Summary
Här presenterar vi en experimentell metod för att testa multicopy plasmider roll i utvecklingen av antibiotikaresistens.
Abstract
MultiCopy plasmider förekommer mycket rikligt i prokaryoter men deras roll i bakteriell utveckling fortfarande dåligt förstådd. Vi visade nyligen att ökningen gen kopia antalet per cell som tillhandahålls av multicopy plasmider kan påskynda utvecklingen av plasmid-kodade gener. I detta arbete presenterar vi en experimentell system för att testa multicopy plasmider förmåga att främja gen evolution. Med enkla molekylärbiologiska metoder, konstruerat vi modellsystem där en antibiotikaresistensgen kan infogas i Escherichia coli MG1655, antingen i kromosomen eller på en multicopy plasmid. Vi använder en experimentell evolution strategi för att propagera de olika stammarna under ökande koncentrationer av antibiotika och vi mäter överlevnad av bakteriell populationer över tid. Valet av antibiotika molekylen och motstånd genen är så att genen kan endast ge motstånd genom förvärvet av mutationer. Detta ”evolutionära rescue” tillvägagångssätt ger en enkel metod för att testa multicopy plasmider potential att främja förvärv av antibiotikaresistens. I nästa steg av experimentella systemet kännetecknas molekylära baserna av antibiotikaresistens. För att identifiera mutationer ansvarar för förvärvet av antibiotikaresistens använder vi DNA djupsekvensering av produktproverna hela befolkningar och kloner. Slutligen, för att bekräfta rollen av mutationer i genen under studien, vi rekonstruera dem i föräldrarnas bakgrund och testa motstånd fenotypen av de resulterande stammarna.
Introduction
Antibiotikaresistenta bakterier är ett stort hälsoproblem problem1. På en grundläggande nivå är spridningen av antibiotikaresistenta patogena bakterier ett enkelt exempel på evolution genom naturligt urval2,3. Enkelt uttryckt, genererar användning av antibiotika urval för resistenta stammar. Ett centralt problem i evolutionsbiologi, därför att förstå de faktorer som påverkar populationernas förmåga till bakteriell utvecklas resistens mot antibiotika. Urval experiment har visat sig vara ett mycket kraftfullt verktyg för att undersöka evolutionär biologi av bakterier, och fältet har producerat otroliga insikter i ett brett utbud av evolutionära problem4,5,6. I experimentell evolution, bakteriell populationer initieras från en enda föräldrarnas stam är seriellt anpassade villkor definierade och väl kontrollerad. Några av de mutationer som inträffar under tillväxten av dessa kulturer öka bakteriell fitness, och dessa sprids genom kulturer genom naturligt urval. Under experimentet bevaras prover av befolkningarna regelbundet cryogenically för att skapa en icke-utvecklas frozen fossilfynd. Ett stort antal metoder kan användas för att karaktärisera utvecklas bakteriella populationer, men de två vanligaste metoderna är fitness-analyser, som mäter förmågan av utvecklade bakterier att konkurrera mot deras avlägsna förfäder, och hela Genomsekvensering, som är används för att identifiera de genetiska förändringarna att driva anpassning. Efter pionjärarbete av Richard Lenski och kollegor7,8, standardmetoden i experimentell utveckling har varit att utmana ett relativt litet antal replikera populationer (vanligtvis < 10) med anpassning till en ny miljöutmaningen, såsom nya kolkällor, temperatur eller en underprissättning phage.
Infektioner orsakade av antibiotikaresistenta bakterier blir ett stort problem när motståndet är tillräckligt hög för att det inte är möjligt att öka antibiotiska koncentrationerna till dödliga nivåer i patientens vävnad. Kliniker är därför intresserade vad gör att bakterier att utvecklas resistens mot höga doser av antibiotika som överstiger detta tröskelvärde antibiotikakoncentrationen, kliniska brytpunkten. Hur man studera detta experimentellt? Om ett litet antal bakteriella populationer utmanas med en hög dos av antibiotikum, som en Lenski-stil experiment, då det mest sannolika utfallet är att antibiotika kommer att driva alla befolkningar till utrotning. Samtidigt, om dosen av antibiotika som används är låg, under den minimal hämmande koncentrationen (MIC) av föräldrarnas stam, är det osannolikt att de bakteriella populationerna kommer att utvecklas kliniskt relevanta nivåer av motstånd, särskilt om motstånd bär en stor kostnad. En kompromiss mellan dessa två scenarier är att använda en ”evolutionära rescue” experiment9,10,11. I detta synsätt, ett mycket stort antal kulturer (normalt > 40) utmanas med doser av antibiotika som ökar över tid, vanligtvis genom att fördubbla antibiotikakoncentrationen varje dag12. Kännetecknande för detta experiment är att någon befolkning som inte utvecklas ökat motstånd kommer att drivas till utrotning. De flesta populationer som utmanas på detta sätt kommer vara drivande utdöd, men en liten minoritet kommer att bestå av utvecklas höga nivåer av motstånd. I detta papper visar vi hur detta experimentell design kan användas för att undersöka multicopy plasmid bidrag till utvecklingen av resistens.
Bakterier förvärva resistens mot antibiotika genom två huvudsakliga rutter, kromosomala mutationer och förvärvet av mobila genetiska element, oftast plasmider13. Plasmider spela en nyckelroll i utvecklingen av antibiotikaresistens eftersom de kan överföra antibiotikaresistensgener mellan bakterier genom konjugation14,15. Plasmider kan delas in i två grupper beroende på deras storlek och biologi: ”små”, med hög kopienumret per bakteriecell och ”stora”, med låg Kopiera nummer16,17. Rollen av stora plasmider i utvecklingen av antibiotikaresistens har dokumenterats i stor utsträckning eftersom de innehåller konjugering plasmider, vilka är viktiga drivkrafter för spridning av resistens och multi motstånd bland bakterier15. Liten multicopy plasmider är också mycket vanliga i bakterier17,18, och de kod ofta för antibiotikaresistens gener19. Rollen av små multicopy plasmider i utvecklingen av antibiotikaresistens har dock studerats i mindre utsträckning.
I ett senare arbete föreslog vi att multicopy plasmider kan påskynda utvecklingen av de gener som de bär genom att öka gene mutation priser på grund av högre gen kopia antalet per cell12. Med en experimentell modell med E. coli -stam MG1655 och β-laktamas gen blaTEM-1 visades det att multicopy plasmider påskyndas av utseende av TEM-1 mutationer ger resistens mot den tredje generationen cefalosporin ceftazidime. Dessa resultat visade att multicopy plasmider kan spela en viktig roll i utvecklingen av antibiotikaresistens.
Här presenterar vi en detaljerad beskrivning av den metod vi har utvecklat att undersöka multicopy plasmidmedierad utvecklingen av antibiotikaresistens. Denna metod har tre olika steg: första, införande av genen under studien antingen i en multicopy plasmid eller kromosomen av värd bakterier. För det andra, användning av experimentell evolution (evolutionära räddning) att bedöma de olika stammarna har potential att anpassa sig till selektionstryck. Och tredje, att fastställa den molekylära basen underliggande plasmidmedierad evolution med DNA-sekvensering och rekonstruera de misstänkta mutationerna individuellt i föräldrarnas genotypen.
Slutligen, även om det protokoll som beskrivs här har utformats för att undersöka utvecklingen av antibiotikaresistens, kan man hävda att denna metod kan vara allmänt användbara att analysera utvecklingen av innovationer som förvärvats av mutationer i någon multicopy plasmid-kodade genen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. konstruktion av experimentella systemet kodning antibiotikaresistensgen
Obs: Här E. coli MG1655 användes som mottagarens stam av genen plasmid - eller kromosom-kodad antibiotikaresistens. Antibiotikaresistensgen kodas med kromosomen eller en multicopy plasmid i en annars syngena stam (figur 1).
-
Införande av antibiotikaresistens genen i λ phage integration webbplats (attB)20 av kromosomen av MG1655.
- Förstärka 500 bp lång regionerna på båda sidor av kromosomala attB webbplatsen med PCR. Använda oligonukleotider YbhC-F (5'-CCTGTACCGTACAGAGTAAT-3') och attB-R (5'-GCCCGCCACCCTCCGGGCCGGTATAAAAAAGCAGGCTTCA-3') för vänster homologi regionen och attB-F (5'-AGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTATACTAACTTGAGCGAAA-3') och YbhB/R (5'- TGGCGATAATATTTCACCGC-3') för ett riktigt. Förstärka den blaTEM-1 motstånd gen använder primers Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') och Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3'). Utforma grundfärger med cirka 20 bp (i 5' slutet) av sekvens visar komplementaritet att fragmentet som kommer att vara smält till.
- Säkring homologi regioner att antibiotikaresistens gen PCR-produkten (inklusive dess tillskyndare region) använder isotermiska församling21, vid 50 ° C i 30 min.
- Electroporate MG1655 celler innehållande plasmid pKOBEG.
Obs: pKOBEG är en värmekänslig vektor som innehåller λ röda maskiner, främja homologi-baserade alleliska utbyten mellan kromosom och PCR-produkter22.- Använd 1 µL av produkten från steg 1.1.223 till 40 µL av electrocompetent celler i 2 mm kyvetter vid 4 ° C och 2,5 kV. Återsuspendera cellerna i 1 mL LB buljong + 0,2% arabinos att bibehålla uttrycket av λ röda maskiner.
- Överföra den totala volymen till ett mikrofugrör och inkubera 2 h vid 30 ° C (tillåtande temperatur för pKOBEG) med intensiv skakning (200 rpm i orbitalskak) för att tillåta av fenotypiska uttryck för motstånd markörerna infogas i kromosomen.
- Platta celler på LB agar som innehåller anslåantibiotikummen välja för antibiotikaresistensgen (ampicillin eller carbenicillin på 100 mg/l för blaTEM-1).
- Plåt 100 µL på en petriskål, och snurra ner resten av volymen, Återsuspendera det i 100 µL av färska LB buljong och platta det på en annan petriskål. Inkubera över natten vid 42 ° C.
Obs: Denna temperatur är icke-tillåtande för replikering av pKOBEG. Kolonierna kan växa i dessa villkor kommer att ha förlorat pKOBEG och kommer att presentera motstånd genen integreras i webbplatsen attB (för enkelhetens skull denna stam kommer att kallas MG1655::resA härifrån på). - Test för förlusten av pKOBEG genom att replikera kolonierna av intresset för plattor med kloramfenikol (antibiotika mot vilka pKOBEG innehåller en motstånd markör).
Obs: Bristande tillväxt i kloramfenikol plattor vid tillåtande temperatur av 30 ° c är tecken på avsaknad av Plasmiden. - För att kontrollera kloner, PCR förstärka konstruktionen använder externa primers YbhC-Extern (5'-TTTGTGACCAGAAGACCGCA-3') och YbhB-Extern (5'-CTCATCAGTAACGATCTGCG-3'), verifierar genom gelelektrofores rätt storlek av amplikon och sekvens av renad produkt för att säkerställa att sekvensen av den infogade gen är korrekt.
-
Infoga antibiotikaresistensgen i en multicopy plasmid.
Obs: Eftersom plasmider med mycket hög kopienumret tenderar att införa en stor minskning i bakteriell värd fitness, rekommenderar vi användning av multicopy plasmider med ett naturligt ursprung av replikering, till exempel p3655 (pSU18T-pBADgfp2, ColE1-typ ursprung replikering24). Dessa plasmider brukar presentera en måttlig kopia antal ca 15-20 kopior per cell.- PCR förstärker antibiotikaresistensgen val (inklusive promotor regionen), fosforylera PCR-produkten och ligera det till PCR-förstärkta stommen i plasmiden:
- PCR förstärker antibiotikaresistensgen; för blaTEM-1 använda primers Tem1-pBAD-F (5'-TGAAGCCTGCTTTTTTATACCGGCCCGGAGGGTGGCGGGC-3') och Tem1-pBAD-R (5'-TTTCGCTCAAGTTAGTATAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCT-3').
- Fosforylera renade produkten med T4 polynucleotide kinase, följa tillverkarens instruktioner.
- PCR förstärka plasmid ryggraden använder en HiFi-polymeras och oligonukleotider pBAD-F (5'-CGTTGATCGGCACGTAAGAG-3') och pBAD-R (5'-AAACGACGGCCAGTGCCAAG-3').
- Ligera båda PCR-fragmenten med T4-ligase följer tillverkarens riktlinjer.
- Electroporate, som beskrivs tidigare, 40 µL av electrocompetent E. coli DH5-α celler med högst 1 µL av ligering produkt och välj på lämplig antibiotika för antibiotikaresistens genen (ampicillin eller carbenicillin på 100 mg/L för blaTEM-1) och plasmid ryggraden.
Obs: Komplettera LB med arabinos här är onödiga. - Extrahera plasmiden med hjälp av kommersiella mini prep kit av läsarens val:
- Skörda 5 mL av en övernattning kultur genom centrifugering vid 12 000 x g vid rumstemperatur. Att resuspendera cellerna i 250 µL resuspension lösning och blanda väl. Tillsätt 250 µL lysis lösning och blanda väl. Tillsätt 350 µL av neutralisering och blanda väl.
- Överför supernatanten till kolumnen DNA bindande medföljer kit, Centrifugera i 1 min och kasta flödet genom. Tvätta två gånger kolumnen med 500 µL av tvättlösningen, centrifugering i en minut och kasta att vid varje tvätt. Centrifugera tomma kolumnen för 1 ytterligare min att ta bort kvarvarande tvätt buffert.
- Placera kolumnen i en ren slang och tillsätt 50 µL ultrarent vatten i membranet att eluera renade DNA. Centrifugera i 1-2 min och samla flödet genom som innehåller renade Plasmiden. Sanger sekvens genen sevärdheter i plasmiden med primers från utanför den införda sekvensen för att bekräfta att sekvensen är korrekt och att det finns inga mutationer i genen motstånd innan de evolution experiment.
- När sekvensen är verifierat, electroporate plasmiden i E. coli MG1655 stam, som beskrivs ovan.
Obs: Detta ger stam MG1655/pRESA.
- PCR förstärker antibiotikaresistensgen val (inklusive promotor regionen), fosforylera PCR-produkten och ligera det till PCR-förstärkta stommen i plasmiden:
2. evolutionära Rescue strategi att experimentellt utvecklas antibiotikaresistens (figur 1)
- Strimma ut stammarna under studie på LB tallrikar: MG1655::resA och MG1655/pRESA plus mottagliga föräldrarnas stam, MG1655.
Obs: Plasmid pRESA bör vara stabil i MG1655, så det finns ingen anledning att lägga till antibiotika till LB plattorna. Mutation är i E. coli tillräckligt låg så när byggandet är verifierat det inte är nödvändigt att kontrollera plasmid sekvens vid varje steg. - Förbereda 96 brunnar med 200 µL av LB i varje brunn och Inokulera 48 isolerade kolonier av varje stam i oberoende wells (en platta per stam). Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C och 200 rpm. Hålla ett fryst lager av dessa grundare populationer.
Obs: För att förebygga och kontrollera för kultur korskontaminering i 96 brunnar tallrikar, använda en schackrutiga plattan design genom att infoga inokulerade brunnar med bakteriefria medium i hela plattan med 96 brunnar. Använda denna platta design under hela experimentell utveckling. - Starta evolutionära rescue experimentet genom ympning 2 µL från varje brunn av plattorna med grundare befolkningen i nya 96 brunnar med 198 µL av LB i varje brunn med en sub-hämmande koncentration av antibiotika under studien. För metoden evolutionära räddning börja med ¼ eller 1/8 av den minsta hämmande koncentration (MIC, bestäms tidigare25) av antibiotika i LB för var och en av de tre stammarna och dubbla koncentrationen av antibiotika dagligen. Använd den här metoden för att maximera chanserna av populationer att förvärva motstånd mutationer26. Inkubera plattorna vid 37 ° C och 200 rpm för 20 h.
Obs: Mät övernattning OD folkens grundare. Om det finns betydande skillnader i OD bland stammar korrigera det inledande inokulatet för att starta experimentet med samma antal celler per brunn. - Varje dag, mäta OD av varje befolkning efter övernattning kultur och utföra en överföring av kulturer, som beskrivs i punkt 2.3, till nya 96 brunnar med dubbla koncentrationen av antibiotika än dagen innan. Inkubera plattorna 20 h vid 37 ° C och 200 rpm.
Obs: 1: 100 utspädningsfaktorn producerar cirka 6-7 generationer per dag. - Parallellt, sprida kontroll populationer av varje stam på samma villkor som beskrivs i 2.3 och 2.4, men i frånvaro av antibiotika.
Obs: Kontroll populationer hjälper diskriminera mellan mutationer som uppstår på grund av de antibiotika och allmänna mutationer att hjälpa bakterier att anpassa sig till de experimentella förhållandena. Parallella mutationer som uppstår i frånvaro av antibiotika är sannolikt att hjälpa bakterier att anpassa sig till de experimentella förhållandena och inte relaterat till antibiotikaresistens. - Spåra antalet överlevande populationer varje dag genom att mäta absorbansen vid en våglängd på 600 nm (OD) kulturer med hjälp av en tallrik-läsare.
Anmärkning: Värden för optisk densitet lägre än 0,1 tyda utrotning av befolkningen. Se figur 2 exempel på överlevnadskurvor. - Hålla ett fryst lager av befolkningen regelbundet (var 3-5 dagar).
- Använd log-rank test [paket ”överlevnad” i RStudio (Version 0.99.486)] att fastställa statistiska skillnader i överlevnad av populationer av olika stammar över tid under ökande koncentration av antibiotika12.
Obs: Detta experiment kommer att avgöra om multicopy plasmider förstärka utvecklingen av antibiotikaresistens för särskilt antibiotika och gen under studien.
3. molekylära basen av utvecklingen av antibiotikaresistens (figur 1)
- Utföra totala DNA extraktioner från ett representativt antal populationer och kloner över stammar och behandlingar. Inkluderar de föräldrarna stammarna (MG1655, MG1655::resA och MG1655/pRESA) för att kunna detektera mutationer ansamlas under experimentet.
Obs: Exempel på DNA extraktion kit finns tabellen av material. Varje kit har olika protokoll; Följ tillverkarens instruktioner. - Kvantifiera DNA kvalitet och koncentration. Det finns olika metoder för att bestämma DNA kvalitet och koncentration. Bestämma kvaliteten mäta företagets nyckeltal absorbansen 260 nm/280 nm och 260 nm/230 nm. Använd en fluorescerande, DNA-bindande färg för att mäta DNA-koncentration efter tillverkarens anvisningar och agaros gel-elektrofores att bekräfta att det finns ingen DNA nedbrytning eller RNA kontaminering.
- Användning djup DNA-sekvensering från prover av hela befolkningar och enskilda kloner för att undersöka den genetiska grunden för antibiotikaresistens.
Obs: Vi har utfört alla sekvensering vid Wellcome Trust Centre for Human Genetics, Oxford, Storbritannien. För mer information se San Millan o.a. 201612. - Använda den breseq 0.26.1 pipeline27,28 att upptäcka mutationer, använder polymorfism läge för att uppskatta frekvensen av mutationer i populationer. Jämför de olika utvecklats genom att föräldrarnas genomet att detektera mutationer som har ackumulerats under experimentet.
- Jämför mutationerna ackumuleras parallellt i kontroll populationer med befolkningarna utvecklats under ökande koncentration av antibiotika för att skilja mellan mutationer att hjälpa bakterier att anpassa sig till den allmänna försöksbetingelser ( de hittade i kontroll populationer) och de inblandade i antibiotikaresistens (de som finns exklusivt i befolkningar utsätts för antibiotika påtryckningar).
Anmärkning: Antalet parallella mutationer är oftast låg, så olika parallella mutationer mellan behandlingarna kan bedömas enkelt. Förutom mutationerna i genen antibiotikaresistens enligt studien är det ganska troligt att hitta andra mutationer associerade med antibiotikaresistens i kromosomen, sådana mutationer i porins eller efflux system12. - Rekonstruera mutationerna i genen antibiotikaresistens i föräldrarnas stam med samma tillvägagångssätt som i avsnitt 1 i detta protokoll. Följ punkterna 1.1 och 1.2 i protokollet att införa de nya mutationerna i föräldrarnas bakgrund (med utvecklade generna som PCR-mall). Analysera antibiotikaresistens fenotyper av dessa nya konstruktioner att bekräfta rollen av mutationerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vårt tidigare arbete undersöktes utvecklingen β-laktamas gen blaTEM-1 mot ger resistens mot den tredje generationens cefalosporin ceftazidime12 . Denna gen valdes eftersom, även om TEM-1 inte medför att resistens mot ceftazidime, mutationer i blaTEM-1 kan utöka utbudet av aktiviteten av TEM-1 att hydrolysera cefalosporiner såsom ceftazidime29. Mutationer i antibiotikaresistens enzymer såsom β-laktamaser eller aminoglykosidmodifierande enzymer leder till förändringar i sitt sortiment av aktivitet är gemensamma29,30. Detta experimentella system är idealiskt för att utforska utvecklingen av denna typ av enzymer. För en detaljerad rapport om ett lyckat experiment efter detta protokoll se San Millan et al. 201612.
Här presenteras ett exempel på de möjliga resultaten av detta experimentella system för att illustrera protokollet (Observera att de uppgifter som används för det här exemplet inte är äkta). För att undersöka den potentiella rollen som multicopy plasmider i utvecklingen av antibiotikaresistens genen under studie i det här exemplet (låt oss kalla det resA), utvecklar vi den experimentella system efter avsnitt 1 i det protokoll som beskrivs ovan. Experimenten producera tre stammar: MG1655, MG1655::resA och MG1655/pRESA. Utvecklingen av resistens mot två olika ß-laktam antibiotika (ceftazidime och meropenem) testades följa stegen som beskrivs i avsnitt 2 i protokollet. Figur 2 visar överlevnadskurvor för befolkningen under studien. I det här exemplet finns det en betydande ökning av överlevnaden av populationer tillhör MG1655/pRESA utvecklas i ceftazidime jämfört med de från MG1655 eller MG1655::resA (log-rank-test, P< 0,05). Däremot, när det gäller meropenem, finns det inga signifikanta skillnader i överlevnad de populationer som tillhör de olika stammarna (log-rank-test, P> 0,05). Därför, dessa resultat tyder på att förekomsten av genen resA i en multicopy plasmid potentierar utveckling motstånd till ceftazidime men inte till meropenem.
I det sista steget av experimentet utreds den molekylära basen för antibiotikaresistens, vilket förklaras i avsnitt 3 i protokollet. Först, DNA-sekvensering kommer att avslöja mutationerna i resA som kunde ansvara för motstånd fenotypen. Och andra rekonstruktion av resA mutationer i den parental MG1655 (både i kromosom och plasmid) kommer att bekräfta eller ignorera deras roll på antibiotikaresistens fenotypen.
Figur 1 . Schematisk bild av de olika faserna i protokollet. Från vänster till höger: (i) byggande av det experimentella systemet: MG1655, MG1655::resA och MG1655/pRESA. Bakteriella kromosom representeras i brunt, plasmiden i blått och resA genen i rött. (ii) evolutionära rescue strategi att experimentellt utvecklas antibiotikaresistens: flera populationer av olika stammar sprids under ökande koncentration av antibiotika. (iii) analys av den molekylära basen för antibiotikaresistens: sekvensering av DNA prover från de utvecklade populationer och kloner, upptäckt av antibiotikaresistens mutationer och återuppbyggnaden av dessa mutationer i föräldrarnas stam. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Överlevnadskurvor med ökande koncentrationer av antibiotika. Representation av antalet livskraftiga populationer tillhör stammar MG1655, MG1655::resAoch MG1655/pRESA över tid. 48 populationer av varje stam spridits under ökande koncentrationer av antibiotika ceftazidime och meropenem, börjar med 1/8 av MIC på dag 1 och fördubbling antibiotikakoncentrationen varje dag. Den röda streckade vertikala linjen representerar MIC för antibiotika under studien. Observera att det finns signifikanta skillnader i överlevnad av befolkningen tillhör olika stammar över tid när det gäller ceftazidime (log-rank-test, P< 0,05). Endast populationer transporterar plasmiden är avgörande, kan överleva upp till höga koncentrationer av antibiotika. Däremot, när det gäller meropenem, finns det inga signifikanta skillnader i överlevnad i olika populationer över tid (log-rank-test, P> 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenterar ett nytt protokoll som kombinerar molekylärbiologi, experimentell evolution och djupa DNA-sekvensering för att undersöka betydelsen av multicopy plasmider i utvecklingen av antibiotikaresistenta bakterier. Även om detta protokoll kombinerar tekniker från olika områden, alla de metoder som krävs för att utveckla det enkel och kan utföras i en vanlig mikrobiologi laboratorium. De viktigaste stegen i protokollet är förmodligen byggandet av modell system stammar och återuppbyggnaden av de mutationer som observerats efter experimentell evolution (som utförs med exakt samma metod). Dock förenklar den isotermiska montering system21, avsevärt detta protokoll så alla användare med en mellanliggande nivå av erfarenhet i molekylärbiologi kan genomföra den.
En annan avgörande steg i protokollet är experimentell evolution under ökande koncentrationer av antibiotika. Som ett exempel börjar detta protokoll experimentet med ¼-1/8 av MIC för stammar och sedan fördubbling koncentrationen av antibiotika varje dag. En lägre grad av antibiotika förändring kunde dock öka risken för evolutionära rädda från utrotning26. Därför är graden av förändring av antibiotiska koncentrationerna en av de parametrar som kan ändras för att främja utvecklingen av antibiotikaresistens.
DNA-sekvensering och analys är också viktiga aspekter av experimentell design. Resultaten är mer okomplicerat när sekvensering utförs på DNA-prover både från hela befolkningar och från enskilda kloner, vid olika tidpunkter i experimentet. Sekvensering resultaten från populationer kommer att avslöja de allmänna skillnader i mutation profiler bland behandlingar, liksom selektiv svep av nyttiga mutationer över tid och potentiella händelser klonal störningar. När man analyserar sekvenser från populationer, är det bättre att filtrera mutationer som aldrig överträffat 10% frekvens i någon befolkning. Sekvenser från enskilda kloner hjälpa bekräfta resultat från populationer och, viktigast av allt, avslöja de specifika kombinationerna mellan de olika mutationer som observerats på populationsnivå. Dessa särskilda föreningar kan hjälpa till att avslöja epistatic interaktioner mellan mutationer, som spelar en avgörande roll i bakteriell anpassning31.
Med den här metoden har vi nyligen visat att multicopy plasmider påskynda utvecklingen av antibiotikaresistens, först genom att öka graden av uppkomsten av nya mutationer och sedan genom att förstärka effekten av mutationer på grund av ökad gen dosering12 . Därför vi utvecklade metoden som ett verktyg för att undersöka utvecklingen av antibiotikaresistens, men det kan ha ett mycket bredare spektrum av applikationer. Detta system kunde nämligen användas för att undersöka möjligheten för någon bakteriell gen att utvecklas mot en ny eller förbättrad funktion i ett mer allmänt sätt. Detta system skulle kunna användas, till exempel att testa en metabola enzym/väg förmåga att använda nya kol substrat32. Också, det skulle kunna användas i stället för hypermutators (bakterier med en defekt i de cellulära system som är involverade i DNA mismatch reparation) att undersöka adaptiv gen evolution i bakterier, undvika den mutationsanalys bias som infördes genom hypermutators.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Instituto de Salud Carlos III (planera Estatal de jag + D + jag 2013-2016): beviljar CP15-00012, PI16-00860 och CIBER (CB06/02/0053), medfinansieras av Europeiska regionala utvecklingsfonden '' ett sätt att uppnå Europa '' (ERUF). JAE stöds av programmet Atracción de talento av regeringen av regionen Madrid (2016-T1/BIO-1105) och jag + D Excelencia av den spanska Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (BIO2017-85056-P). ASM stöds av en Miguel Servet stipendium från Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012) medfinansieras av den Europeiskasocialfonden ”investera i din framtid” (ESF) och Europeiska regionala utvecklingsfonden.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine DNA quality measuring the ratios of absorbance 260nm/280nm and 260nm/230nm |
| Incubator | Memmert | UF1060 | |
| Incubator (shaker) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Electrophoresis power supply | BioRad | 1645070 | Agarose gel electrophoresis |
| Electrophoresis chamber | BioRad | 1704405 | Agarose gel electrophoresis |
| Pippettes | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Multi-channel pippetes | Biohit | 728220, 728230, 728240 |
|
| Plate reader Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Inoculating loops | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| 96-well plates | Falcon | 351172 | |
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB agar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polymerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Resctriction enzymes | Fermentas FastDigest | ||
| Antibiotics | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Plasmid extraction kit |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | gDNA extraction kit |
| DNeasy Blood & Tissue Kits | Qiagen | 69506 | gDNA extraction kit |
| Electroporation cuvettes | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| Petri dishes | Sigma-Aldrich | D9054 | |
| Cryotubes | ClearLine | 390701 | |
| 96-well plates (-80ºC storage) | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantification of DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Agarose gel electrophoresis |
| 50x TAE buffer | BioRad | 1610743 | Agarose gel electrophoresis |
| T4 Polynucleotide Kinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
References
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- MacLean, R. C., Hall, A. R., Perron, G. G., Buckling, A. The population genetics of antibiotic resistance: integrating molecular mechanisms and treatment contexts. Nat Rev Genet. 11 (6), 405-414 (2010).
- Buckling, A., Maclean, R. C., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nature Reviews Genetics. 14 (12), 827-839 (2013).
- Elena, S. F., Lenski, R. E. Evolution experiments with microorganisms: The dynamics and genetic bases of adaptation. Nature Reviews Genetics. 4 (6), 457-469 (2003).
- Lenski, R. E., Rose, M. R., Simpson, S. C., Tadler, S. C. Long-Term Experimental Evolution in Escherichia coli. I. Adaptation and Divergence During 2,000 Generations. The American Naturalist. 138 (6), 1315-1341 (1991).
- Bennett, A. F., Dao, K. M., Lenski, R. E. Rapid evolution in response to high-temperature selection. Nature. 346 (6279), 79-81 (1990).
- Bell, G. Evolutionary rescue and the limits of adaptation. Philosophical Transactions of the Royal Society B-Biological Sciences. 368 (1610), (2013).
- Bell, G., Gonzalez, A. Adaptation and Evolutionary Rescue in Metapopulations Experiencing Environmental Deterioration. Science. 332 (6035), 1327-1330 (2011).
- Bell, G., Gonzalez, A. Evolutionary rescue can prevent extinction following environmental change. Ecology Letters. 12 (9), 942-948 (2009).
- San Millan, A., Escudero, J. A., Gifford, D. R., Mazel, D., MacLean, R. C. Multicopy plasmids potentiate the evolution of antibiotic resistance in bacteria. Nature Ecology & Evolution. 1, 0010 (2016).
- Alekshun, M. N., Levy, S. B. Molecular mechanisms of antibacterial multidrug resistance. Cell. 128 (6), 1037-1050 (2007).
- Ochman, H., Lawrence, J. G., Groisman, E. A. Lateral gene transfer and the nature of bacterial innovation. Nature. 405 (6784), 299-304 (2000).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. Mobility of plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- San Millan, A., Heilbron, K., Maclean, R. C. Positive epistasis between co-infecting plasmids promotes plasmid survival in bacterial populations. ISME J. , (2013).
- Stoesser, N., et al. Evolutionary History of the Global Emergence of the Escherichia coli Epidemic Clone ST131. MBio. 7 (2), (2016).
- San Millan, A., et al. Multiresistance in Pasteurella multocida is mediated by coexistence of small plasmids. Antimicrob Agents Chemother. 53 (8), 3399-3404 (2009).
- Escudero, J. A., et al. Unmasking the ancestral activity of integron integrases reveals a smooth evolutionary transition during functional innovation. Nat Commun. 7, 10937 (2016).
- Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Chaveroche, M. K., Ghigo, J. M., d'Enfert, C. A rapid method for efficient gene replacement in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Nucleic Acids Res. 28 (22), 97 (2000).
- Le Roux, F., Binesse, J., Saulnier, D., Mazel, D. Construction of a Vibrio splendidus mutant lacking the metalloprotease gene vsm by use of a novel counterselectable suicide vector. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 777-784 (2007).
- Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; 19th ed. Approved standard M100-S19. , Clinical and Laboratory Standards Institute. Wayne, PA, USA. (2009).
- Lindsey, H. A., Gallie, J., Taylor, S., Kerr, B. Evolutionary rescue from extinction is contingent on a lower rate of environmental change. Nature. 494 (7438), 463-467 (2013).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
- Barrick, J. E., et al. Identifying structural variation in haploid microbial genomes from short-read resequencing data using breseq. BMC Genomics. 15, 1039 (2014).
- Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 β-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
- Ramirez, M. S., Tolmasky, M. E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 13 (6), 151-171 (2010).
- Jerison, E. R., Desai, M. M. Genomic investigations of evolutionary dynamics and epistasis in microbial evolution experiments. Current Opinion in Genetics & Development. 35, 33-39 (2015).
- Toll-Riera, M., San Millan, A., Wagner, A., MacLean, R. C. The Genomic Basis of Evolutionary Innovation in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Genet. 12 (5), 1006005 (2016).
