Summary
肠道阻塞是肠道的部分或全部堵塞, 可引起严重的腹痛、恶心、呕吐和防止大便的通过。该方法在小鼠肠道部分 obsructions 的建立是可靠的, 研究的机制, 病理细胞生长和死亡的肠道。
Abstract
肠道阻塞, 阻碍或阻断蠕动运动, 可能是由腹部粘连和大多数胃肠道 (胃肠) 疾病, 包括肿瘤生长引起的。然而, 由于肠道障碍而引起的细胞重塑机制被理解得很差。一些动物模型的肠道障碍已经开发, 但鼠标模型是最成本/时间的有效。老鼠模型使用的外科植入肠道部分梗阻 (PO), 如果它没有正确的执行率高死亡率。此外, 如果不使用适当的封锁或不适当放置, 接受 PO 手术的小鼠就无法发育肥大。在这里, 我们描述了一个详细的协议, 为 PO 手术, 产生可靠和可重复的肠道障碍, 死亡率非常低。该协议利用手术放置的硅胶环包围回肠, 部分阻断消化运动在小肠。部分堵塞使肠道因消化运动停止而扩张。肠道扩张会导致环的口腔侧平滑肌肥大, 逐渐发育超过2周, 直至死亡。手术 PO 鼠标模型提供了一个体内模型, 用于研究肠道细胞的病理变化, 包括平滑肌细胞 (SMC), Cajal (ICC), PDGFRα+和神经元细胞在肠道梗阻的发育过程中。
Introduction
肠道阻塞是小肠或大肠的部分或全部堵塞, 可防止消化的食物、液体和气体通过肠道移动1。由于梗阻, 堵塞导致肠道壁变厚, 缩小流明2。由于腹部或盆腔手术导致腹部粘连组织形成或胃肠道疾病 (如克罗恩病)、憩、疝、扭转、狭窄、肠套叠, 便秘, 粪便嵌塞, 伪梗阻, 癌症和肿瘤3,4,5。肠道阻塞在这些情况下经常导致肠道肌的肥大6。
PO 的流明诱发肠道扩张, 并增加平滑肌层厚度周围的梗阻, 以响应需要继续功能蠕动7,8,9,10, 11,12,13。开发了肠道动物模型, 研究小鼠的平滑肌肥厚7, 大鼠10, 豚鼠11, 狗12, 猫13 , 持续发展类似的肥厚在肠道肌肉层。
小肠 PO 的老鼠模型是产生和研究肠道障碍的最经济有效的方法在体内。小鼠小肠梗阻是通过使用硅胶环手术放置在回肠周围。在 po 手术后, po 小鼠的细胞数量 (增生) 和肌肉层厚度 (肥厚) 的增加较早,8,15。SMC 是主要的塑料细胞, 生长在平滑的肌肉层, 以响应肥厚条件14, 但其他细胞, 如 ICC 和 PDGFRα+细胞与 SMC 密切关联, 也填充。我们以前报告说, PO 小鼠在小肠发育肥大, 其中 SMC 被去分化肉瘤成PDGFRα + 细胞, 高度增生的7, 15, 16.相反, 在肠道 obsruction 的发育过程中, ICC 在肥厚平滑肌层中退化并丢失了7。PO 模型的另一个主要好处是它有能力诱发肠道神经系统的改变和传播神经源性运动模式。小鼠小肠的主要传播神经源性运动模式是迁移马达复合体 (MMC), 这是神经源性的, 不需要 ICC 或电慢波17。PO 模型可以清楚地了解复合材料和肠神经是如何通过局部梗阻重塑的。
在这里, 我们提出了一个小鼠的肠道 PO 手术的协议使用硅胶环。接受 PO 手术的小鼠在小肠肌中可靠地产生肥大。在肥厚的肌肉内, SMC, ICC, PDGFRα+, 神经元细胞被显著重塑。
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Protocol
以下议定书已获得内华达大学 (UNR) 动物资源机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准, 并符合有关使用研究动物的所有机构伦理准则。
1. 动物。
- 获得成熟 (4-6 周大) 的 C57BL/6 小鼠体重介于20-30 克之间. 在 UNR 动物资源集中的动物设施中, 把实验室老鼠的菌落放在一个中心。
2. 部分梗阻性手术
注意: 手术是在一个专门用于外科手术的房间里进行的。手术前所有的手术器械都是蒸压的。手术室所有人员都应佩戴无菌的手术袍和手套。
- 手术小鼠的制备
- 检查麻醉提供系统, 以确保氧气和异氟醚的供应是足够的程序。打开供应氧气。打开气体流量计, 并将其调整为500-1000 毫升/分钟. 将动物放在感应腔内并封上顶部。
- 打开异氟醚蒸发器到 5%, 并监测动物, 直到它成为卧。将麻醉传递系统切换到鼻锥。
- 将任何残余气体的感应腔冲洗成氧气, 然后关闭感应腔线, 同时保持鼻锥线打开。
- 把动物从房间里取出, 小心地将眼膏放在动物的眼睛上。
- 当气体继续流动时, 将鼻锥放在预热的暖垫上。
- 将氧气流量改为100-200 毫升/分, 2-3% 异氟醚。如果动物开始移动, gentlyrestrain 的动物与鼻子锥, 直到完全麻醉再次。
- 监测过程中的呼吸和反应, 并根据需要调整异氟醚 (2-5%) 的百分比。动物麻醉水平的监测是缺乏脚趾捏反射前手术进行。
- 注射止痛药 (丁丙诺啡, 体重1µg/克) 腹腔远离切口部位。
- 使用干净的棉签在腹部涂抹脱毛液。让乳液在鼠标上坐3-5 分钟, 然后用纱布和棉签去除头发。重复此步骤, 直到所有的头发已经从鼠标的腹部被删除。
- 用纱布和棉签清洁皮肤, 用70% 乙醇。应用 swabsticks 或聚维酮碘溶液清洗腹部。
- 部分梗阻性手术
- 使用 25 x 50 厘米无菌纸, 在手术区中部为 2.5 x 2.5 厘米开口, 将手术部位悬垂。通过在开口和皮肤的边界放置无菌条来保护动物的悬垂性。
- 3.0 厘米腹部切口纵向使用15号刀片手术刀, 确保只有皮肤被切割和避免削减到 musculoperitoneal 层在这个时候。
- 使用镊子和手术剪刀, 小心地将皮肤从 musculoperitoneal 层分开, 而不会导致任何切口到 musculoperitoneal 层。在层数被充分地分离了 (大约 1 cm x 4 cm) 之后, 辨认 linea 在 musculoperitoneal 层数和切开 ~ 2 cm 沿 linea, 用微钳和剪刀暴露腹腔腔。
- 仔细定位并辨认盲肠。用微钳慢慢地从腹腔腔中取出盲肠, 将盲肠和回肠带到不育的褶皱上。立即用0.9% 条无菌盐水浸泡纱布将肠道组织湿润, 并在腹腔外的任何时候保持暴露的组织湿润。
- 定位和辨认回肠和近端结肠之间的肠系膜。使切口 (1 厘米) 平行, 并刚好低于回肠, 在肠系膜上, 避免切割任何血管。
- 采取蒸压硅胶环 (长度为6毫米, 4 毫米外径, 3.5 毫米内径)。纵向切开打开油管, 用微钳打开环。
- 在肠系膜组织的切口上插入开环的一端。将环带到一个完整的圆环形状上, 使一端与另一个接触, 而回肠被环包围。
- 确保硅胶环完全围绕回肠, 闭合环与缝合, 并小心地将肠道放回腹腔腔内。
- 手术关闭
- 在 linea 的 musculoperitoneal 层上进行简单的连续缝合, 用可吸收缝线闭合 musculoperitoneal 伤口。缝合完成后, 用0.9% 无菌生理盐水浸泡纱布清洗任何出血。
- 要完全闭合伤口, 用单独的尼龙缝合, 对皮肤进行简单的连续缝合。
- 两针缝合完成后, 用新的 swabstick 或聚维酮碘清洗伤口。
- 腹腔注射抗生素 (庆大霉素, 每只老鼠 150 ul 基于20-30 克体重)。
- 完成程序后, 关闭异氟醚蒸发器, 让动物呼吸只有流动的氧气, 直到它开始获得意识。
- 一旦动物醒了, 把动物带到一个单独的恢复区, 热支持, 直到完全恢复。
3. 术后观察。
- 手术完成后, 将动物移到恢复室的孵化器中, 温度和湿度是调节的。观察动物术后每15分钟的第一小时, 然后每30分钟的第二小时, 而动物在孵化器。
- 一旦规定的观察完成, 移动动物到他们自己的笼子并且每日监视他们为临床征兆痛苦18, 并且确保手术伤口是正确愈合没有任何并发症的迹象 (开裂) 目前。
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Representative Results
部分梗阻 (PO) 手术诱导的一个月大鼠通过放置一个硅胶环周围的回肠附近的回盲括约肌。这枚戒指造成了回肠部分堵塞。假手术 (所以) 也没有一个环上的年龄/性别匹配的老鼠, 这些老鼠没有显示任何类似的症状, 在 PO 老鼠发现。几个小时后, 小鼠很快从 PO 手术中恢复过来。他们在第一个星期内没有表现出明显的行为变化或虚弱, 但在第一周之后, 他们逐渐开始显示出了 PO 的迹象: 腹部扩张, 粪便颗粒的产量越来越小。po 小鼠在 po 手术后8和13天被牺牲, 同时控制小鼠。在 po 手术后8天, 小肠部分充盈和扩张, 并在 po 手术后13天内完全填充和扩张, 与控制小鼠相比 (图 1A)。在8和13天结肠的粪便颗粒形成后, PO 手术小鼠与控制小鼠相比减少 (图 1B)。用苏木精 & 伊红 (H & E) 染色法对刚在环上游的回肠组织进行解剖, 分析其平滑肌。在 po 手术后8天肥厚平滑肌层, 肥厚术后13天 (图 2) 进一步加强。通过使用免疫化学, 我们还观察了 SMC、ICC、PDGFRα + 和小鼠肌内的神经细胞细胞的变化。每个单元格都标有单元格类型的特定标记: MYH11 (SMC)、套件 (ICC)、PDGFRA (PDGFRα+单元格) 和 PGP9.5 (神经元细胞)。SMC 在三层组织内发现: 纵肌 (LM), 圆形肌肉 (厘米) 和肌粘膜 (毫米) 在回肠。SMC 在三层的快速生长, 在8和13天后, PO 手术 (图 3)。至于 ICCs, 他们的亚群位于深肌丛 (肌间丛), 和浆膜下地区 (SS)。但是, icc、icc 和 icc 在内部/肌层中退化 (图 3)。与 ICC 亚群类似, PDGFRα+单元格 (PαC) 的亚群位于。在 po 小鼠中, PαC、PαC 和 PαC 在小鼠肌层内动态改建: 在 po 手术后8天内生长, 在 po 手术后13天退化 (图 3)。最后, 肌间丛丛 (MP), 黏膜下神经丛 (SP), 浆膜下神经元 (SS) 和肠道运动神经元 (EMN) 在 po 手术后8天和13日内明显丢失在 po 小鼠的肌肉间区 (图 3)。
图1。用小鼠模型手术诱导肠道局部梗阻。po 是由 po 手术引起的。一个月大的老鼠被麻醉, 他们的腹部由切口打开, 一个硅胶环被放置在回肠周围, 并且缝合闭合了开口。接受手术的老鼠可以在8或13天内痊愈。年龄和性别相匹配, 所以老鼠的操作方式与 PO 小鼠相同, 除了没有环的位置。(A)在接受过 PO 手术的小鼠中胃肠道的总图像。图像是老鼠在8和13天后手术后的(B)胃肠道解剖的小鼠在 a. 在环的上游小肠扩张在8和13天后, po 手术和粪便颗粒在结肠中也较小, 在8和13天后, po 手术作为与13天后手术小鼠由于部分梗阻的硅胶环。刻度条为0.5 厘米.请单击此处查看此图的较大版本.
图2。平滑肌层在手术小鼠模型中改变.有代表性的 H & E 染色的回肠横断面从肠道, 所以没有手术 (no) 小鼠。在8和13天的 po 手术中, po 小鼠的平滑肌 (SM) 和黏膜 (木) 层较粗, 而没有老鼠。刻度条为50µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图3。肠部分梗阻所致平滑肌肥大的动态细胞重塑.具有代表性的共焦激光扫描图像的增生性回肠横断面, 从 PO, 所以没有小鼠。免疫组化染色的抗体 (红) MYH11 (SMC), 试剂盒 (ICC), PDGFRA (PDGFRα + 细胞) 或 PGP9.5 (NC; 神经细胞), 共同染色 DAPI (蓝色)。肌粘膜下的 SMC (MM), 圆形肌肉 (CM) 和纵肌 (LM) 层, 以及在深肌丛 (PDGFRα)、肌间丛地区 (我) 和浆膜下地区 (SS)的 + 细胞在8和13天后生长在肥厚回肠手术, 而 ICC, 我和 SS, 肌间丛丛 (MP), 黏膜下丛 (SP), 浆膜下 NC (SS) 和肠道运动神经元 (EMN) 退化。刻度条为50µm.请单击此处查看此图的较大版本.
图4。硅胶环的结果太大, 太小或错放在结肠上。(A)如果环太大而不能造成梗阻, 则在回肠内不存在平滑肌肥厚。这只戒指对回肠没有堵塞。(B)如果环太小, 则肠缺血在回肠发育。圆环做了一个几乎完全堵塞回肠, 可能损坏组织并且导致及早死亡在肥厚之前开发。(C)由于不适当的环, 结肠中发育的平滑肌肥厚。结肠上的环被食管腔的内容 (粪便) 所移动, 破坏了肠系膜血管, 导致结肠大出血。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
我们表明, 小鼠接受肠道 PO 手术的持续和重现性发展肠平滑肌肥大, 这是模仿人类肠梗阻。为不同的动物开发了肠梗阻手术, 包括老鼠7, 老鼠10, 豚鼠11, 狗12和猫13。小鼠肠梗阻模型具有时间、成本、大小和表型优势, 优于其他大型动物模型。小鼠或大鼠肥大的发展只需要10-14 天10, 与豚鼠、狗和猫11、12、13的2-4 周相比。与其他车型相比, 购买和维护小鼠的成本也是一个巨大的财务优势。此外, 小鼠小, 易于处理的 PO 手术。最重要的是, 小鼠在小肠内逐渐和广泛地发育肥大, 而其他较大的动物则发育较不广泛的生长。
在尝试通过肠道 PO 手术产生可靠的肥大时, 有几个关键因素需要考虑。几个研究小组使用了各种大小的圆环, 并在肠道的不同位置放置了一个环, 以创建部分障碍物7,9,10,11,12, 13,14。然而, 一个最佳尺寸的硅胶环应用于小鼠, 因为一个较大的圆环在回肠很少或没有堵塞, 只有部分或从未开发 (图 4A)。反之, 当一个圆环太小, 它创建附近完全堵塞的回肠导致肠缺血和/或损害粘膜引起脓毒症, 导致早期死亡在一周内 (图 4B)。我们使用一个月老老鼠 (材料表) 一个特定尺寸 (长度为6毫米, 4 毫米外径, 3.5 毫米内径) 的硅胶环。为了在回肠中形成最佳的堵塞, 应对不同尺寸的小鼠进行试验, 并使用不同大小的环。另一个关键因素是环在肠道的位置。回肠, 接近回盲阀, 是最好的地方放置环, 以有力地产生部分障碍。其他地区, 如空肠或回肠的不同地区远离回盲阀, 有一个类似的环, 以诱导肥厚7。然而, 由于肚腑的浆膜表面由腹膜液体高度润滑, 被安置在肚腑的这些部分的圆环容易地移动由于肠道的收缩力量推挤粪材料通过。当环被推下肠道的长度, 它切断肠系膜动脉支配进入肌间丛地区的肠道, 造成出血。当一个环插入到回肠末端的回盲阀, 它是物理上阻止进一步移动的庞大性质的盲肠。在手术中, 盲肠可以很容易地找到并取出腹部, 以便在盲肠连接到回肠和近端结肠时找到回盲瓣膜区。在盲肠上连接的回肠和结肠看起来相当相似, 而一个圆环可以意外地放置在近端结肠而不是回肠上。当一枚戒指放在近端结肠上时, 如在空肠上也看到, 环被推下并损坏肠系膜动脉, 造成广泛出血 (图 4C)。为了避免这种错位, 回肠应始终正确定位, 并确定在环到位之前。回肠进入盲肠中部, 结肠进入盲肠囊的一侧。
这个 PO 手术协议被认为是小鼠的主要手术。所有手术器械和材料应在使用前进行消毒, 并应在专用手术室的清洁环境中进行手术, 以尽量减少污染, 从而导致小鼠感染和炎症。此外, 手术后应向小鼠提供止痛药。我们选择使用一个缓释版丁丙诺啡, 这是有效的高达 7-8 h22。此外, 在手术后, 老鼠很难咀嚼和吞咽固体食物。在手术后长达5天的时间内, 小鼠应提供软化食品 (固体饮食, 加上少量的水来软化食物), 并在5天后转为正常的固体饮食。
我们的肠道 PO 手术提供了一个体内肥大模型的肠道梗阻, 其中 SMC, ICC, PDGFRα+细胞异常改建。这个 PO 模型也非常适合于了解如何由 po 修改肠道神经元和主要的运动活动如何影响在小肠和大肠23。这些细胞可以在病理条件下动态重塑, 以及在培养条件下15,16。我们观察到, 这些细胞在老鼠中的表现与没有操作的正常老鼠 (图 2和图 3) 不同。大多数肠道梗阻的人发生腹部粘连后发展手术, 导致平滑肌肥厚3,4,5,21。手术后, 我们还发现 SMC、ICC 和 PDGFRα+细胞在小肠略有肥厚, 与 NO (图 3) 相比, 这表明手术本身可以诱发肠平滑肌肥大。如果是这样的话, 那么手术对 PO 手术来说并不是一个完全消极的控制。不一样, 也应该被用作比较 PO 肠道。
总之, 我们发现了一个成本/时间有效, 可靠, 可重复的 PO 手术协议的小鼠, 有力地产生肠道障碍。在阻塞的发展过程中, SMC、ICC、PDGFRα+以及神经细胞在各种组织层和区域设置中动态地重塑。这个体内梗阻模型提供了新的见解, 我们知道如何表型变化发生在肠道在细胞水平。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者要感谢本杰明 J Weigler, D.V.M., 博士和沃尔特曼德维尔, D.V.M. (动物资源 & 校园参加兽医, 内华达大学, 里诺) 为他们提供了优良的动物服务为老鼠并且他们的忠告在手术程序。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical drape | Medical and veterinary supplies | SMS40 | 40”X100 yards |
| Underpad, econ, pro plus | Medical and veterinary supplies | MSC281224 | 17x24” |
| Iris scissors | Braintree scientific, Inc | SC-i-130 | |
| Iris scissors | Vantage | V95-304 | |
| Dumont electronic & jeweler tweezers | Dumont | 98-180-3 | |
| Braided absorbable suture | Covidien polysorb | SL-5687G | 5-0, polyglactin |
| Nylon non-absorbable mono filament | AD surgical | S-N618R13 | 6-0, nylon |
| Surgical blade | Dynarex | No.15 | |
| Needle holder | Jacobson microvascular | 36-1342TC | 8.5 inch |
| Scalpel handle | Flinn scientific | AB1049 | |
| Microsurgical scissor | WPI | 503305 | |
| Petrolatum ophthalmic ointment | Puralube VET | 3.5 g | |
| Fluriso (isoflurane) | Vetone | V1 502017 | 250 ml |
| Steri-strip reinforced skin closure | 3M | R1547 | |
| Surgical gloves | Medline | MSG2270 | |
| Ear loop face mask | The safety zone | RS700 | |
| Avant gauze non-woven sponges | Caring | PRM25444 | |
| Surgical cup | Admiral craft OYC-2 | 725-A42 | 2.5 oz |
| Swabstick | ChloraPrep | 260103 | 2% w/v Chlorhexidine Gluconate (CHG) and 70% v/v Isopropyl Alcohol (IPA) |
| Cotton tipped applicator | Puritan | 806-WC | |
| Buprenorphine | Zoo pharm | BZ8069317 | 1 mg/ml |
| Gentamycin sulfate | Vetone | G-6336-04 | 100 mg/ml |
| Fast acting gel cream remover | Veet | 8111002 | |
| Syringe | AHS | AH01T2516 | 1 ml with needle |
| Silicon ring | VWR | 60985-720 | 6 mm in length, 4 mm exterior diameter, 3.5 mm interior diameter |
| C57BL/6 mice | The Jackson Laboratory | 4-6 weeks old |
References
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