Summary
आईरिस neovascularization, कोरोनरी रेटिना रोग की एक आम जटिलता, दृष्टि-धमकी neovascular मोतियाबिंद के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । यहाँ, हम प्रयोगात्मक आईरिस neovascularization उत्प्रेरण के लिए एक murine प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जिसका इस्तेमाल angiogenesis-नियमन करने वाले पदार्थों के गैर इनवेसिव मूल्यांकन के लिए किया जा सकता है ।
Abstract
हम angiogenesis के गैर इनवेसिव मूल्यांकन के लिए एक सामांय मॉडल के रूप में पंचर प्रेरित आईरिस neovascularization के एक मॉडल का वर्णन । मॉडल भी neovascular मोतियाबिंद, एक दृष्टि मधुमेह रेटिनोपैथी की जटिलता धमकी लक्ष्यीकरण के लिए प्रासंगिक है । इस विधि स्वयं की एक श्रृंखला से आईरिस संवहनी प्रतिक्रिया की प्रेरण पर आधारित है uveal पंचर बालब/सी चूहों पर सील और माउस नेत्र vasculature के प्रसवोत्तर परिपक्वता का लाभ लेता है । माउस पिल्ले जन्मोत्तर दिन 12.5 से uveal पंचर गुजरती है, जब पिल्ले स्वाभाविक रूप से अपनी आंखें खोलो, जन्मोत्तर दिन 24.5 तक । कॉर्निया की पारदर्शिता के कारण, आइरिस vasculature का समय के माध्यम से आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है vivo तरीकों में इनवेसिव द्वारा । इसके अलावा, बालब/सी चूहों के अल्पपारदर्शी आइरिस न्यूनतम गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि धुंधला के साथ विस्तृत immunohistologic विश्लेषण के लिए flatmounted किया जा सकता है । इस मॉडल में, angiogenesis मुख्य रूप से भड़काऊ और plasminogen सक्रिय प्रणालियों द्वारा संचालित है । पंचर प्रेरित मॉडल पहले छोटे कुतर में आईरिस neovascularization प्रेरित करने के लिए है, और angiogenic प्रक्रिया के vivo विश्लेषण में प्रत्यक्ष इनवेसिव की अनुमति का लाभ है । इसके अलावा, मॉडल angiogenic मॉडुलन पदार्थ है, जो एक vivo परिप्रेक्ष्य में के साथ angiogenesis के अध्ययन में अपनी क्षमता पर प्रकाश डाला गया के साथ जोड़ा जा सकता है ।
Introduction
आईरिस, सिलिअरी शरीर और रंजित के साथ साथ, uvea, जो आंख के सबसे संवहनी ऊतक है शामिल हैं । आईरिस vasculature नेत्र के पूर्वकाल कक्ष में homeostasis को बनाए रखने में आवश्यक है । धमनियों और नसों के बीच प्रचुर मात्रा में anastomotic कनेक्शन का एक परिणाम के रूप में, आईरिस रक्त वाहिकाओं पोषक तत्वों और ऑक्सीजन की आपूर्ति न केवल आईरिस ही करने के लिए, लेकिन आंख के पूरे पूर्वकाल खंड1।
नए रक्त वाहिकाओं के गठन, या पूर्व मौजूदा लोगों से angiogenesis, शारीरिक प्रक्रियाओं में मौलिक है, इस तरह के विकास और घाव भरने के रूप में2. Angiogenesis ठीक से विहित कारकों की एक भीड़ द्वारा विनियमित है, जैसे संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) और plasminogen उत्प्रेरक अवरोधक (पै), साथ ही साथ कई भड़काऊ कारकों, और इन कारकों में से एक असंतुलन रोग के लिए नेतृत्व कर सकते हैं angiogenesis3.
आंख में, neovascularization दृष्टि-धमकी रोगों का कारण है, जैसे प्रफलन मधुमेह रेटिनोपैथी (पीडीआर) और neovascular मोतियाबिंद (NVG) । इन नेत्र रोगों में, फोकल neovascularization आमतौर पर रेटिना के ऊतकों में स्थित है, अभी तक सूजन में असंतुलन और angiogenic कारकों में दोनों पीछे और आंख के पूर्वकाल नेत्र मंडलों rubeosis iridis के साथ संबद्ध किया गया है, आईरिस रोग neoangiogenesis के लिए नैदानिक अवधि4। इन विकृतियों angiogenesis से गुजरना करने के लिए वयस्क आईरिस की क्षमता से संकेत मिलता है । चूहों में, आंख vasculature जंम के बाद अपरिपक्व है और परिपक्वता प्रसवोत्तर जारी है । विकास की यह ख़ासियत ऑक्सीजन प्रेरित रेटिनोपैथी, एक मॉडल है कि बारीकी से अपरिपक्व5के रेटिनोपैथी के नैदानिक हालत नकल के माउस मॉडल में शोषण किया जाता है । इसके अलावा, angiogenesis और सूजन घाव हीलिंग तंत्र6में एक निर्णायक भूमिका निभा, और घाव हीलिंग ही angiogenesis मॉडल7के साथ संबद्ध किया गया है ।
इस अध्ययन में, हम पंचर प्रेरित आईरिस neovascularization के एक मॉडल का वर्णन । Uveal पंचर limbus की बाहरी सीमा के पास किया जाता है, जो घाव भरने की प्रणाली को ट्रिगर करके आइरिस neovascularization को प्रेरित करते हैं । कॉर्निया की पारदर्शिता के कारण, आइरिस vasculature को vivo में आसानी से इनवेसिव तरीकों से विश्लेषण किया जा सकता है । पंचर आंखों आईरिस, जो plasminogen सक्रिय करने और भड़काऊ मार्करों की वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है में संवहनी बिस्तर की वृद्धि वर्तमान8। प्रस्तुत मॉडल angiogenesis और स्क्रीनिंग angiogenic यौगिकों का अध्ययन करने के लिए एक नया उपकरण के रूप में महान क्षमता है, और angiogenic प्रक्रियाओं के vivo दृश्य में प्रत्यक्ष की अनुमति देता है.
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Protocol
बालब/सी माउस या तो सेक्स के पिल्ले के अनुसार Ophthalmologic और दृष्टि अनुसंधान में पशुओं के उपयोग के लिए बयान के साथ इस्तेमाल किया गया है, और प्रोटोकॉल है स्टॉकहोम एथिकल एनिमल रिसर्च के लिए समिति द्वारा अनुमोदित थे । चूहों कूड़े में रखे गए थे, एक साथ नर्सिंग मां के साथ, एक 12 घंटे के साथ/रात चक्र, भोजन और पानी के लिए स्वतंत्र पहुँच, और दैनिक निगरानी.
नोट: सर्जिकल प्रक्रिया के लिए, चूहों अस्थिर isoflurane के साथ संज्ञाहरण के तहत रखा गया था । नेत्र मलहम नेत्र प्रक्रियाओं के दौरान हतोत्साहित कर रहे हैं, के रूप में वे उपचार और इस्तेमाल किया पदार्थों के साथ हस्तक्षेप हो सकता है । यदि आवश्यक हो, सूखी आंख को रोकने के लिए, बाँझ सामांय खारा समाधान की एक बूंद लागू किया जा सकता है । हालांकि uveal पंचर आत्म चिकित्सा कर रहे हैं, देखभाल शल्य चिकित्सा उपकरणों के साथ बाँझ सुनिश्चित करने के लिए uveal पंचर के दौरान लिया गया था । शल्य चिकित्सा उपचार के बाद सामान्य खारा समाधान के साथ जलयोजन शामिल, और tetracaine हाइडरोक्लॉराइड के नेत्र सामयिक प्रशासन के साथ analgesia. पिल्ले को नर्सिंग मां को लौट जाने से पहले एक हीटिंग पैड पर स्टर्नल recumbency को ठीक करने की अनुमति दी गई, एक साफ पिंजरे में । तनाव से बचने के लिए इसी नर्सिंग मदर के साथ कूड़े को रखा गया था ।
1. संज्ञाहरण
- संज्ञाहरण प्रेरण चैंबर तैयार, isoflurane संवेदनाहारी प्रशासन और यह सुनिश्चित करें कि एक छोटा सा माउस मुखौटा भी युग्मित है ।
नोट: सभी लागू नैतिक परमिट के साथ समझौते में सभी पशु प्रयोग करते हैं । - वायुमंडलीय हवा में 3-4% अस्थिर isoflurane के साथ प्रेरण चैंबर भरें ।
नोट: isoflurane के अलावा अंय संवेदनाहारी पदार्थ इस्तेमाल किया जा सकता है, नैतिक परमिट के अनुसार । अस्थिर संवेदनाहारी प्रक्रियाओं एक हवादार बेंच या धुएं हुड पर किया जाना चाहिए । - इंडक्शन चैंबर में एक जन्मोत्तर (पी) 12.5 दिन पुरानी बालब/सी माउस पिल्ला प्लेस । संज्ञाहरण तंत्र प्रेरण चैंबर के लिए isoflurane देने के लिए तैयार है कि पुष्टि करें ।
नोट: माउस पिल्ले नाजुक और सबसे अच्छा scruff द्वारा नियंत्रित कर रहे हैं । पिल्ले को कूड़े के रूप में एक साथ रखें या तनाव से बचने के लिए नर्सिंग मदर के साथ रहें । - पिल्ला पूरी तरह से anesthetized होने की अनुमति दें ।
- धीरे, scruff द्वारा माउस पिल्ला उठाओ ।
नोट: प्रेरण चैंबर सुरक्षित और स्थिर प्रेरण के लिए हर समय बंद रखो । - माउस को मूषक मास्क में स्थानांतरित करें । करने के लिए प्रेरण कक्ष से संवेदनाहारी प्रवाह स्विच करने के लिए मुखौटा जब माउस ले जाने के लिए सुनिश्चित करें ।
- संज्ञाहरण की पुष्टि करने के लिए एक पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन ।
2. सर्जिकल Stereoscope के तहत पंचर प्रक्रिया
- पार्श्व recumbency स्थिति में माउस की स्थिति । मुखौटा अच्छी तरह से तैनात है की पुष्टि करें तो माउस आंख stereoscope के दृश्य के क्षेत्र में है ।
- धीरे माउस सिर घुमाएं तो आंख stereoscope की ओर का सामना करना पड़ रहा है ।
नोट: आंख का स्पष्ट ध्यान stereoscope के तहत प्राप्त किया जाना चाहिए । स्थिति के लिए, 16X की एक वृद्धि की सिफारिश की है, जबकि 40X शल्य प्रक्रिया करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । यदि एथिकल परमिट यह अनुमति, मूंछों की नोक ट्रिमिंग आंखों के दृश्य की सुविधा कर सकते हैं । - छोटे बांधने संदंश का प्रयोग, ध्यान से पलकों पृष्ठीय और आंख को ventral के लिए नीचे दबाव लागू करने के द्वारा पिल्ला आंख बहर ।
- एक सौंय लेकिन पिल्ला आंख ढक्कन की फर्म पकड़, छोटे संदंश के साथ रखो ।
नोट: यह आंख की दखलंदाजी और गैर प्रमुख हाथ के साथ पकड़ ढक्कन प्रदर्शन करने की सिफारिश की है, के रूप में प्रमुख हाथ पंचर प्रक्रिया प्रदर्शन करना चाहिए । - corneal limbus का पता लगाने के लिए stereoscope का उपयोग करें । Albino बालब/c limbus कॉर्निया के पीछे परिपत्र संवहनी जाल द्वारा आसानी से पहचाना जा सकता है ।
- एक 0.25 मिमी व्यास (30 ग्राम) बेवलित सुई के साथ, uvea के पीछे अंग सीमा के पास एक छोटा सा uveal पंचर प्रदर्शन करते हैं । सुई के केवल टिप का उपयोग करें, और नहीं आधे से अधिक बेवल (0.5 mm के बराबर), uvea पंचर । सही ढंग से मार डाला, uveal पंचर आत्म सील कर रहे हैं, अभी तक अध्ययन पदार्थों के intraocular इंजेक्शन एक ही पंचर घाव के माध्यम से प्रशासित किया जा सकता है ।
नोट: यदि माउस नेत्र शरीर रचना विज्ञान के साथ अनुभवी, uveal पंचर सिलिअरी शरीर और ora serrata के बीच मार डाला है । लेंस rupturing से बचने के लिए uveal पंचर प्रदर्शन करते समय ध्यान रखा जाना चाहिए । - पहली पंचर साइट से आंख के विपरीत साइट में दूसरा uveal पंचर प्रदर्शन । पंचर की दूरी और स्थिति का अनुकूलन; 12 और 6 बजे पंचर, 12 बजे के साथ विचार के रूप में संभव के रूप में पृष्ठीय जा रहा है ।
- दोहराएं uveal पंचर प्रक्रिया हर चार दिन तक पी 24.5 । हर उत्तराधिकारी uveal पंचर से पहले, पशु स्थिति uveal पंचर, या स्पष्ट कम आंख का दबाव के दौरान लेंस क्षति के कारण दर्दनाक मोतियाबिंद की उपस्थिति के लिए विशेष रूप से ध्यान देने की निगरानी । इष्टतम प्रभाव के लिए पिछले पंचर के रूप में एक ही स्थिति में दोहराने पंचर को क्रियान्वित करने के लिए निशाना लगाओ ।
३. वीवो की निगरानी में इनवेसिव
- प्रत्येक प्रयोगात्मक दिन पर पंचर या इंजेक्शन से पहले, माउस के रूप में ऊपर प्रदर्शन anesthetize ।
- पार्श्व recumbency स्थिति में माउस के साथ, धीरे आंख बहर ।
- सर्जिकल stereoscope के साथ आइरिस vasculature पर फोकस करें ।
- सर्जिकल stereoscope में लगे कैमरे के साथ आइरिस vasculature की तस्वीर लें ।
नोट: हालांकि आवश्यक नहीं, उत्प्रेरण अर्धसूत्रीविभाजन पशु प्रति आईरिस क्षेत्र को सामान्य करने के लिए सहायक हो सकता है. नैतिक परमिट पर विचार जब एक अर्धसूत्रीविभाजन उत्प्रेरण एजेंट का चयन । आईरिस vasculature के सावधान ध्यान और मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा होगी । 40X की एक परिमाण की सिफारिश की है ।
4. पोस्ट को-ऑपरेटिव केयर
- बालब/सी पिल्ला कुतर मास्क से निकालें, और धीरे से यह एक हीटिंग पैड एक शल्य चटाई के साथ स्तरित करने के लिए स्थानांतरण ।
- पंचर आंखों के लिए 1% tetracaine समाधान की एक बूंद लागू करें ।
नोट: अंय एनाल्जेसिक समाधान इस्तेमाल किया जा सकता है, नैतिक परमिट के अनुसार । - बाँझ सामान्य खारा समाधान के 200 µ एल के एक चमड़े के नीचे इंजेक्शन के साथ पशु हाइड्रेट ।
- एक साफ माउस पिंजरे में नर्सिंग मां को पिल्ला लौटें ।
- पुनर्प्राप्ति प्रक्रिया की निगरानी करें । पिल्ला को deambulate कर कूड़े को लौटाना चाहिए ।
5. नेत्र Enucleation
- ग्रीवा विस्थापन द्वारा पशु Euthanize. प्रक्रिया के बेहतर दृश्य के लिए किसी stereoscope के अंतर्गत enucleation और विच्छेदन करें ।
नोट: विभिंन इच्छामृत्यु प्रक्रियाओं का इस्तेमाल किया जा सकता है । यह सख्ती से नैतिक परमिट का पालन करने के लिए सिफारिश की है । - आंखों के लिए जोखिम में सुधार करने के लिए पलकों के अलावा खींचो ।
- एक छोटी सी कटौती (लगभग 0.5 सेमी) घुमावदार बॉन नेत्र कैंची के साथ आंख पलकों के canthus के पास बनाओ ।
- (के तहत) कक्षा में ग्लोब के पीछे माइक्रो बांधना संदंश डालने के लिए उजागर periocular अंतरिक्ष का प्रयोग करें ।
- आंख के आसपास के ऊतकों को पकड़ो और धीरे से ऊपर की ओर खींच । गोलक पर धारण करने से बचें, आसपास के ऊतकों को आंख के सॉकेट के करीब उपयोग करें ।
- कक्षा में आंख ग्लोब के पीछे घुमावदार बॉन आंख कैंची डालें ।
- आसपास के ऊतकों के माध्यम से कट जब तक आंख गर्तिका से जारी की है ।
नोट: इस विच्छेदन तकनीक नेत्र शरीर रचना विज्ञान और लाभ बाद में विश्लेषण का कहना है । - आंख से बाहरी ऊतक को हटाने के लिए आगे बढ़ें । बाहरी ऊतक को हटाने फिक्सिंग के बाद किया जा सकता है, अगर पसंद है ।
नोट: बालब/c चूहों मेलेनिन की कमी है, इसलिए, इसके विपरीत बढ़ाने के लिए, एक अंधेरे पृष्ठभूमि विच्छेदन प्रक्रिया की सुविधा के लिए सिफारिश की है. - एक पेट्री बाँझ फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) से भरे पकवान में पूरी आंख को संक्षेप में कुल्ला ।
- एक 2 एमएल ट्यूब 4% की 1.5 मिलीलीटर-formalin समाधान से युक्त करने के लिए आंख स्थानांतरण ।
- कमरे के तापमान पर 6 घंटे के लिए आंख ठीक करें ।
नोट: फिक्सिंग के ऊतकों की कठोरता और आईरिस के विच्छेदन की सुविधा प्रदान । समय फिक्सिंग परीक्षण किया जाना चाहिए और विभिंन अनुप्रयोगों के लिए समायोजित ।
6. Stereoscope के अंतर्गत आइरिस विच्छेदन प्रक्रिया
- एक 1.5 मिलीलीटर प्लास्टिक पाश्चर पिपेट (या इसी तरह) के साथ ट्यूब से निर्धारण समाधान निकालें, और ताजा पंजाबियों के साथ आंख तीन बार कुल्ला ।
- एक चिकनी सूखी सतह (लकीर स्टैंड) पूर्वकाल कक्ष के साथ ऊपर की ओर का सामना करना पड़ के साथ में फिक्स्ड आंख प्लेस ।
- एक बेवल 30 जी सुई के साथ, एक प्रवेश बिंदु limbus करने के लिए पीछे प्रदर्शन ।
- छोटे बांधने संदंश के साथ पूर्वकाल खंड होल्डिंग, पहले से बनाया खोलने में Clayman-Vannas सीधे कैंची के एक टिप डालें ।
नोट: यह गैर प्रमुख हाथ के साथ संदंश नियंत्रण की सिफारिश की है, और प्रमुख के साथ कैंची । - जबकि बांधने संदंश के साथ आंख घूर्णन, आंख के पीछे खंड को दूर करने के लिए limbus के आसपास काट ।
नोट: आंशिक कटौती प्रदर्शन कैंची के भीतरी टिप ऊतक में जारी रखने के लिए और बहुत प्रक्रिया की सुविधा की अनुमति देगा । - स्थिति पूर्वकाल नीचे का सामना करना पड़ खंड, लेंस को उजागर ।
- लेंस को छोटे संदंश से पकड़कर ऊपर की ओर खींचकर सावधानीपूर्वक निकालें.
नोट: एक बेवल सुई पंचर और लेंस खींचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । - नीचे का सामना करना पड़ कॉर्निया के साथ पूर्वकाल खंड स्थिति और देखने के क्षेत्र के लिए सीधा काट ।
- धीरे छोटे बांधने संदंश के साथ सिलिअरी शरीर के पीछे ऊतक हड़पने ।
- Clayman-Vannas सीधे कैंची के साथ, trabecular meshwork को दूर करने और आईरिस को अलग करने के लिए सिलिअरी शरीर के लिए सिर्फ पूर्वकाल ट्रिम करने के लिए आगे बढ़ें । पुष्टि करें कि trabecular meshwork निकाल दिया गया है; आईरिस कॉर्निया के भीतर ले जाना चाहिए ।
- ध्यान से पूर्वकाल eyecup छोटे बांधना संदंश के साथ हस्तांतरण, कॉर्निया पकड़, एक 96-अच्छी तरह से प्लेट को पंजाबियों के 200 µ एल युक्त ।
- अच्छी तरह से कॉर्निया पकड़ जारी रखें और एक पिपेट के साथ पंजाबियों के साथ निस्तब्धता द्वारा आईरिस काटना ।
नोट: अगर आईरिस कॉर्निया के अनुयाई रहता है, तो कुछ trabecular meshwork मौजूद हो सकते हैं, और 30 ग्राम की सुई का बेवल आइरिस को बदलने में मदद करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । - 96 से कॉर्निया निकालें-अच्छी तरह से छोटे बांधना संदंश के साथ, और आगे विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अलग आइरिस रखें ।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर फ्री-फ्लोटिंग आइरिस नमूनों की दुकान ।
नोट: तय किया जा रहा है के बावजूद, आईरिस मुक्त अस्थाई नमूनों की लंबी अवधि के भंडारण की सिफारिश नहीं है ।
7. संभव प्रायोगिक पठन-बहिष्कार
- विच्छेदित आईरिस में रक्त वाहिकाओं कल्पना करने के लिए, प्लेटलेट endothelial कोशिका आसंजन अणु (PECAM)-1 या isolectin B4 जैसे मार्करों के लिए मुक्त अस्थायी पूरे माउंट immunohistochemistry धुंधला तरीकों का उपयोग करें । वैकल्पिक रूप से, इस तरह के रूप में फ्लोरोसेंट-उच्च आणविक वजन dextrans लेबल संवहनी के साथ पूरे शरीर छिड़काव का उपयोग करें ।
- silico फ्लैट में प्रदर्शन करने के लिए vivo गैर इनवेसिव छवियों में प्रयोग-बढ़ते और उचित इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ पूर्ण आईरिस vasculature यों ।
नोट: Vasculature quantified, दोनों vivo में और इन विट्रोमें, densitometry या Vasculature विश्लेषण सॉफ्टवेयर9के साथ का उपयोग कर सकते हैं । - न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन निष्कर्षण, पीसीआर या immunoblotting तरीकों के बाद के लिए पूरी गोलक प्रक्रिया, पंचर आंखों के आणविक विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए ।
नोट: ऊतकों का आणविक विश्लेषण सबसे अच्छा गैर-तय ऊतक के साथ प्रदर्शन किया है, लेकिन गैर तय आईरिस के विच्छेदन अत्यंत चुनौतीपूर्ण है, और पूरी आंख के उपयोग के पिछले अध्ययन में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्रदान की गई है8।
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Representative Results
Albino बालब/सी पी 12.5 में माउस पिल्ले uveal पंचर के अधीन थे, दोहराया हर चौथे दिन (प्रयोगात्मक दिन 0, 4, 8, 12), जब तक पी 24.5 । पी 27.5 में, चूहों euthanized थे और आईरिस ध्यान से विदारक (प्रायोगिक दिन 15) । माउस आंखों के चित्र एक एक प्रयोगात्मक दिन में हर पंचर श्रृंखला से पहले एक शल्य stereoscope से जुड़े कैमरे के साथ लिया आइरिस संवहनी प्रतिक्रिया के इनवेसिव मूल्यांकन का आकलन कर रहे थे । Uveal पंचर घाव हीलिंग सिस्टम (चित्रा 1) ट्रिगर द्वारा आईरिस से एक संवहनी प्रतिक्रिया पैदा करते हैं । कॉर्निया और मेलेनिन की कमी बालब/सी चूहों की पारदर्शिता के कारण, बढ़ा आईरिस vasculature प्रयोगात्मक दिन 4 (पी 16.5) से आसानी से दिखाई दे रहा है और प्रोटोकॉल की अवधि के दौरान तेज । PECAM के लिए Immunohistochemistry छवियों-1 नियंत्रण की तुलना में पंचर आंखों के आईरिस में समग्र vasculature में वृद्धि निरूपित (चित्रा 2) ।
चित्र 1: पंचर प्रेरित आईरिस angiogenesis की गैर इनवेसिव निगरानी । दिन की प्रतिनिधि छवियां 0, 4, 8, 12, और नियंत्रण और पंचर आंखों के 15 । आईरिस संवहनी प्रतिक्रिया पंचर आंखों में 4 दिन के बाद से स्पष्ट है । स्केल बार = 1 mm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2: पंचर प्रेरित आंखों में आईरिस संवहनी प्रतिक्रिया । PECAM के उदाहरण के चित्र-1 दिन से धुंधला 15 आईरिस, पूर्ण दृश्य और बढ़ाया क्षेत्र के रूप में प्रदर्शित (वर्ग), नियंत्रण और पंचर आंखों से । स्केल बार = 400 µm (ऊपर); 200 µm (नीचे) । पंचर की गई आईरिस शाखाओं की वृद्धि पर ध्यान दें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में, uveal पंचर द्वारा आईरिस संवहनी प्रतिक्रिया की प्रेरण के लिए एक उपंयास विधि प्रस्तुत की है । पंचर घाव हीलिंग तंत्र से चलाता है और आईरिस10,11में संवहनी प्रतिक्रियाओं को बढ़ावा देता है । इस तरह के पीडीआर और NVG, के रूप में आंख विकृतियों के साथ समझौते में है, जहां नेत्र के पीछे खंड में रेटिना से angiogenic प्रतिक्रियाओं गहरा rubeosis iridis के नैदानिक हालत में महायुद्ध, आईरिस 12 की एक वृद्धि की vascularization ,13.
कॉर्निया avascular है और पारदर्शिता में जिसके परिणामस्वरूप एक अजीब कोलेजन संरचना के पास है । इस के साथ लाइन में, आईरिस vasculature के दृश्य के लिए आंख के पूर्वकाल खंड की एंजियोग्राफी आईरिस रक्त वाहिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य के साथ vivo इनवेसिव तरीकों13,14 में प्राप्त है । आइरिस neovascularization के पिछले पशु मॉडल बड़ी आंखों जानवरों जहां जटिल शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप15,16,17, या विशिष्ट angiogenic पदार्थ के intraocular इंजेक्शन द्वारा प्रदर्शन किया गया पर भरोसा 18 , 19. इस विधि में, वर्णक आपुर्ति बालब/सी चूहों का उपयोग vivo मेंआईरिस vasculature के प्रत्यक्ष अवलोकन में सक्षम बनाता है, और आईरिस neovascularization के चूहों में इनवेसिव ठहराव की अनुमति देता है, इस प्रकार अध्ययन करने के लिए एक नया उपकरण प्रदान करता है vivo angiogenesis में ।
इसके अलावा, माउस आइरिस विच्छेदन के लिए प्रस्तुत विधि संवहनी विशिष्ट मार्कर के साथ पंचर प्रेरित आईरिस neovascularization के विश्लेषण की अनुमति देता है । यहां, आईरिस जहाजों PECAM-1 एंटीबॉडी और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized के साथ दाग illustratively थे । मुक्त फ्लोटिंग, पूरे माउंट immunostaining प्रोटोकॉल आसानी से प्राप्त कर रहे है और काफी दिनचर्या । इसके अलावा, रक्त वाहिकाओं के लिए छिड़काव तरीकों इस मॉडल में किया जा सकता है । नाड़ी विशेष धुंधला आईरिस रक्त वाहिका संरचना का आकलन अनुदान और इस प्रकार ठहराव, उपयोगकर्ता आधारित या सॉफ्टवेयर विश्लेषण के द्वारा, आईरिस neovasculature9। पहले के रूप में वर्णित8,20, आईरिस neovasculature के चित्रण दिन 15 के बाद पंचर-प्रेरण में मूल्यांकन किया गया था । फिर भी, आईरिस vascularization पर प्रभाव के रूप में दिन के रूप में देखा जा सकता है 4 के बाद पंचर-प्रेरण, पंचर प्रेरित आईरिस neovascularization मॉडल के मूल्यांकन का सुझाव है कि विभिंन समय बिंदुओं पर किया जा सकता है, विशिष्ट पर आधारित प्रायोगिक आवश्यकताएं ।
यह राज्य के लिए उल्लेखनीय है कि इस प्रोटोकॉल कुछ चुनौतियों, विशेष रूप से एक चूहे अंय पशु मॉडल के सापेक्ष आंखों के आकार से संबंधित प्रस्तुत करता है । चरम देखभाल uveal पंचर प्रक्रिया को क्रियांवित करते समय लिया जाना चाहिए, लेंस छू या आंख को नुकसान से बचने के लिए । आंख की हालत का अवलोकन सर्वोपरि है, और जानवरों के प्रायोगिक-संबंधित मोतियाबिंद या आंख के दबाव में ड्रॉप प्रदर्शित बाहर रखा जाना चाहिए और उचित euthanized । माउस आईरिस बेहद नाजुक और कुछ हद तक चिपचिपा रहे हैं । उचित विच्छेदन और ऊतक के अलगाव प्रोटोकॉल के लिए एक और महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत करता है । trabecular meshwork से एक सही जुदाई पूर्वकाल चैंबर से आईरिस के विस्थापन के लिए आवश्यक है । इसके अलावा, कमजोरी के कारण, आईरिस अलगाव ऊतक के निर्धारण की आवश्यकता है, जो बहाव आणविक विश्लेषण बाधित । हालांकि, एक निश्चित पूरी आंख का एक आणविक विश्लेषण सफलतापूर्वक प्रस्तुत विधि8करने के लिए लागू किया गया है ।
संक्षेप में, वर्णित प्रोटोकॉल एक उपंयास पंचर प्रेरित आईरिस neovascularization माउस मॉडल प्रस्तुत करता है । इस मॉडल angiogenesis के vivo इनवेसिव प्रत्यक्ष दृश्य में अनुमति देने का लाभ है । इसके अलावा, छोटे कुतर के उपयोग प्रस्तुत मॉडल rubeosis iridis के अध्ययन के लिए आकर्षक renders, के रूप में यह बड़ी आंखों जानवरों के उपयोग से बचा जाता है और नैतिक प्रतिबंध के साथ । इसके अलावा, प्रक्रिया समर्थक या विरोधी angiogenic पदार्थों के इंजेक्शन के साथ स्व-सील पंचर के माध्यम से जोड़ा जा सकता है, vivo angiogenesis में के एक नए मॉडल के रूप में अपनी उपयोगिता बढ़ाने.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
लेखकों ने पशुपालन के लिए Linnea Tankred और डायना Rydholm का शुक्रिया अदा किया ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bonn eye scissors | Bausch & Lomb | 23060 | |
| Clayman-Vannas curved scissors | Bausch & Lomb | E3383 C | |
| Clayman-Vannas straight scissors | Bausch & Lomb | E3383 S | |
| Objective adapter for camera | Handcrafted | N/A | Or any system that allows adapting a camera to the microscope |
| Heating Pad 100-110 watts | Non Applicable | N/A | Available in pet/veterinarian stores |
| Hypodermic 30g beveled needle | KDM GmBH germany | 911914 | |
| Iphone 4S | Apple | Non Applicable | Or other high resolution image acquistion device |
| Isoflurane | Baxter | KDG 9623 | |
| McPherson tying forceps | Bausch & Lomb | E1815 S | |
| Micro tying forceps | Bausch & Lomb | 63140 | |
| Minims tetracaine hydrochloride | Bausch & Lomb | N/A | 1 % (w/v) Eye Drops |
| Neutral-buffered formalin | Bioreagens | 0018-40 | |
| Normal saline solution | Fresenius Kabi | 210352 | 0.9 % (w/v) NaCl in injectable water |
| Phosphate-buffered saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 | Balanced and buffered PBS pH 7.4 |
| Petri dish 10 cm | Starstedt | 83.3902 | |
| Petri dish 3 cm | Starstedt | 83.3900 | |
| Safe Seal Tube 2.0 mL | Starstedt | 72.685.200 | Or any eppendorf style tubes |
| TC plate 96-well | Starstedt | 83.3924 | |
| Transfer pipette 3.5 mL | Starstedt | 86.1171 | Or any other Pasteur pipette style |
| Univentor 400 anesthesia unit | Univentor Limited | N/A | Or equivalent flow regulator with induction chamber and mask for volatile anesthesia |
| Wild M650 surgical microscope | Wild Heerbrugg | N/A | Or other surgical or magnifying stereoscope |
References
- Morrison, J. C., Van Buskirk, E. M. Anterior collateral circulation in the primate eye. Ophthalmology. 90 (6), 707-715 (1983).
- Dreyfuss, J. L., Giordano, R. J., Regatieri, C. V. Ocular Angiogenesis. J Ophthalmol. 2015, 892043 (2015).
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