° C por 30 min.
- Incube as células em tampão de bloqueio (PBS com soro de cabra normal de 5% (v/v), soro de burro normal de 5% (v/v), albumina de soro bovino de 3% (p/v), 0,1% (v/v) Tween-20 e 0,1% (p/v) N-dodecil-β-D-maltoside), a 4 ° C, durante 16 h.
- Incube em PBS com 0,5% (v/v) solução Triton X-100 e anticorpo humano OCT3/4 (IgG de rato) a 4 ° C, durante 16 h.
- Incube em tampão de bloqueio com anti-rato verde-fluorescente tingir-etiquetados burro IgG (H + L) a 37 ° C por 60 min.
- Incube em PBS com DAPI a 20 ° C por 30 min.
- Substitua PBS, PBS-DAPI.
- Preserve a matriz MACME a 4 ° C até a aquisição de imagens.
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Aquisição de imagem (Figura 4)
- Descole a estrutura de microfluidic PDMS da matriz MACME.
- Remover a PBS residual da matriz MACME, aplicam-se às células 90%(v/v) glicerol em PBS e coloque lamelas sobre as células manchadas.
- Coloque a placa de cabeça para baixo no palco de um microscópio de fluorescência invertido.
- Adquira imagens de 12 bits cor automaticamente usando todos os componentes motorizados (palco, filtros, obturador e foco sistemas) que eram controlados por um software de imagem de microscópio.
Nota. Neste protocolo, os tempos de exposição são ajustados para chegar perto de valores de intensidade máxima (maior intensidade do pixel: 4096), mas sem saturação, para cada imagem, DAPI, OCT4, anexina V e EdU.
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Processamento de imagem guiada por computador e fluorescência sinal quantificação (Figura 5)
Nota: a seguinte análise de imagem de célula é realizada com base em um método descrito anteriormente,37.- Converta imagens coloridas em tons de cinza.
- Calcular um valor de limite único para cada imagem DAPI com o método de Otsu e classificar pixels acima do limiar, como primeiro plano e abaixo como pano de fundo. Certifique-se de que o valor de primeiro plano corresponde à intensidade fluorescente da DAPI.
Nota: O processo de análise de imagem contém 5 passos; identificação de objetos primários na DAPI imagens, identificação de objetos secundários em OCT4, anexina V e imagens de EdU, respectivamente e a medida da intensidade de objeto. A Figura 3 fornece as imagens da interface de usuário gráfica (GUI) na configuração de processamento de imagem. - Medir as intensidades fluorescentes de OCT4 e EdU em cada imagem.
- Identificar a região manchada com anexina V com o método de propagação e quantificar a intensidade fluorescente.
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3.4. análise estatística para visualizar fenótipos celulares individuais de célula única de imagens
- Normalize as intensidades fluorescentes entradas de cada marcador fenotípico pela centralização e dimensionamento destas variáveis para dar-lhes peso igual.
- Realizar análise de mapa (SOM) auto-organização, usando um ambiente de software para computação estatística e gráficos conforme descrito por anteriores estudos38,39.
- Crie 25 nós SOM com distintivo quatro "codebook vetores" correspondente para as intensidades fluorescentes de quatro marcadores, DAPI, EdU, anexina V e OCT4.
- Atribuir células individuais em cada microambiente para um nó (mais parecido) "vencedora" e traçar como frequência de celular, segundo a qual os vetores de livro de códigos do nó vencedora são atualizados usando uma média ponderada, onde o peso é a taxa de aprendizagem (aqui, 0,05 como padrão).
Nota: Omita dados das câmaras contendo menos de 1.000 células por conjuntos de dados que contém algumas células não apresentaram resultados estatisticamente relevantes do SOM.
- Realize sem supervisão de clustering hierárquico com os valores de nó de SOM usando o método média-enlace baseado na correlação de Pearson de um cluster de software40.
- Processar os dados do clusters no dendrograma e heatmap visualizações41.
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Representative Results
Matrizes MACME: projeto e fabricação: Em combinação com a tecnologia de nanofibras, usamos microfluidic cultura de pilha e triagem técnicas empregadas anteriormente para identificar condições óptimas para hPSC auto-renovação ou diferenciação35,36 (Figura 1). Isto é bem adequado para o estabelecimento de ensaios robustos de cell-based do elevado-throughput porque as câmaras da cultura celular e as condições são precisamente controlável e expansível42,,43,44. Aqui, a matriz de nanofibras foi preparada por um método de deposição de nanofibras simples, eletrofiação com máscaras 3D-impresso. A parte de microfluidic foi fabricada com um molde 3D-impresso facilmente projetar a estrutura da câmara através de muitos ensaios e erros. A matriz MACME foi construída, combinando as duas partes e continha 48 ambientes, fornecendo diferentes pistas biofísicas e bioquímicas diferentes combinações de ambas as nanofibras ECMs (3 tipos de materiais de nanofibras e 4 diferentes densidades ou controle 4 proteínas da matriz) e interações célula-célula (3 gamas de densidade celular-semeadura inicial), como mostrado na Figura 2.
Avaliação dos efeitos globais da densidade celular e propriedades de nanofibras na hESC fenótipos: Seguindo a cultura de células em uma matriz MACME e na chapa de coloração fluorescente (Figura 6A), foram realizadas medidas de célula única com as imagens adquiridas. Para comparar a homogeneidade e a heterogeneidade dos níveis de expressão para os quatro marcadores fenotípicos em cada conjunto de dados, este protocolo utilizado SOM análise38,,39, que converte os conjuntos de dados em alta-dimensional, Multiparamétrico baixo-dimensional mapas 2D. Nomeadamente, os resultados das matrizes de nanofibras e 2DGT do PS foram omitidos nesta análise tendo em conta que a maioria das células não se aderiu. Além disso, excluídas desta análise foram esses experimentos com baixa CD onde as células não têm bastante direta (por exemplo, justácrina) ou indiretos (parácrina) interações para sobreviver. Após análise do SOM, sem supervisão de clustering hierárquico foi realizada para os nós SOM de todas as amostras analisadas (Figura 6B). Considerando a altura da dendrograma de cluster, as diferenças fenotípicas nos permitiram categorizar as amostras em três grupos: grupo i, a maioria da nichos de amostra composta de GT nanofibras, MG_HighCD e VN_HighCD; Grupo ii, amostras contendo GT nanofibras (GT_XLow e MidNF_MidCD), MG_MidCD ou VN_MidCD; e grupo iii, todas as amostras PMGI_NF.
Para estudar as diferenças entre os grupos, examinamos uma amostra representativa de cada grupo (Figura 6C; Grupo i-GT_MidNF_HighCD, grupo ii-GT_MidNF_MidCD e grupo iii-PMGI_MidNF_HighCD). Em termos de sinais de OCT4, todos os grupos mostraram uma expressão mais elevada do que a de MG (MG_MidCD). Grupo que foi caracterizado pela alta EdU sinais, indicando que a maioria das células ativamente foram proliferando. Assim, o microambiente no grupo que foram caracterizados como condições adequadas para a manutenção do hPSC porque hPSCs indiferenciados normalmente se proliferam rapidamente quando as fases de abertura do ciclo celular foram encurtado45,46.
GT_MidNF_HighCD e GT_MidNF_MidCD são distinguidos por suas distintas densidades de célula-carregamento iniciais. Densidades de pilha inicial elevada aumentaram as oportunidades das células para interagir com as células vizinhas, que reforçada a sua sobrevivência e proliferação de47. As células semeadas em uma densidade inicial insuficiente (3,0 × 104 células/cm2) sobreviveram nem cresceram durante o período experimental (4 dias). Portanto, nós não fez incorporar estas amostras em análise o SOM; número de células foram abaixo o limite de vida de 1000 células/câmara. As células em andaimes 2DGT também foram categorizadas como pilhas do grupo ii; Estas condições não suportam hPSC auto-renovação48. Sinal de EdU das células GT_MidNF_MidCD foi perdido e níveis anexina V aumentaram ligeiramente, indicando que as células tinham perdido suas stemness e tornam-se gradualmente apoptotic. PMGI_MidNF_HighCD, que representa o microambiente composto por matrizes de nanofibras PMGI, mostrou as maiores variações em sinais OCT4 e EdU, em comparação com as outras condições.
Figura 1 . Estratégia para identificar o microambiente celular ideal para regular as funções celulares de triagem. (A) visão geral dos componentes da matriz microambiente celular artificial multiplexado (MACME). A matriz é composta de duas partes principais: camas de nanofibras modelado sobre um substrato basal (matriz de nanofibras) e um polydimethylsiloxane (PDMS)-baseado microfluidic estrutura. A matriz MACME é capaz de preparar ECMs nanofibras com uma variedade de recursos (ou seja, materiais de nanofibras e densidades) e célula de várias densidades de semeadura. A estrutura de microfluidic PDMS da matriz MACME apresenta três alturas de canais microfluídicos (250, 500 e 1000 µm) para regular a densidade de semeadura de célula inicial. (B) o impacto do microambiente celular em fenótipos de célula é avaliada quantitativamente usando um ensaio de célula única baseada em imagem e a análise de dados estatísticos, utilizando o mapa de auto-organização (SOM) seguido de clustering hierárquico. Esta figura era adaptada de referência49 com a permissão de Wiley. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Projeto da matriz MACME. (A) sobrecarga e tiros de alta-ângulo de toda a matriz MACME e o diagrama conceitual de um canal de microfluidic (luz azul) em uma matriz de nanofibras (rosa). Cada canal é composto por um 700 µm de largura e câmara de cultura longa 8,4 mm e duas entradas para a introdução do meio e as células. (B) comparação de tamanhos de células e matrizes de nanofibras. As alturas das células e camas de nanofibras variam de 1-3 µm e 0,05-5.0 µm, respectivamente. (C) uma seção transversal de cada canal microfluidic com uma altura de 250/500/1000 µm. Células e camas de nanofibras são representadas como círculos azuis e laranja linhas, respectivamente. Cada câmara tem a mesma largura e comprimento mas diferentes alturas (250, 500 e 1000 µm), e cada volume de câmara era 1.6, 3.2 e 6.4 µ l, respectivamente. O retângulo pontilhado preto na Figura 2C denota Figura 2B. Figura 2 foi adaptado de referência49 com a permissão de Wiley. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Fabricação de matriz MACME. (A) fabricação de uma matriz de nanofibras. Padronização de várias matrizes de nanofibras sobre uma placa de base foi realizada por eletrofiação modificada usando um conjunto de máscaras com furos estampados. Revestimento de platina foi realizado para facilitar a deposição de nanofibras sobre uma placa de base plástica. As máscaras com furo-padrões distintos foram preparadas por uma impressora 3D. Sequência de mascaramento da área platina-revestido da placa, o conjunto placa-máscara foi colocado na tela de coleção, e normal eletrofiação foi realizada. As iniciais nanofibras formaram-se nas posições Pt-revestido da placa através dos furos na máscara. Camas de nanofibras adicionais foram fabricadas na placa substituindo a máscara existente e repetir o procedimento. (B) fabricação de uma estrutura de microfluidic. O molde imprimido por uma impressora 3D com resina UV-curable em forma de camada do dispositivo microfluidic de PDMS. Após a fundição, a matriz MACME foi montada por anexar uma camada baseada em PDMS microfluidic com uma matriz de nanofibras de superfície está ativado. Figura 3 foi adaptado de referência49 com a permissão de Wiley. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Imagens de interfaces gráficas do usuário (GUI) para aquisição de imagens microscópicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Imagens de interfaces gráficas do usuário (GUI) de computador-guiada processamento de imagem para fenotipagem de célula única. O processo de análise de imagem contém 5 passos; (A) identificação de objetos primários na DAPI imagens, (B-D) identificação de objetos secundários em OCT4, Annexin V e imagens de EdU, respectivamente e a medida da intensidade de objeto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Fenotipagem e classificação dos fenótipos de H9 hESCs alterada por fatores microenvironmental. Imagens de imunofluorescência (A) de hESCs H9 cultivadas em alta densidade de semeadura inicial na gelatina (GT) nanofibras (GT_HighNF_HighCD), corados com marcadores fenotípicos celulares três (OCT4, pluripotência; EdU, proliferação celular; Anexina V, apoptose) e DAPI para núcleos de célula. (B) um heatmap e dendrograms de clusterização hierárquica sem supervisão. O microambiente testadas foram categorizados em três grupos com características distintas, com base em semelhanças entre os fenótipos. Grupo incluí GT nanofibras, MG_HighCD e VN_HighCD. Grupo ii consistiu em amostras de nanofibras GT (GT_XLow e MidNF_MidCD), MG_MidCD, ou VN_MidCD. Todas as amostras PMGI_NF foram agrupadas no grupo iii. No heatmap, cores rosa e azuis indicam frequências altas e baixas celulares em parcelas de contagem SOM, respectivamente. (C) distribuição de níveis de expressão quantificada marcador de 1000 células em uma amostra representativa de cada grupo (grupo i-GT_MidNF_HighCD, grupo ii-GT_MidNF_MidCD e grupo iii-PMGI_MidNF_HighCD). Os percentis 25 e 75 foram indicados como os limites de caixa. Os bigodes estendem a 1,5 vezes o intervalo interquartil dos percentis 25 e 75. As experiências foram repetidas três vezes para cada grupo. Figura 6 A C foram adaptados de referência49 com a permissão de Wiley. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Canal de comprimento (mm) | Largura da canaleta (μm) | Altura de canal (μm) | Diâmetro de entrada/saída (μm) | Altura de entrada/saída (μm) | Comprimento do molde (mm) | Largura do molde (mm) | Altura do molde (mm) |
| Molde | 8.4 | 700 | 250/500/1000 | 800 | 3000 | 127.76 | 85.48 | 14,35 |
| Nome | Espessura (μm) | Comprimento do furo (mm) | Largura do furo (mm) | Máscara de comprimento (mm) | Máscara de largura (mm) | Altura do molde (mm) | Deslocamento de linha (mm) | Deslocamento de coluna (mm) |
| Máscara | 1000 | 6 | 5 | 123,5 | 80.2 | 14,35 | 11,24 | 14.38 |
Tabela 1. Dimensões do molde para uma estrutura microfluidic e a máscara de um patrocínio de nanofibras.
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Discussion
Este protocolo demonstra o primeiro método de triagem para estabelecer um sistema robusto de cultura para a manutenção de hPSCs qualificado. Primeiro, descrevemos como preparar uma plataforma com diversos ECMs artificiais e célula densidades de semeadura usando um dispositivo microfluidic integrado com uma matriz de nanofibras, a matriz MACME. Segunda, quantitativa baseada em imagem única célula fenotipagem foi realizada50 para avaliar os resultados individuais de celulares e comportamentos alterados por características distintas de bioquímicas e biofísicas. Neste protocolo, o ambiente constituído GT nanofibras e proteínas de ECM controle positivo na condição da pilha inicial elevada densidade de semeadura foi caracterizado por características de um estado indiferenciado; rápida proliferação45 e estável OCT4 expressão51. Esta observação indicado que mecanismos moleculares relativas a "matriz extracelular-célula" e "celular" interações poderiam afetar pluripotência de hPSCs.
Esta estratégia pode ser personalizada para atender a finalidade do usuário. Por exemplo, taxa de transferência e manipulação de células podem ser ajustados para uma variedade de configurações experimentais por re-desenhar as formas e padrões da estrutura microfluidic. Como uma outra forma de melhoria de produtividade, as posições de entrada e saída de cada câmara são projetadas conforme a norma de microplacas de placas de 96 poços, padronizado pela sociedade de Ciências biomoleculares; assim, um distribuidor de líquido robótico automatizado pode ser usado para a seleção de alto rendimento. Para aprofundar a análise do mecanismo molecular relativa "Interacções célula-ECM", o microambiente celular artificial pode ser feita para imitar mais precisamente na vivo condições modificando quimicamente as nanofibras com sinalização moléculas52 .
Até à data, a maioria das plataformas, desenvolvido para a seleção o microambiente celular ter sido destinadas a triagem fatores solúveis (por exemplo, fatores de crescimento e compostos químicos)42,,43,44, mas não de nanofibras ECMs devido à dificuldades em combinar as técnicas de fabricação distintos. Por exemplo, uma folha de nanofibras produz um pequeno intervalo entre uma estrutura microfluídicos e uma placa de base e faz com que sua ligação instável, que resulta em contaminação cruzada entre amostras diferentes porque um meio de cultura se misturam com 1 (um de outra câmara) o pequeno espaço. Nosso novo método facilita a fabricação simples e precisa de matrizes de nanofibras em locais específicos e permite a sua ligação direta com a placa de base, que impede a ligação instável e a contaminação cruzada. Além disso, algumas plataformas53 integrado com microfluídica e matrizes de nanofibras têm sido acessíveis para a manipulação sistemática de sinais químicos e físicos para investigar seus efeitos sobre as funções do celular, porque as tecnologias necessárias para a integração foram altamente sofisticado. Nossos perfis de célula única com a matriz MACME pode ser realizada com um aparelho facilmente atingível e técnicas simples e possui grande potencial para uso na modelagem de ambientes celulares para desenvolvimento e estudos biológicos e descoberta de drogas celular / triagem.
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Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
Agradecemos o Prof N. Nakatsuji no iCeMS, Universidade de Quioto, para fornecer células ES humanas. Também agradecemos a Prof A. Maruyama no Tokyo Institute of Technology pelo seu apoio na utilização do microscópio de força atômica. O financiamento foi generosamente fornecido pela sociedade do Japão para a promoção da ciência (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 e 24656502); financiamento também foi fornecido pela nova energia e organização de desenvolvimento de tecnologia Industrial (NEDO) e a Fundação de Ciências da vida Terumo. O iCeMS-WPI é suportado pelo mundo Premier International Research Centre iniciativa (WPI), o Ministério da educação, cultura, esportes, ciência e tecnologia (MEXT), Japão. Uma parte deste trabalho foi apoiada pelo Hub de nanotecnologia de Universidade de Quioto e as instalações de processamento de Nano AIST no projeto"nanotecnologia plataforma" patrocinado pelo MEXT, Japão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
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