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Behavior

Valutazione basata sulle attività di anoressia in topi

Published: May 14, 2018 doi: 10.3791/57395
Automatic Translation
1, 1,2, 1
1Department of Psychiatry, University of California, San Diego, 2University of California, Los Angeles

Summary

Topi alloggiati individualmente con una rotella corrente mentre dato accesso limitato al cibo sviluppano riduzioni nel consumo alimentare e aumentano l'attività sulla ruota in esecuzione. Questo fenomeno sperimentale viene chiamato anoressia basato sulle attività. Questo paradigma fornisce uno strumento sperimentale per lo studio della neurobiologia e comportamenti sottostanti gli aspetti dell'anoressia nervosa.

Abstract

Roditori sviluppano anoressia basato sulle attività (ABA) quando esposti a un programma di alimentazione limitato e consentito l'accesso gratuito ad una rotella corrente. Queste condizioni portano a una pericolosa riduzione del peso corporeo. Tuttavia, roditori esposti a una sola di queste condizioni, in definitiva, adattano per ristabilire il peso corporeo normale. Anche se aumentato esecuzione accoppiato con riduzione dell'ingestione di cibo volontaria apparire paradossale in condizioni di ABA, ABA comportamento è osservato attraverso numerose specie di mammiferi.

Il paradigma di ABA fornisce un modello animale per anoressia nervosa (AN), un disturbo alimentare con grave alterazione dell'appetito-comportamento. Soggetti sono alloggiati singolarmente con accesso gratuito ad una rotella corrente. Ogni giorno, il soggetto viene offerto cibo per un periodo limitato di tempo. Durante il corso dell'esperimento, il peso corporeo di un soggetto diminuisce da alta attività e basso apporto calorico. La durata dello studio varia in base quanto cibo è offerto ogni giorno, il tipo di cibo offerto, il ceppo del mouse, se i farmaci sono in fase di test e fattori ambientali.

Una mancanza di trattamenti farmacologici efficaci per un pazienti, qualità della vita bassa, alto costo del trattamento e loro alto tasso di mortalità indicano l'urgenza di ulteriori ricerche AN. Forniamo una struttura di base per l'esecuzione di ABA esperimenti con i topi, offrendo un metodo per indagare AN-come comportamento al fine di sviluppare nuove terapie. Questo protocollo è ottimizzato per l'utilizzo in topi Balb/cJ, ma può essere facilmente manipolato per altri ceppi, offrendo grande flessibilità nel lavorare con diverse domande, soprattutto legate a fattori genetici dell'ABA.

Introduction

Dal 1953, roditori sono stati segnalati per mostrare un'iperattività paradossale sull'esecuzione ruote quando ricevono accesso gratuito alle ruote mentre subiva hypophagia volontaria quando la disponibilità di cibo è limitato1. Al contrario, roditori non cadere rapidamente nel peso corporeo quando offerto cibo su un programma senza eseguire ruote o quando ospitato con rotelle di scorrimento in e offerto cibo ad libitum1,2,3. Il modello di ABA in modo affidabile risultato drammatico calo del peso corporeo, hypophagia, ipotermia, perdita di estro e una maggiore stimolazione dell' asse HPA4. In definitiva, ABA provoca la morte, a meno che il soggetto è rimosso dal paradigma5. Il paradigma di ABA offre ai ricercatori un modello animale di AN, un complesso disturbo alimentare caratterizzata da grave alterazione dell'appetito-comportamento, che colpisce circa 1 su 100 femmine e una minore percentuale di maschi6. I pazienti affetti da AN esibiscono frequentemente iperattività, che consiste di estrema quantità di esercizio fisico, e/o irrequietezza generale7,8. Con un tasso di mortalità di circa il 10%, AN ha il più alto tasso di mortalità tra tutti i disturbi psichiatrici9. Il trattamento corrente per AN è limitato alle terapie cognitive, come esistono trattamenti farmacologico approvato per chi soffre di una di10,11.

AN è stato considerato in genere come un disordine che interessa principalmente le femmine. Come una diagnosi che è 10 volte più probabile nelle femmine rispetto ai maschi, soggetti di sesso femminile sono tradizionalmente il fuoco in un12. Tuttavia, dovrebbe adottare particolare attenzione ad escludere i maschi dagli studi. Mentre la diagnosi di un resti inferiore nei maschi, dismorfia muscolare (MD) è una condizione che ha molte somiglianze con AN, in quanto è distorta immagine corporea e dieta è spesso disordinata. Non c'è supporto per la nozione che la MD e AN possono essere classificati in un simile modo13,14,15. Questo potrebbe suggerire che alcuni casi di MD rappresentano la versione"maschile" di AN. Nel contesto di modelli animali, alcuni rapporti hanno suggerito che i maschi sono più suscettibili rispetto alle femmine il paradigma di ABA. Ad esempio, un recente studio ha mostrato un più alto tasso di mortalità e diminuita assunzione di cibo rispetto alle femmine di topi C57Bl/616. Un fattore predittivo di suscettibilità all'ABA è l'attività fisica spontanea (SPA). Ratti con maggiore o minore SPA sono più probabilità di perdere peso nel paradigma della ABA, con maschi ratti che mostrano un effetto più forte di femmine17. Al contrario, femminile roditori sono stati osservati per esercitare più di maschi durante la fase di restrizione di ABA18. Inoltre, studi con topi Balb/cJ hanno dimostrato l'effetto opposto di topi C57Bl/6, dove i topi femminili hanno un più alto tasso di mortalità e diminuita assunzione di cibo rispetto ai maschi (Figura 1)6. Con diversi risultati tra i sessi nel paradigma della ABA e aumentare la consapevolezza dei maschi con disordinata mangiare modelli, soggetti maschili e femminili devono essere testati.

A parte le differenze del sesso nel paradigma della ABA, età e ceppo deve essere considerati quando scegliendo soggetti. Adolescente topi possono modellano più accuratamente AN, poiché AN in genere emerge nell'adolescenza, come osservato con ratti e topi19,20,,,2122. Ceppi che sono più attivi di altri a livello della linea di base hanno un più alto tasso di suscettibilità e la severità di ABA23. Ceppi conosciuti per avere livelli elevati di ansia, come DBA/2, hanno aumentato l'attività, che indicherebbe un più veloce tasso di abbandono del paradigma di ABA24della rotella. Secondo il disegno sperimentale, il ceppo di scelta può essere adattato per massimizzare la durata dell'ABA.

Il paradosso di ABA non è univoco ai topi. Altri mammiferi tra cui ratti, criceti, gerbilli, maiali, scoiattoli e cavie hanno dimostrato questo fenomeno6. La conservazione del fenomeno ABA attraverso specie di mammiferi suggerisce che il paradigma di ABA può fornire uno strumento traslazionale per studiare i meccanismi alla base di anoressia-come comportamento negli esseri umani. Topi in particolare sono adatti per lo studio dei meccanismi alla base di ABA. Topi possono essere alloggiati densamente e tempo di generazione è relativamente breve. I topi hanno un genoma sequenziato completamente, e numerosi ceppi inbred, nazionali e speciali, ad esempio congenics, sono disponibili. Un vasto numero di linee geneticamente manipolati è stato generato, che li rende ideale per gli studi di valutazione genetica influenza sui disturbi quali e Depending sulla questione a portata di mano, i ricercatori possono manipolare l'espressione complessa di circuiti e/o gene neurale per valutare il comportamento del paradigma di ABA, potenzialmente rispondendo alle domande su influenza genetica che non sono possibili quando si studia gli esseri umani.

Un numero limitato di modelli animali di AN attualmente esistenti. Modelli di stress inducono hypophagia nei roditori utilizzando coda pizzicotti, indotta da novità hypophagia, piscina fredda e stimolazione cerebrale. Attraverso l'induzione di stress, cambiamenti nell'asse HPA diminuiscono l'appetito con conseguente corpo ridotto peso25. Tuttavia, l'asse di HPA è anche potentemente stimolato dall'ABA, che incorpora anche funzionalità aggiuntive di AN come iperattività. Un altro modello da considerare a studiare AN è la restrizione alimentare cronica. Limitando il cibo ad una gamma da 40 a 60% di ad libitum, uno in grado di simulare la risposta fisiologica a malnutrizione26. Anche se questo metodo è efficace per studiare gli effetti di alimentazione inadeguata, non riprodurre una questione fondamentale di AN, che è la restrizione alimentare volontaria. Nel paradigma della ABA, gli animali sono privi di accesso al cibo per parte della giornata, ma anche volontariamente riducono l'ingestione di cibo, se è presente anche una ruota. Modelli genetici sono stati utilizzati anche per esaminare l'eziologia dei ricercatori e hanno trovato fattori neurochimici e genetici implicati in AN, come il gene BDNF e neurotrasmettitori dopamina e serotonina27. L'uso di modelli genetici è fondamentale capire i meccanismi neurali alla base AN. Tuttavia, gli studi di vasta associazione di genoma per AN non hanno ancora dato i successi significativi, e non rare varianti in AN sono state identificate. Gli studi futuri dovrebbero combinare un approccio genetico con il modello di ABA per aumentare la comprensione dei fenotipi AN-correlati.

Lo sviluppo di modelli animali per intero disturbi psichiatrici è praticamente impossibile a causa della complessità e l'eterogeneità dei disordini umani. Tuttavia, di componenti specifici, ben definite di un disturbo psichiatrico di modellazione, è possibile ottenere intuizioni uniche di neurobiologia o fisiopatologia sottostante. Tali intuizioni biologici possono quindi essere utilizzati per identificare nuovi trattamenti. Il paradigma di ABA roditore pertanto fornisce uno strumento preclinico per studiare i meccanismi alla base di un simile comportamento che eticamente non può essere studiato nell'uomo, come gli effetti delle manipolazioni genetiche, perturbazioni ai circuiti neurali e la conseguenze di alcuni fattori ambientali.

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Protocol

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di California, San Diego.

1. topi

  1. Scegliere il ceppo del mouse appropriato per lo studio.
  2. Topi di acquistare da un fornitore o amplificare una linea per ottenere numeri sperimentali appropriati.
  3. Gruppo-casa acquistata topi nella struttura animali per almeno 1 settimana prima dell'inizio dello studio per consentire per un periodo di acclimatazione ampio.
  4. Iniziare la fase di acclimatazione pre-sperimentale quando i topi sono 8 settimane di vita.

2. abitazione

  1. Scegliere gabbie che sono abbastanza grande da contenere una rotella corrente non ostruita, ricettacolo di cibo e una bottiglia d'acqua.
  2. Regolare la temperatura e l'umidità per integrare l'ipotesi da testare.
    Nota: Temperature più elevate riducono lo sviluppo di ABA28.

3. rotelle di scorrimento in

  1. Scegliere ruote con comunicazione wireless per evitare potenziali distrazioni e coinvolgimenti all'interno della gabbia, vedere la Tabella materiali per un esempio.

4. bottiglie di acqua

  1. Selezionare una bottiglia di acqua che non saranno in concorrenza per lo spazio con il running ruota o recipiente di cibo dalla gabbia.
  2. Se fornendo trattamento farmacologico nell'acqua potabile, nastro di condotta della bottiglia per creare un ambiente sensibile alla luce.

5. cibo

  1. Selezionare un chow di basso contenuto di grassi appropriato per l'ipotesi in fase di test (ad es., roditore dieta 8604 di Envigo).
    Nota: Le diete alte in grassi e zuccheri possono ridurre lo sviluppo di ABA29.
  2. Utilizzare un piccolo vaso di vetro per fornire chow, circa 65 cm di diametro x 50 cm in altezza.
    Nota: Un alimentatore automatico può essere utilizzato invece di un barattolo di vetro, che può ridurre lo stress limitando l'interferenza di investigatore. Questo può essere più vantaggioso se eseguire studi di ABA con manipolazioni farmacologiche.

6. fase di acclimatazione pre-sperimentale

  1. Impostare l'area sperimentale scegliendo un rack di gabbia vicino i mozzi ruota e computer portatile. Ciò limiterà problemi con trasmissione dei dati.
  2. Accendere il computer portatile e senza fili mozzi.
  3. Aprire il software di gestione di ruota sul portatile.
    1. Guarda il software per garantire che entrambi gli hub sono attivi.
    2. Apri "strumenti" e seleziona "Elimina ruote". Ripetere questo passaggio 5 volte.
    3. Chiudere il software, quindi riaprirlo.
  4. Inserire 3 batterie AAA nella batteria di una base della rotella.
    1. Collegare i cavi di pack batteria all'hardware della base della rotella. Questo sarà disconnesso prima dell'uso. Chiudere il pacco batteria nella base della rotella.
  5. Controllare il software affinché la base della rotella è elencato con l'ID "1" sotto l'hub wireless appropriata. Se la base non è elencata come ID "1", sganciare la batteria e iniziare sopra al punto 6.2.
  6. Modificare l'ID di ruota da "1" per l'ID del mouse nella colonna nome.
  7. Base di rotella corrente sul fondo della gabbia con del nastro adesivo per garantire stabilità di aderire. Non consentire qualsiasi nastro attaccare fuori, come topi saranno masticare sul nastro esposto.
  8. Scegli un disco volante in esecuzione senza un pezzo magnetico corroso.
  9. Posizionare la ruota sulla base e ruotare la rotellina per verificare la distanza dalle pareti della gabbia e grata.
  10. Girare il disco un numero specifico di rotazioni per garantire che il software della rotella è correttamente conteggio rotazioni.
  11. Evitare che pezzi di chow vada perduta sul bagnato biancheria da letto o di ottenere dal dotto-taping la parte inferiore del vaso del cibo per il piano di gabbia, lontano la ruota e la bottiglia d'acqua.
    Nota: Chow bagnato aumenta l'assunzione di cibo rispetto ad per asciugare chow30.
  12. Posto 5 pezzi di chow nel barattolo.
    Nota: Il chow durante la fase di pre-sperimentale è disponibile ad libitum e non deve necessariamente essere pesato. L'esposizione all'esecuzione ruote durante il periodo di acclimatazione può intensificare ABA21,31.
  13. Posizionare una bottiglia piena di acqua nella gabbia e fornire acqua ad libitum.
  14. Ripetere fino a quando tutte le gabbie hanno una trazione in esecuzione in modalità wireless collegato, cibo e acqua.
  15. Individualmente posizionare topi nelle loro gabbie appropriate.
  16. Nella ruota gestione del software, andare su "file" e fare clic su "Avvia acquisizione".
  17. Guarda l'aggiornamento del software per garantire rotazioni ruota vengono contate e il sistema sta funzionando bene.
  18. Acclimatare topi per le condizioni di stabulazione per 2 giorni totale.
  19. Valutare topi durante questa fase per garantire che siano abbastanza sani per gestire l'esperimento di ABA.
  20. Verifica gabbie per qualsiasi allagamento da bottiglie di acqua ogni giorno. Se bottiglie hanno allagato, sostituire la vecchia gabbia con una nuova gabbia e ripetere i passaggi necessari per aderire ruote e cibo per la gabbia senza interferenze.
  21. Il giorno 2, verifica gabbie per i livelli di cibo. Se il cibo è basso, rabboccare con 2 pezzi di chow. Farlo senza disturbare i topi.
    Nota: Se durante la fase di acclimatazione pre-sperimentale qualsiasi mouse espone hypophagia o è sottopeso, rimuovere il mouse dallo studio.

7. sperimentale della linea di base fase - giorno 1

  1. Selezionare "fine" e poi "Avvia acquisizione" nel software di gestione della rotella.
  2. Misurare chow 9 g in un piccolo bicchiere in plastica su una scala con sensibilità 0.00 g. Registrare il peso esatto.
  3. Rimuovere delicatamente e pesare il mouse in un grande bicchiere in plastica su una scala con sensibilità 0.0 g. Peso record.
    Nota: È fondamentale limitare lo stress dei topi durante la manipolazione, quindi gestirli con pazienza.
  4. Smaltire tutto il cibo acclimatazione.
  5. Biancheria da letto di ricerca per qualsiasi cibo che sia stato rimosso dal vaso e smaltire che pure.
  6. Lasciare la bottiglia d'acqua in luogo, ma assicurarsi che sia adeguatamente completo.
  7. Pulire sporchi in esecuzione ruote con 70% isopropanolo e carta asciugamani.
  8. Se la pulizia era necessario, dopo che si asciuga l'isopropanolo, tornare il mouse alla sua gabbia e sostituire la gabbia sul rack.
  9. Ripetere questi passaggi fino a quando ogni mouse viene pesato e 9 g di cibo è misurata fuori e messi in gabbie.

8. sperimentale della linea di base fase - 2-7 giorni

  1. Tornare all'alloggio degli animali allo stesso tempo ogni giorno. Non variano nel prendere misure di più o meno di 10 min.
  2. Misurare chow 9 g in un piccolo bicchiere in plastica su una scala con sensibilità 0.00 g. Registrare il peso esatto.
  3. Rimuovere delicatamente e pesare il mouse in un grande bicchiere in plastica su una scala con sensibilità 0.0 g. Peso record.
  4. Tirare il barattolo di cibo fuori dalla gabbia e dump tutto il cibo in un piccolo Becher sulla scala 0.00 g.
    1. Se le feci e biancheria da letto sono nel vasetto con il cibo, scegliere tutte le lenzuola e le feci. Usare un piccolo setaccio per strofinare il cibo in polvere nel becher pesatura. Rimuovere qualsiasi feci prima di fare questo con una pinzetta (se necessario).
      NOTE: Biancheria da letto non si romperà in pezzi più piccoli per passare attraverso il filtro.
    2. Cercare eventuali residui di cibo nella gabbia e aggiungerli al becher da pesare. Registrare la quantità di cibo restanti.
      Nota: Se la biancheria da letto e la gabbia deve essere cercati, è meglio farlo mentre il mouse è nella gabbia pesare Becher o trasferimento per ridurre lo stress.
    3. Smaltire tutto il cibo.
  5. Pulire il vaso pulito e inserire nuovamente la gabbia. Se necessario, sostituire il nastro.
  6. Posto il misurato in precedenza 9 g di nuovo alimento nel barattolo.
  7. Pulita di sporco in esecuzione ruote con 70% isopropanolo, quindi asciugare le ruote. Fare questa uno gabbia alla volta e non accidentalmente scambiare ruote.
  8. Terminare e riavviare l'acquisizione nel programma della rotella ogni altro giorno.
  9. Ripetere questi passaggi fino all'inizio della fase di restrizione.

9. sperimentale restrizione fase - giorno 1

  1. Fine e inizio acquisizione del software di gestione di ruota.
  2. Pesare il cibo di vecchi e nuovi di topi, secondo il protocollo di linea di base.
  3. Non pulire le ruote ora. Questo potrebbe distrarre topi durante il loro periodo di alimentazione limitata.
  4. Consentire l'accesso al nuovo cibo, 9 g di chow, per 6 h. Registrare l'ora di cibo è offerto.
    Nota: Il tempo durante il ciclo di luce che il cibo è disponibile influenzerà lo sviluppo dell'ABA. Poiché topi dormono normalmente durante il ciclo di luce, dando accesso al cibo durante questo tempo esacerba lo sviluppo dell'ABA, dal momento che i topi non consumano solitamente la maggior parte del loro cibo quotidiano in questo momento. Al contrario, topi dati accesso al cibo durante il ciclo scuro si svilupperanno più lentamente ABA32. Regolare la durata dell'accesso al cibo si tradurrà in più o più breve sopravvivenza volte (Figura 2). Attività anticipatoria cibo (FAA) è iperattività, che si verifica immediatamente prima che il cibo è offerto32,33,34. FAA può influenzare lo sviluppo dell'ABA, come è stato dimostrato che la negazione di accesso della rotella durante FAA migliora ABA comportamento32.
    1. Rimuovere il cibo esattamente 6 h più successivamente per ogni mouse e misurare il quantitativo residuo. Registrare l'ora di cibo viene rimosso.
  5. Pulire le ruote in questo momento, se necessario e tentare di farlo senza ottenere il tirando cibo dalle gabbie successive.
  6. Pesare il cibo e calcolare la differenza in cibo per determinare la quantità di cibo mangiato per topo.
  7. Calcolare il peso di dropout per ogni mouse.
    Nota: Peso di Dropout è quando un mouse deve essere rimosso dall'esperimento quando raggiunge il 75% della sua misurazione finale del peso corporeo basale. Ad esempio, se un mouse pesa 20g all'inizio della fase di restrizione, quando raggiunge 15 g deve essere rimosso dall'esperimento.
  8. Conservare una copia del forcellino pesi sul mano nella struttura degli animali.
    Nota: Gli esperimenti valutazione recupero da ABA possono essere tentati; il cibo è sia fornito ad libitum o ruote sono bloccate, per studiare il processo mediante il quale topi ritorno un corpo sano peso34.

10. sperimentale restrizione fase - 2 e 14 giorni

  1. Ripetere tutti i passaggi di misurazione nel protocollo 1 giorno di restrizione. Non riavviare acquisizione di ruota.
  2. Se un mouse raggiunge goccia peso (75% del suo peso corporeo basale), rimuovere il vaso ruota e cibo dalla gabbia e fornire cibo in abbondanza sul fondo della gabbia, quindi procedere con altri topi. Una volta che hanno visto la partecipazione di tutte le gabbie, eutanasia tutti i topi che hanno raggiunto il peso di goccia.
  3. Lasciare la ruota per ogni mouse per tutta la durata dell'esperimento.
  4. Controllare ogni mouse al giorno per eventuali lesioni. Se necessario, clip danneggiati le unghie dei piedi, trattare piaghe, ecc Ask personale di cura degli animali per un Consiglio se non siete sicuri su come procedere con un infortunio.

11. che termina lo studio

  1. Se lo studio è durato 14 giorni, pesare tutti i topi il giorno 15. Restrizione giorno 1 peso è considerato un peso basale.
    Nota: La lunghezza dello studio può essere modificata per indirizzare l'ipotesi da testare. Lunghi periodi di accesso cibo di durata possono essere utilizzati per estendere la lunghezza di studio.
  2. Eutanasia topi come necessario.
  3. Prendere attrezzature sporche di camere adeguate.
  4. Fine acquisizione totali ruota il giorno 15 di fornire 10 giorni completi dei dati.
  5. Disabilita i mozzi delle ruote senza fili.
  6. Estrarre i dati.
  7. Analizzare i dati.

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Representative Results

Fattore neurotrophic cervello-derivato (BDNF), una proteina che contribuisce alla regolazione di alimentazione così come manutenzione del peso, è ridotta nel siero di pazienti con un35. Questo esperimento ha valutato gli effetti dell'alimentazione pianificata, in esecuzione accesso ruota o entrambi sull'espressione di BDNF nell'ippocampo (HPC), area tegmentale ventrale (VTA), nucleo accumbens (NAc) e la corteccia prefrontale mediale (mPFC). Espressione della molecola di adesione delle cellule neuronali 1 (NCAM1) inoltre è stata valutata per esplorare la specificità degli effetti il BDNF all'interno della via mesocorticolimbic.

Topi sono stati alloggiati individualmente all'interno di un ciclo luce-buio di 12:12 in una sala climatizzata in una struttura di cura degli animali. Gabbie erano equipaggiate con ruote in esecuzione senza fili che inoltrati dati ogni 30 s a un computer portatile. Cibo standard è stato offerto in un vaso di circa 2" di diametro, con pareti circa 1,5" alta durante i periodi della linea di base e la restrizione.

Quattro gruppi sperimentali sono stati assegnati in modo pseudo-casuale: ad libitum (Ad Lib), pianificata (STV) di alimentazione, ruota libera in esecuzione e accesso al cibo (RUN) o ruota libera in esecuzione con restrizione alimentare (ABA) (Figura 3). Assegnazione del gruppo è stata determinata dal peso corporeo iniziale per formare quattro gruppi di peso equivalente. I topi erano singolarmente ospitati e alimentati ad libitum con accesso costante ad una rotella corrente per 2 giorni durante il periodo di acclimatazione e 7 giorni durante il periodo di previsione.

Durante il periodo di accesso programmato cibo fino a 12 giorni, gruppi sia STV e ABA aveva accesso al cibo per solo 6 h al giorno (09:00-15:00) e sono stati monitorati e rimosso se hanno incontrato il loro peso di goccia calcolato pari al 25% del loro peso corporeo iniziale. Sono stati effettuati adeguamenti giornalieri per limitare l'accesso al cibo per il gruppo STV, per garantire che il gruppo STV ha avuto un tasso di abbandono simili come il gruppo di ABA, i cui membri normalmente perdono peso corporeo più rapidamente. Ogni mouse RUN era aggiogati a un mouse di ABA per rimozione dallo studio, e ogni mouse Ad Lib era aggiogati a un mouse STV. Aggiogare garantito che tutti i topi sono stati rimossi dallo studio in simili momenti. Questo disegno ha permesso per il confronto dell'espressione genica tra gruppi di topi che sperimentato varie condizioni sperimentali per la stessa durata. Il numero di giorni per la rimozione è stato interpretato come una misura di sopravvivenza. Un'altra possibilità consiste nell'includere un ulteriore gruppo di esecuzione che non è limitato a mangiare poco come il gruppo di ABA, ma viene fornito con un eccesso di cibo durante il periodo di 6 h. Inoltre, possono essere utilizzati 5 gruppi sperimentali, tra cui entrambe le forme del gruppo RUN. La scelta dei gruppi dipende dagli obiettivi dello studio.

Dopo la rimozione dal paradigma ABA, topi sono stati decapitati per estrazione rapida del cervello. Tessuto dal mPFC, HPC, NAc e VTA è stato rimosso utilizzando una matrice di cervello e punzone di tessuto e immediatamente snap congelato utilizzando ghiaccio secco. Campioni sono stati conservati in un congelatore-80 ° C prima dell'estrazione di RNA.

Analisi statistica dei dati è stata eseguita mediante test di analisi della varianza (ANOVA). Per i dati di base, ANOVA viene applicato a ogni variabile dipendente (peso corporeo, assunzione di cibo e della rotella). Post hoc, analisi della varianza o interazioni sono state eseguite. Quando sono stata applicata post hoc, analisi della varianza, sono stati effettuati adeguamenti di Bonferroni.

Per analizzare i dati da restrizione, modelli lineari generali (PROC GLIMMIX; V 9.2 SAS; codice disponibile da autore corrispondente su richiesta) sono utilizzati per valutare ogni variabile. Analisi post hoc, vengono utilizzati per risolvere interazioni utilizzando il metodo del tasso di falsi scoperta. Analisi di sopravvivenza è stata eseguita utilizzando il test di Kaplan-Meier con Logrank (Mantel-Cox) e Peto-Peto-Wilcoxon test post hoc . Significato è stato fissato a p < 0.05.

Della rotella non ha colpito il peso corporeo durante la linea di base, mentre il consumo alimentare è aumentato durante l'esecuzione di ruote erano disponibili nei giorni della linea di base 2-7. Prima dell'alimentazione pianificata, attività sulle ruote in esecuzione non era differente tra i gruppi RUN e ABA.

Poiché i topi Ad Lib e RUN erano aggiogati ai topi STV e ABA, rispettivamente, non c'era alcuna differenza nella sopravvivenza fra gruppi sperimentali durante l'alimentazione programmata (Figura 4a). Senza aggiogare, sopravvivenza dei topi di ABA è drasticamente ridotto rispetto ai gruppi RUN e STV35. Tuttavia, il peso corporeo è stato ridotto nei giorni 1-5 in entrambi i gruppi esposti a pianificata (STV e ABA gruppi) di alimentazione (Figura 4b). Prevista alimentazione anche ridotto apporto di cibo nei giorni 1-5 in entrambi i gruppi (Figura 4c), ma non ha avuto effetto su attività (Figura 4d) della rotella. In questo studio, iperattività del gruppo ABA è stato breve (giorni 1-3) e non significativo rispetto al gruppo di RUN, forse a causa della salute in rapido declino dei topi nella condizione di ABA.

L'espressione del BDNF significativamente aumentato in esecuzione ruota all'interno la VTA (Figura 5a) mentre la restrizione dell'alimento ha aumentato l'espressione di mRNA di NCAM1 in VTA (Figura 5b), ma non ha alterato l'espressione del mRNA BDNF. Non c'erano effetti principali di accesso ruota o cibo, o interazioni il BDNF o NCAM1 l'espressione del mRNA all'interno il NAc (Figura 6). In mPFC, alimentazione pianificata diminuita espressione del mRNA BDNF, ma non ha colpito l'espressione del mRNA di NCAM1 (Figura 7). Accesso ruota non ha alterato l'espressione genica, e alcuna interazione di restrizione alimentare e accesso ruota sono stati trovati. Allo stesso modo, in HPC, non c'erano alcuna interazione di accesso al cibo restrizione e ruota il BDNF o l'espressione del mRNA di NCAM1, anche se la restrizione dell'alimento ha aumentato l'espressione del mRNA di NCAM1 (Figura 8).

Figure 1
Figura 1 : Sesso differenze nel paradigma ABA. (un) sopravvivenza cumulativa tra maschio e femmina topi nel corso del tempo. (b), del peso corporeo tra maschio e femmina topi sopra l'ingestione di cibo giorni (c) restrizione tra topi maschi e femmine nei giorni di restrizione. (d) ruota corsa tra topi maschi e femmine nei giorni di restrizione. Questa figura è stata modificata dalla pubblicazione originale6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Effetti dell'alimentazione volte su ABA durata. Questa figura mostra come molti topi giorni rimarrà nella restrizione a seconda di quanto tempo il cibo è disponibile. Questo è mostrato per topi con e senza ruote. Questa figura è stata modificata dalla pubblicazione originale35. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : ABA paradigma sperimentale Design. Questa immagine mostra il set up per esperimenti di ABA. Questa figura è stata modificata dalla pubblicazione originale36. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 : Effetti del paradigma ABA. (un) sopravvivenza, (b) giornaliero del peso corporeo, (c) cibo consumato e (d) della rotella durante la restrizione di cibo. I numeri in corsivo raffigurano numero di topi restanti nel paradigma della ABA. Risultati sono espressi come media ± SEM Questa figura è stata modificata dalla pubblicazione originale36. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 : Effetti dell'ABA sull'espressione del Gene in VTA. (un) BDNF, (b) NCAM1 espressione nell'ATV di topi esposti a condizioni di ABA. Inserti in indicare l'espressione di BDNF e NCAM1 media durante la restrizione per la misura indipendente raffigurata. Risultati mostrati come log2(RQ) ± SEM p < 0.05. Questa figura è stata modificata dalla pubblicazione originale36. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6 : Effetti dell'ABA sull'espressione del Gene nel nuclei Accumbens. (un) BDNF, (b) NCAM1 espressione nel NAc dei topi esposti a condizioni di ABA. Risultati mostrati come log2(RQ) ± SEM p < 0.05. Questa figura è stata modificata dalla pubblicazione originale36. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 7
Figura 7 : Effetti dell'ABA sull'espressione del Gene nella mPFC. (un) BDNF, (b) espressione di NCAM1 alla mPFC dei topi esposti a condizioni di ABA. L'inserto indica l'espressione del BDNF media durante la restrizione per la misura indipendente raffigurata. Risultati mostrati come media ± SEM di log2(RQ) p < 0.05. Questa figura è stata modificata dalla pubblicazione originale36. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 8
Figura 8 : Effetti dell'ABA sull'espressione del Gene in HPC. (un) BDNF, (b) NCAM1 espressione in HPC dei topi esposti a condizioni di ABA. Inserti in indicare media espressione di BDNF e NCAM1 durante la restrizione per la misura indipendente raffigurata. Risultati mostrati come media ± SEM di log2(RQ) p < 0.05. Questa figura è stata modificata dalla pubblicazione originale36. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'esperimento di ABA può essere modificato da sperimentatori di testare diversi ceppi, età, droghe e varie altre variabili del cuscinetto e nella variabilità genetica mente, regolazioni per il running ruota o il periodo di accesso di cibo sarebbero aumentare o fare diminuire la severità di sintomi e tasso di dropout. Questo può servire per aumentare o diminuire la durata dell'esperimento, a seconda della domanda sperimentale di interesse.

Misurazione accurata dell'ingestione di cibo è una parte critica del paradigma ABA, ma può essere fatta spesso problematico. Biancheria da letto, feci e urina nel vasetto, accoppiato con il cibo essendo spostato nello spazio gabbia fornisce difficoltà di pesare accuratamente restanti ingredienti. I topi lasciano anche piccoli pezzetti di cibo e cibo in polvere in vaso e in tutta la gabbia. Un filtro consente di attenuare il problema di spulciando tra le lenzuola per trovare resti di cibo per le registrazioni di peso adeguato, ma il metodo non è infallibile. Gestire i topi per ottenere loro pesi è un altro fattore cruciale, ancora confusione nel paradigma della ABA. Con interferenza di investigatore, i topi sono più vulnerabili allo stress, che può aggravare le condizioni dell'ABA.

ABA è un metodo utile nel valutare AN, tuttavia questa tecnica venire con limitazioni. La prima limitazione da considerare è che il modello di ABA non imitare tutti gli aspetti dell'anoressia. Ad esempio, roditori dati accesso a una dieta grassa alta non svilupperà ABA sotto condizioni sperimentali tipiche30. Tuttavia, virtualmente nessun modelli animali esistono che ricapitolare tutti gli aspetti di un disturbo psichiatrico. Così, ABA potrebbe ancora produrre importanti intuizioni comportamenti AN-correlati.

Trattamenti farmacologici possono anche essere implementati nel paradigma della ABA. Drug administration tramite l'acqua potabile è ideale, in quanto evita le iniezioni quotidiane che possono avere effetti indesiderati tra cui irritazione locale nel sito di iniezione e a breve termine sedazione indotta da alcuni farmaci. Tuttavia, è fondamentale per regolare la concentrazione di farmaco al giorno per mantenere il dosaggio costante, dal momento che l'assunzione giornaliera di acqua cambia drammaticamente nel corso di ABA, prima con gli aumenti nel bere e poi con riduzioni nel consumo di liquidi. Utilizzando sottocutanee mini pompe per fornire droga continuamente è anche possibile con il paradigma di ABA; Tuttavia, si deve prestare attenzione che le mini pompe sono abbastanza piccole da consentire topi entrare e uscire di barattoli per alimenti ed eseguire senza ostacoli sulla ruota in esecuzione. Inoltre, l'uso di cavi in fibra optogenetica è teoricamente fattibile, ma richiederebbe un set-up modificate. In alternativa, manipolazione dell'attività di specifici circuiti utilizzando Progettazione recettori attivati esclusivamente da droghe di sintesi (DREADD) potrebbe essere usata con il paradigma di ABA senza la complicazione del insito cavi. Così, una varietà di strumenti moderne neuroscienze potrebbe essere incorporata per studiare i meccanismi neurali del comportamento di ABA.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Quest'opera è stata finanziata da un NARSAD indipendente Investigator Award e un premio in memoria di George Largay per SCD ricerca di IMHRO Rising Star depressione.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wireless Low Profile Running Wheels, Hubs, Software Med Associates ENV-047
Standard Teklad Rodent Chow Envigo 8604
8 Week Old Mice Jackson Laboratories Balb/cJ Strain used in our study - Can use other strains to assess ABA
Scout Pro Scale 200 g Ohaus SPE202 Used to weigh mice
Scout Pro Scale 400 g Ohaus SPE402 Used to weight food

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Comportamento problema 135 Activity-Based anoressia Anoressia Nervosa iperattività iperattività Food Restriction-Induced topi restrizione alimentare Hypophagia disturbi dell'alimentazione
Valutazione basata sulle attività di anoressia in topi
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Welch, A. C., Katzka, W. R., Dulawa, S. C. Assessing Activity-based Anorexia in Mice. J. Vis. Exp. (135), e57395, doi:10.3791/57395 (2018).

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