Summary
Burada multicopy plazmid rolü antibiyotik direncinin evrime sınamak için deneysel bir yöntem mevcut.
Abstract
Multicopy plazmid Prokaryotlarda son derece bol miktarda bulunmaktadır ancak bakteri evriminin içindeki rollerine kötü anlaşılır kalır. Biz son zamanlarda Gen kopya numarası multicopy plazmid tarafından sağlanan hücre başına artış plazmid kodlanmış genler evrimi hızlandırmak gösterdi. Bu çalışmada, biz multicopy plazmid gen evrim teşvik yeteneğini test etmek için deneysel bir sistem mevcut. Basit moleküler biyoloji yöntemleri kullanarak, nerede bir antibiyotik direnci gen Escherichia coli MG1655, kromozom veya multicopy bir plazmid üzerinde içine yerleştirilebilecek bir modeli sistemi inşa edilmiştir. Antibiyotiklerin konsantrasyonları artan altında farklı suşları yaymak için bir deneysel evrim yaklaşım kullanmak ve bakteriyel nüfus yaşama zamanla ölçüyoruz. Böylece gen sadece direnç mutasyonları edinimi ile görüşmek antibiyotik molekül ve direnç gen seçimdir. Bu "evrimsel kurtarma" yaklaşım antibiyotik direnci edinimi tanıtmak için multicopy plazmid potansiyelini test etmek için basit bir yöntem sağlar. Deneysel sistem sonraki adımda antibiyotik direnci moleküler üsleri karakterizedir. Mutasyonlar tanımlamak için antibiyotik direnci edinimi için sorumlu tüm nüfus ve klonlar elde örnekleri derin DNA sıralama kullanın. Son olarak, altında eğitim gen mutasyonların rolü onaylamak için biz onları ebeveyn arka planda yeniden ve direnç fenotip elde edilen suşların sınayın.
Introduction
Bakterilerde antibiyotik direnci önemli bir sağlık sorunu1' dir. Temel düzeyde, antibiyotik direnci patojen bakteri yayılmasını evrimin doğal seleksiyon2,3tarafından basit bir örnektir. Basitçe söylemek gerekirse, kullanma-in antibiyotik dirençli suşların için seçim oluşturur. Bir anahtar Evrimsel Biyoloji, bu nedenle, antibiyotik direnç gelişmeye bakteriyel nüfus yeteneğini etkileyen faktörleri anlamak için sorundur. Seçim deneyler bakterilerin Evrimsel Biyoloji araştırmak için çok güçlü bir araç olarak ortaya çıktı ve bu alanda inanılmaz geniş bir evrimsel sorunları4,5,6anlayışlar üretti. Deneysel evrim, bakteriyel nüfus tek bir ebeveyn yük başlatılan seri olarak tanımlanmış ve sıkı şekilde denetlenen koşullar altında pasajlı. Bazı bu kültürler büyüme sırasında meydana gelen mutasyonlar bakteriyel fitness artırmak ve bunlar kültürler seçim doğal tarafından yayıldı. Deneme sırasında nüfus örnekleri belirli aralıklarla cryogenically donmuş fosil kaydı olmayan gelişen oluşturmak için korunur. Yaklaşımlar geniş bir dizi bakteriyel nüfus gelişen karakterize etmek için kullanılabilir, ama onların uzak ataları ve olan tüm genom sıralamanın karşı gelişti bakteri rekabet yeteneğini ölçen fitness deneyleri iki en yaygın yöntem vardır Bu sürücü adaptasyon genetik değişiklikleri tanımlamak için kullanılır. Richard Lenski ve meslektaşları7,8öncü çalışmaları deneysel evrim standart yaklaşımda Çoğalt nüfusun nispeten az sayıda meydan olmuştur (genellikle < 10) yeni bir uyum ile Yeni karbon kaynakları, sıcaklık veya yırtıcı fajının gibi çevresel meydan okuma.
Direnç antibiyotik konsantrasyonları hasta dokularda ölümcül seviyelere artırmak mümkün değildir yüksek olduğunda antibiyotik dirençli bakterilerin neden olduğu enfeksiyonların büyük bir sorun haline. Klinisyenler ne bu eşik antibiyotik konsantrasyonu, klinik kesme noktası yüksek dozda antibiyotik direnç gelişmeye bakteri sağlar bu nedenle ilgilendi. Bu deneysel çalışmaya nasıl? Bakteriyel nüfus az sayıda yüksek dozda antibiyotik ile meydan, Lenski stilin olduğu gibi deneme, daha sonra büyük olasılıkla sonucu tek antibiyotik tüm nüfus için extinction götürmek olacaktır. Kullanılan antibiyotik doz düşük minimum inhibitör konsantrasyonu ebeveyn gerginliği, (MIC) ise aynı zamanda, o zaman bu özellikle eğer bakteriyel nüfus direnç, klinik düzeyde gelişecek düşüktür direnç büyük maliyeti taşır. Bu iki senaryoyu arasında bir uzlaşma "evrimsel kurtarma" deney9,10,11kullanmaktır. Bu yaklaşımda, kültürler, çok sayıda (genellikle > 40) ile zaman içinde genellikle antibiyotik konsantrasyon ikiye katlayarak her gün12artış antibiyotik doz meydan. Bu deney damgasını artan direnç gelişmeye değil herhangi bir popülasyon için extinction tahrik olduğunu. Bu şekilde meydan çoğu nüfus soyu tükenmiş tahrik, ama küçük bir azınlık direnci yüksek düzeyde gelişen tarafından devam edecek. Bu yazıda, bu deneysel tasarım evrim multicopy plazmid katkısını direnç araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.
Bakteri iki asıl yol, kromozomal mutasyonlar ve mobil genetik elemanları, çoğunlukla plazmid13edinimi antibiyotik direnç kazanır. Çünkü onlar arasında konjugasyon14,15bakterilerin direnç genleri aktarmak mümkün plazmid antibiyotik direnci gelişiminde önemli rol oynar. Plazmid boyutu ve Biyoloji göre iki gruba ayrılabilir: "küçük", bakteri hücre ve "büyük" başına yüksek kopya numarası ile düşük ile kopyalayın sayı16,17. Direnci ve çoklu direnç bakteri15arasında yayılması anahtar sürücüleri vardır Konjügatif plazmid içerdiğinden evrim antibiyotik direnci ve büyük plazmid rolü kapsamlı bir şekilde belgelenmiş oldu. Küçük multicopy plazmid da bakteri17,18içinde son derece yaygındır ve genellikle antibiyotik direnç genleri19için kod. Ancak, küçük multicopy plazmid antibiyotik direnci gelişiminde rolü daha az bir ölçüde inceledi.
Bir son çalışmada, multicopy plazmid gen mutasyon oranları daha yüksek Gen kopya numarası cep12başına nedeniyle artırarak taşıdıkları genler evrimi hızlandırmak önerdi. Bir deneme modeli kullanarak e.coli suşu MG1655 ve β-lactamase gen blaTEM-1 bu multicopy plazmid görünüm üçüncü nesil direnci veriyor TEM-1 mutasyonların oranı hızlandırılmış gösterildi sefalosporin ceftazidime. Bu sonuçlar multicopy plazmid antibiyotik direnci gelişiminde önemli bir rol oynayabileceği belirtti.
Burada, biz geliştirdik yöntemi ayrıntılı bir açıklama mevcut antibiyotik direnci plazmid aracılıklı multicopy evrimi araştırmak için. Bu yöntem üç farklı adımlar vardır: gen altında eğitim multicopy bir plazmid veya ana bilgisayar bakteri kromozom ilk, ekleme. İkinci olarak, deneysel evrim (evrimsel kurtarma) seçici basınç adapte farklı suşları potansiyelini değerlendirmek için kullanın. Ve üçüncü, plazmid aracılıklı evrim sıralama ve ebeveyn genotip şüpheli mutasyonların tek tek yeniden yapılandırma DNA'yı kullanarak temel moleküler olarak belirlenmesi.
Burada açıklanan protokol antibiyotik direnci evrimi araştırmak için tasarlanmış olsa da, son olarak, bir bu yöntem genellikle mutasyonlar tarafından herhangi bir multicopy elde yenilikler evrimi analiz etmek yararlı olabilir iddia edebilirsiniz Plazmid kodlanmış gene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. deneysel sistem antibiyotik direnci Gene kodlama inşaatı
Not: Burada E. coli MG1655 plazmid veya Kromozom kodlanmış antibiyotik direnci gen alıcı suşu kullanıldı. Antibiyotik direnci geni kromozom veya bir başka türlü isogenic zorlanma (şekil 1) içinde multicopy bir plazmid kodlanmış olduğunu.
-
MG1655 kromozom λ fajının Tümleştirme sitesi (attB)20 antibiyotik direnci gen ekleme.
- Kromozom attB sitesi PCR tarafından her iki tarafında, 500 bp-uzun bölgeleri yükseltmek. Oligonucleotides YbhC-F kullanın (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') ve attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') sol homoloji bölge ve attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') ve YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') için doğru bir. Tem1-pBAD-F primerler kullanılarak blaTEM-1 direnç gen yükseltmek (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') ve Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). Tasarım astar yaklaşık 20 ile kan basıncı (5' ucuna) tamamlayıcılık için erimiş olacak parçası için gösterilen dizi.
- Homoloji bölgeleri (ve organizatörü bölgede de dahil olmak üzere) antibiyotik direnci gen PCR ürünü için sigorta için 30 dk 50 ° C'de izotermal derleme21, kullanarak.
- Electroporate MG1655 içeren plazmid pKOBEG hücreleri.
Not: pKOBEG λ içerir bir thermosensitive vektörü olduğu kırmızı makine, kromozom ve PCR ürünleri22arasında allelic değişim homoloji-esaslı teşvik.- 2 mm cuvettes 4 ° C'de electrocompetent hücrelerinin 40 µL ve 2.5 adım 1.1.223 ürünün 1 µL kullanın kV. Resuspend hücreleri 1 mL LB suyu + λ ifade korumak için % 0,2 arabinoz kırmızı makine.
- Toplam hacim microfuge tüp aktarmak ve 2 h 30 ° C'de yoğun (bir orbital shaker 200 devir/dakika) sallayarak ile (pKOBEG için izin veren sıcaklık) kromozom içinde eklenen direnç işaretleri fenotipik bir ifade için izin vermek için kuluçkaya.
- Antibiyotik direnci gen (Ampisilin veya 100 mg/l blaTEM-1için carbenicillin) seçmek için uygun antibiyotik içeren LB agar hücrelerdeyse plaka.
- Bir Petri dish üzerinde 100 µL plaka ve birimin dinlenme spin, taze LB suyu 100 µL içinde resuspend ve başka bir Petri kabına plakası. Gecede 42 ° C'de kuluçkaya
Not: Bu non-keyfi pKOBEG çoğaltma için sıcaklığıdır. Bu koşullarda büyümek mümkün kolonileri pKOBEG kaybetmiş ve attB siteye entegre direnç gen sunacak (kolaylık olması açısından bu soy adı verilecek MG1655::resA bundan böyle). - Test plakaları kloramfenikol ile ilgi kolonileri çoğaltma tarafından pKOBEG kaybı için (hangi pKOBEG karşı antibiyotik içeren bir direnç marker).
Not: Kloramfenikol plakaları keyfi sıcaklıkta büyüme 30 ºC eksikliği plazmid yokluğu göstergesidir. - Klonlar doğrulamak için PCR yükseltmek dış primerler YbhC Extern kullanılarak inşaat (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') ve YbhB-Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), Jel Elektroforez ile amplicon ve sırasını doğru boyutunu doğrulayın arıtılmış ürün eklenen gen dizisini doğru olduğundan emin olun.
-
Antibiyotik direnci gen multicopy bir plazmid yerleştirin.
Not: plazmid çok yüksek kopya numarası ile büyük bir azalma bakteriyel konak fitness empoze eğilimindedir çünkü çoğaltma, p3655 gibi doğal bir kökeni multicopy plazmid kullanımıyla önerilir (pSU18T-pBADgfp2, ColE1 türü kökeni çoğaltma24). Bu Plasmid'ler genellikle bir orta kopya dizi hakkında mevcut hücre başına 15-20 kopya.- PCR, PCR ürünü fazdan ve plazmid PCR güçlendirilmiş omurgaya ligate antibiyotik direnci gen (organizatörü bölgesi de dahil olmak üzere) seçim yükseltmek:
- PCR antibiyotik direnci gen yükseltmek; blaiçinTEM-1 kullanmak astar Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') ve Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').
- T4 polinükleotit kinaz, üreticinin yönergeleri kullanarak saf ürün fazdan.
- PCR yükseltmek bir yüksek-sadakat polimeraz ve oligonucleotides pBAD-F kullanarak plazmid omurga (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') ve pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').
- T4-ligaz kullanarak her iki PCR parçaları ligate üreticisinin yönergeleri izleyerek.
- Daha önce en fazla 1 µL ligasyonu ürün ve antibiyotik direnci gen (Ampisilin veya 100 mg/L, carbenicillin için uygun antibiyotik seçin electrocompetent E. coli DH5-α hücre 40 µL açıklandığı gibi Electroporate, blaTEM-1için) ve plazmid omurga.
Not: LB arabinoz ile ilave gereksizdir. - Reader's choice ticari Mini hazırlık seti kullanarak plazmid çıkarımı:
- 5 mL de bir gecede kültür 12.000 x g oda sıcaklığında, centrifuging tarafından hasat. Resuspension çözümün 250 µL hücrelerde resuspend ve iyice karıştırın. 250 µL lizis çözüm ekleyin ve iyice karıştırın. Nötralizasyon 350 µL ekleyin ve iyice karıştırın.
- Kiti, 1 dk santrifüj ile sağlanan DNA bağlama sütun süpernatant transfer ve aracılığıyla akış atın. İki kez sütun yıkama çözüm, bir dakikalığına centrifuging ve flowthrough her yıkama atarak 500 µL ile yıkayın. Boş sütun için artık çamaşır arabellek kaldırmak ek 1 dk santrifüj kapasitesi.
- Sütun bir temiz tüpü yerleştirin ve ultra saf su 50 µL saf DNA elute membran için ekleyin. 1-2 dk santrifüj kapasitesi ve toplamak arıtılmış plazmid aracılığıyla bu akış içerir. Sanger sıra sıra doğru olduğundan ve hiçbir mutasyonlar evrim deneyleri önce direnç gen mevcut olduğunu onaylamak için eklenen sıra dışında gelen primerler kullanılarak plazmid ilgi gen.
- Sıra doğrulandıktan sonra electroporate E. coli MG1655 gerginliği, yukarıda açıklandığı gibi plazmid.
Not: Bu zorlanma verir MG1655/pRESA.
- PCR, PCR ürünü fazdan ve plazmid PCR güçlendirilmiş omurgaya ligate antibiyotik direnci gen (organizatörü bölgesi de dahil olmak üzere) seçim yükseltmek:
2. evrim kurtarma yaklaşım antibiyotik direnci (şekil 1) deneysel olarak gelişmeye
- Çizgi çalışması altında suşları LB plakaları dışarı: MG1655::resA ve MG1655/pRESA artı duyarlı ebeveyn gerginliği, MG1655.
Not: Bu nedenle antibiyotik LB plakaları eklemenize gerek yoktur plazmid pRESA MG1655 içinde kararlı olmalıdır. Plazmid dizi her adımda doğrulamak gerekli değildir, inşaat doğrulandıktan sonra mutasyon oranları E. coli olarak yeterince düşüktür. - 96-şey pilakalar ve 200 µL lb her iyi hazırlamak ve her yük bağımsız Wells (bir tabak başı zorlanma) 48 izole kolonileri aşılamak. Gecede, 37 ° C ve 200 rpm plakaları kuluçkaya. Donmuş bir hisse senedi bu kurucusu nüfusun tutun.
Not: önlemek ve 96-şey tabak içinde kültür Çapraz bulaşma için kontrol için aşısını wells ile bakteri-özgür orta 96-şey plaka boyunca enterkalasyon bir Dama Tahtası plaka tasarım kullanın. Bu plaka tasarım tüm deneysel evrim sırasında kullanın. - Evrimsel kurtarma deney aşı 2 µL yeni 96-şey plakaları kurucusu nüfus ile plakaların her kuyudan LB her iyi 198 µL antibiyotik altında eğitim sub-inhibitory bir konsantrasyon ile ile başlayın. Evrimsel kurtarma yaklaşım ¼ veya 1/8 (mikrofon, belirlenen daha önce25) minimal inhibitör konsantrasyonunun LB antibiyotik her üç suşları için başlatın ve antibiyotik günlük konsantrasyon çift. Direnç mutasyonları26elde etmek için nüfus olasılığını en üst düzeye çıkarmak için bu yaklaşımı kullanın. Plakayı 37 ° C ve 200 rpm 20 h için kuluçkaya.
Not: gece OD kurucusu nüfusun ölçün. OD suşları arasında önemli farklılıklar aynı şey başına hücre sayısı ile deneme başlatmak için ilk inoculum düzelt. - Her gün, her nüfus gecede kültür sonra OD ölçmek ve bir transfer kültürlerin 2,3, önceki günden antibiyotik çift konsantrasyonu ile yeni 96-şey plakalar için açıklandığı gibi gerçekleştirin. Tabak 20 h 37 ° C'de ve 200 rpm kuluçkaya.
Not: 1: 100 seyreltme faktörü günde yaklaşık 6-7 nesiller üretir. - Buna paralel olarak, denetim nüfus aynı koşullarda her yük 2.3 ve 2.4, ancak antibiyotik yokluğunda açıklandığı gibi yaymak.
Not: Denetim nüfus antibiyotik ve genel mutasyonlar için deneysel koşullar adapte bakteri yardım varlığı nedeniyle doğan mutasyonlar arasında ayırımcılık yardımcı olacaktır. Paralel mutasyonlar antibiyotik yokluğunda doğan bakteri deneysel koşullar adapte yardımcı olmak büyük olasılıkla ve antibiyotik direnci için ilişkili olmayan vardır. - Hayatta kalan nüfus sayısını her gün dalga boyunda 600 Absorbans ölçerek izlemek nm (OD) plaka okuyucu kullanarak kültürlerin.
Not: 0,1 nüfus tükenme belirtmek daha optik yoğunluk değerleri daha düşük. Şekil 2 yaşam eğrilerinin bir örnek için bkz:. - Bir dondurulmuş hazır tüm nüfusun düzenli aralıklarla (her 3-5 gün) tutmak.
- Günlük sırası testleri [paket RStudio (sürüm 0.99.486) "hayatta kalma"] istatistik nüfus farklı suşları yaşama antibiyotik12konsantrasyonu artan altında zaman içinde farklılıkları belirlemek için kullanın.
Not: Bu deneme multicopy plazmid belirli antibiyotik ve gen altında eğitim için antibiyotik direnci evrimi kazara belirleyecek.
3. moleküler temeli antibiyotik direnci (şekil 1) evrimi
- Nüfus ve klonlar temsilcisi bir dizi toplam DNA çekimi suşları ve tedavileri arasında gerçekleştirin. Ebeveyn suşları dahil (MG1655, MG1655::resA ve MG1655/pRESA) deneme sırasında biriken mutasyon tespit edebilmek için.
Not: tablo malzemelerin DNA ekstraksiyon kitleri örnekleri için bkz:. Her kitte farklı protokoller vardır; üreticileri yönergeleri izleyin. - DNA kalite ve ölçmek. DNA kalite ve belirlemek için farklı yöntem vardır. Oranları Absorbans 260 nm/280 nm ve 260 nm/230 nm ölçme kalite belirleme. DNA toplama üretici yönergeleri izleyerek ölçmek için bir Floresan, DNA'ya bağlanıcı boya kullanımı ve özel Jel Elektroforez orada onaylamak için hiçbir DNA bozulma ya da RNA kirlenme.
- Antibiyotik direnci genetik temeli araştırmak için kullanım derin DNA sıralama örneklerinden tüm nüfus ve bireysel klonlar.
Not: Biz insan genetiği, Oxford, İngiltere için Wellcome Güven Merkezi tüm sıralama yapılmıştır. Daha fazla bilgi için bkz: San Millan vd. 201612. - Breseq 0.26.1 boru hattı27,28 mutasyonlar nüfus sıklığı tahmin etmek için çok biçimlilik modunu kullanma mutasyonlar, algılamak için kullanın. Deneme sırasında birikmiş mutasyonlar algılamak için ebeveyn genom için farklı gelişti genleri karşılaştırın.
- Paralel denetimi nüfus bu nüfusun mutasyonlar birikmiş karşılaştırmak konsantrasyonu antibiyotik bakteri genel deneysel koşullar (adapte yardım mutasyonlar arasında ayırt etmek için artan altında gelişti Bu denetim nüfus içinde bulunur) ve bu söz konusu olursa antibiyotik direnci (Bu sadece antibiyotik baskısına maruz nüfusu bulunan).
Not: farklı paralel mutasyon tedaviler arasında kolayca tespit edilebilir böylece paralel mutasyonlar sayısı genellikle düşüktür. Diğer mutasyonlar dışında antibiyotik direnci gen altında oldukça bulmak olasıdır eğitim mutasyonların kromozom içinde antibiyotik direnci, porins veya sızma sistemleri12böyle mutasyonların ile ilişkili. - Bu protokolün 1 kısmı olduğu gibi aynı yaklaşımı kullanarak ebeveyn zorlanma antibiyotik direnci gen mutasyonların yeniden. Puan 1.1 ve 1.2 yeni mutasyonlar (Gelişmiş genler PCR şablon olarak kullanıp) ebeveyn arka planda tanıtmak için iletişim kuralı izleyin. Antibiyotik direnci fenotipleri mutasyonlar rolü onaylamak için bu yeni yapıların analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Önceki çalışmalarda, evrim direnç üçüncü kuşak sefalosporin ceftazidime12 veriyor doğru β-lactamase gen blaTEM-1 araştırılmıştır. Çünkü her ne kadar TEM-1 ceftazidime direnç görüşmek değil, blaTEM-1 mutasyonların etkinlik TEM-1 sefalosporinler ceftazidime29gibi hidrolize aralığını genişletebilirsiniz, bu gen seçildi. Antibiyotik direnci enzimler β-laktamaz veya değişiklik etkinliği onların kapsama alanında önde gelen enzimler değiştirme aminoglikosite gibi mutasyonların ortak29,30vardır. Bu deneysel sistem bu tür enzimler evrimi keşfetmek idealdir. Bu protokol sonrası başarılı bir deneme ayrıntılı bir rapor için lütfen San Millan ve diğerleribakın. 201612.
Burada, bu deneysel sistemin olası sonuçları örneği Protokolü (Not Bu örnek için kullanılan veri gerçek değil) göstermek için sunulmuştur. Multicopy potansiyel rolü araştırmak için ( resAdiyelim) Bu örnekte plazmid evrim ve antibiyotik direnci gen altında çalışma, biz yukarıda açıklanan protokol 1 bölümünü takip deneysel sistem geliştirmek. Deneyler üç suş üretmek: MG1655, MG1655::resA ve MG1655/pRESA. İki farklı β-laktam antibiyotik (ceftazidime ve meropenem) direnç gelişimi Protokolü'nün 2 bölümünde açıklanan adımları izleyerek test edildi. Şekil 2 hayatta kalma eğrileri altında eğitim örneğin alınma olasılığını gösterir. Bu örnekte, bu MG1655 veya MG1655 göre ceftazidime içinde MG1655/pRESA gelişen ait nüfus yaşama önemli bir artış var::resA (günlük-rank testi, P< 0,05). Öte yandan, meropenem söz konusu olduğunda farklı suşları ait nüfus yaşama hiçbir önemli farklılıklar vardır (günlük-rank testi, P> 0.05). Bu nedenle, bu sonuç gene resA multicopy plazmid varlığı direnç ceftazidime, ancak meropenem evrimi potentiates öneririz.
Denemenin son adımında antibiyotik direnci moleküler temeli, Protokolü'nün 3 bölümünde açıklandığı gibi soruşturma. İlk olarak, DNA sıralama direnci fenotip için sorumlu olabilir resA mutasyonların ortaya çıkaracaktır. Ve ikincisi, ebeveyn MG1655 (hem kromozom ve plazmid) mutasyonların resA yeniden inşası onaylamak veya antibiyotik direnci fenotip kendi rolünü atın.
Resim 1 . Protokol farklı aşamalarını şematik gösterimi. Soldan sağa: (i) deneysel sistem inşaatı: MG1655, MG1655::resA ve MG1655/pRESA. Bakteriyel kromozom brown, plazmid mavi ve kırmızı resA gen temsil edilir. (II) antibiyotik direnci deneysel olarak gelişmeye evrimsel kurtarma yaklaşım: birkaç nüfus farklı suşlarının antibiyotik konsantrasyonu artan altında yayılır. (iii) antibiyotik direnci moleküler temeli analizini: DNA'ın örnekleri gelişmiş nüfus ve klonlar, antibiyotik direnci mutasyon tespiti ve ebeveyn zorlanma bu mutasyonların yeniden inşası. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Antibiyotik konsantrasyonları artan ile hayatta kalma eğrileri. Uygun nüfus için suşları MG1655, MG1655 ait sayının karşılığını::resAve MG1655/pRESA zaman içinde. Her baskı 48 nüfus yayılır antibiyotik ceftazidime ve meropenem, konsantrasyonları artan altında 1 gün 1/8 MIC ile başlayan ve antibiyotik toplama her gün iki katına çıkarın. Kırmızı Kesikli dikey çizgi çalışması altında antibiyotiklerin mikrofon temsil eder. Not Ceftazidime söz konusu olduğunda farklı suşları için zaman içinde ait nüfus yaşama önemli farklılıklar vardır (günlük-rank testi, P< 0,05). En önemlisi, sadece nüfus plazmid taşıyan antibiyotik üst düzey konsantrasyonları kadar hayatta kalmak edebiliyoruz. Öte yandan, meropenem söz konusu olduğunda, zaman içinde farklı popülasyonlar hayatta hiçbir önemli farklılıklar vardır (günlük-rank testi, P> 0.05). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz moleküler biyoloji, deneysel evrim ve evrim bakterilerde antibiyotik direnci ve multicopy plazmid rolünü araştırmak için tasarlanmış derin DNA sıralama birleştiren yeni bir iletişim kuralı mevcut. Her ne kadar bu iletişim kuralı teknikleri farklı alanlardan birleştiren, onu geliştirmek için gereken tüm yöntemleri basit ve düzenli Mikrobiyoloji laboratuvar olarak gerçekleştirilebilir. Protokol en kritik adımlarda muhtemelen modeli sistem suşları inşası ve yeniden yapılanma (ki tam olarak aynı yöntemi kullanarak gerçekleştirilir) sonra deneysel evrim gözlenen mutasyon vardır. Ancak, izotermal derleme sistemi21, basitleştirir önemli ölçüde bu iletişim kuralı bir orta seviye deneyim Moleküler biyolojide olan herhangi bir kullanıcı bu uygulayabilirsiniz böylece.
Protokolü'nün diğer kritik adım antibiyotiklerin konsantrasyonları artan altında deneysel evrim olduğunu. Örnek olarak, bu protokolü deneyin suşları ve konsantrasyon her gün antibiyotik iki katına mikrofon ¼-1/8 ile başlar. Ancak, antibiyotik değişimin daha düşük bir oranı geçersiz kalma26evrimsel kurtarma şansını artırmak. Bu nedenle, antibiyotik konsantrasyonları değişim oranı antibiyotik direnci gelişimi teşvik için değiştirilebilir parametreleri biridir.
DNA sıralama ve analiz da önemli deneysel tasarım yönleri vardır. DNA örnekleri bütün nüfus hem deneyinde farklı zaman noktalarda bireysel klonlar üzerinde sıralama yapıldığında daha doğru sözlü sonuçlarıdır. Nüfus sonuçları sıralama mutasyon profilleri arasında tedavilerin yanı sıra yararlı mutasyonların seçici piyango genel farklılıkları zaman ve klonal parazit olası olaylar üzerinde ortaya çıkaracaktır. Dizileri nüfus üzerinden analiz asla herhangi bir popülasyonda % 10 frekans aştı mutasyonlar filtre uygulamak iyidir. Dizileri bireysel klonlar üzerinden örneğin alınma olasılığını elde edilen sonuçları doğrulamak ve en önemlisi, nüfus düzeyinde gözlenen farklı mutasyonlar arasında belirli birleşimleri ortaya çıkarmak. Bu özel dernekler epistatic bakteriyel adaptasyon31' de kritik bir rol oynamaktadır mutasyonlar Hofstede ortaya çıkarmak yardımcı olabilir.
Bu yöntemi kullanarak, biz son zamanlarda multicopy Plazmidler ilk görünüm roman mutasyonların oranı artan ve sonra etkisi nedeniyle artan gen dozaj12 mutasyonların yükseltecek antibiyotik direnci, evrimi hızlandırmak göstermiştir . Bu nedenle, antibiyotik direnci evrimi araştırmak için bir araç olarak geliştirdiğimiz yöntem ama o kadar geniş bir uygulamalar olabilir. Yani, bu sistem herhangi bir bakteri gen yeteneği daha genel bir şekilde bir yeni veya geliştirilmiş işlev doğru gelişmeye araştırmak için kullanılabilir. Bu sistem, örneğin, metabolik bir enzim/yol yeni karbon yüzeyler32kullanma yeteneğini test etmek için kullanılabilir. Ayrıca, hypermutators (hücresel sistemleri DNA uyuşmazlığı tamiri içinde yer alan bir üründe ile bakteri) yerine kullanılabilir edinilmiş gen evriminde hypermutators tarafından tanıtılan mutational önyargı önlemek bakteri, araştırmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Instituto de tarafından desteklenen Salud Carlos III (Plan Estatal de ben + D + ben 2013-2016): CP15-00012, PI16-00860 ve CIBER (CB06/02/0053), ortak '' Europe ulaşmanın bir yolu '' Avrupa Kalkınma bölgesel Fonu tarafından finanse hibe (ERDF). JAE Madrid (2016-T1/biyo-1105) ve ben hükümet Atracción de talento program tarafından desteklenmektedir + D Excelencia, İspanyol "gayri resmi" de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM: Instituto de Miguel Servet bursu tarafından desteklenmektedir Salud Carlos III (MS15/00012) ortak Avrupa Sosyal Fonu tarafından finanse edilen "senin geleceğine yatırım" (ESF) ve ERDF.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
References
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
- Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
- Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
- Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
- Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
- San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
- Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
- Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
- Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
- San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
- Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
- Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
- Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, USA. (2009).
- Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
- Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
- Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
- Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).
