Summary
Målet med denne protokollen er å tallfeste reparasjon av definerte DNA-protein krysskoblinger på plasmider DNA. Lesioned plasmider er transfekterte i mottakerens pattedyr linjer og lav-molekylær vekt høstes ved flere tid poeng etter hva. DNA reparasjon kinetics er kvantifisert benytter strand-spesifikke primer forlengelsen etterfulgt av qPCR.
Abstract
Formålet med denne metoden er å gi en fleksibel, rask og kvantitative teknikk for å undersøke the kinetics av DNA-protein krysskobling (PPC) reparasjon i pattedyr linjer. I stedet for globalt assaying fjerning av xenobiotic oval-indusert eller spontane chromosomal DPC-fjerning, undersøker denne analysen reparasjon av en homogen, kjemisk definert leksjonen spesielt introdusert på ett område innenfor et plasmider DNA substrat. Viktigere, denne tilnærmingen unngår bruk av radioaktivt materiale og er ikke avhengig av dyre eller høyt spesialiserte teknologi. I stedet bruker den standard rekombinant DNA prosedyrer og allment tilgjengelig sanntid, kvantitativ polymerase kjedereaksjon (qPCR) instrumentering. Gitt den iboende fleksibiliteten av strategien utnyttet, størrelsen på krysskoblet protein og kjemiske sammenhengen og presis DNA kan sekvens sammenheng med webområdet vedlegg varieres for å løse de respektive bidragene til dette parametere for den generelle effektiviteten av DPC reparasjon. Bruker denne metoden, plasmider inneholder en områdespesifikk DPC var transfekterte i celler og lav molekylvekt DNA funnet på ulike tider etter hva. Gjenopprettede DNA er så utsatt strand-spesifikke primer forlengelse (SSPE) med en primer utfyllende til den skadede stranden av plasmider. Siden DPC lesjon blokker Taq DNA polymerase, kan forholdet mellom reparerte til un reparerte DNA kvantitativt vurderes ved hjelp av qPCR. Syklus-terskelverdier (CT) brukes til å beregne prosent reparasjon forskjellige tidspunkt i de respektive linjene. Denne SSPE-qPCR-metoden kan også brukes til å vurdere kvantitativt reparasjon kinetics noen DNA adduct som blokkerer Taq utvalg.
Introduction
Beskrevet her kalles en PCR-baserte analysen SSPE-qPCR. Formålet med denne metoden er å tallfeste DPC reparasjon på plasmider DNA transfekterte til reparasjon mangelfulle og dyktig pattedyrceller. Denne analysen er rask, kvantitativ, fleksibelt direkte tiltak reparere aktivitet. Mens denne rapporten fokuserer på bruk av denne metodikken å studere reparasjon av DPCer, illustrerer resultatene nedenfor at reparasjon av noen lesjon som blokkerer Taq utvalg kan studeres med denne metoden.
Begrunnelsen bak utviklingen av denne metoden er å få innsikt i mekanismer som pattedyrceller reparere DPCer. I motsetning til andre typer DNA skade er DPCer svært mangfoldig1,2. Studier har vist at hundrevis av mobilnettet proteiner kan bli krysskoblet DNA og for hver protein som finnes, i prinsippet, tallrike aminosyre siden kjeder som kunne bli covalently knyttet til mobilnettet DNA3. I tillegg finnes det mange kjemiske festepunkter for proteiner til DNA ryggraden, inkludert flere stillinger nucleotide baser og ribose sukker4,5. Denne kjemiske mangfold reiser prospektet at forskjellige biokjemiske trasé kan stoles på å reparere typer DPCer. Det var med denne bekymringen Husk at SSPE-qPCR analysen ble utviklet.
Flere teknikker er utviklet for å få innsikt i molekylærbiologi i mobilnettet DPC reparasjon. Nedenfor gir en oversikt over de store tilnærmingene som er utviklet, med en oppsummering av store styrkene og svakhetene begge har. Det er verdt å understreke at mens dette sammendraget fokuserer på studier av DPC reparasjon i pattedyr celle kultur systemer, betydelige bidrag til dagens modell for DPC reparasjon er gjort ved hjelp av mikrobielle og celle-frie systemer som ikke omtales i dette manuskriptet.
Kanskje er den enkleste strategien som kan tas å få innsikt i genetikk av DPC reparasjon å vurdere respektive følsomheten til celledød observert i vill-type og mutant celler utsatt for agenter som induserer DPCer6,7. Denne strategien er relativt rask, billig, og krever ikke spesialisert kompetanse utover muligheten til å utføre grunnleggende celle kultur teknikker. Counterbalancing fordelene er mange begrensninger til denne tilnærmingen inkludert følgende. Først måler analysen ikke direkte DNA-reparasjon. Arbeider forutsetningen underliggende denne strategien er at inaktivere mutasjoner i gener som koder relevante DNA reparasjon proteiner resultater en opphopning av DNA skade som utløser programmert celledød. Men kan mutasjoner i gener som koder ikke-DNA-reparasjon proteiner i prinsippet, forbedre (eller redusere) mobilnettet følsomhet for xenobiotic oval-indusert celledød. Andre agenter oppretter DPCer alltid indusere andre typer DNA skade (et unntak er 5-aza-2-deoxycytadine, men denne agenten også reduserer mobilnettet methyltransferase nivåer8). Derfor er det tenkelig at forbedret mobilnettet overfølsomhet for agent i spørsmålet kan gjenspeile defekter i reparasjon av interstrand krysskoblinger eller andre lesjoner. Tredje, som nevnt ovenfor, DPCer representerer en svært heterogen klasse består av ulike typer kjemiske krysskoblinger, med annet protein partnere. Det er mulig at mens reparasjon av én eller flere underordnede typer av disse lesjoner kan endres i en bestemt genetisk bakgrunn, denne forskjellen ikke kan være tilstrekkelig til å vesentlig endre mobilnettet overfølsomhet til døden av denne agenten. I sammendraget, mens denne strategien representerer et attraktivt utgangspunkt, markere begrensningene som beskrives ovenfor betydningen av å forfølge andre, mer direkte metoder for å studere the kinetics av DPC reparasjon.
En rekke relaterte tilnærminger har blitt utviklet for å oppnå dette målet. For eksempel har etterforskere utviklet metoder for å skille mellom "gratis" DNA og 'protein-bundet' DNA9,10,11. Bruke disse tilnærminger, er det mulig å sammenligne stabil nivåer av DPCer eller følgende eksponering til en DPC-produserende agent i forskjellig genetisk bakgrunn. De to strategiene som er mest brukt involvere skille DPC inneholder DNA fra gratis DNA en nitrocellulose membran bindende strategi eller KCl/SDS nedbør12,13. I tidligere tilnærming er celler lysed og gått gjennom et nitrocellulose-filter. Fordi nitrocellulose binder protein, beholder filteret protein-tilknyttet DNA, tillater gratis DNA å passere. I den siste strategien er protein-bundet DNA separert fra gratis DNA basert på det faktum at SDS binder protein, men DNA, og kan være forårsaket av tillegg av KCl. Følgelig blir protein-tilknyttet DNA uløselig mens ubundet DNA forblir i løsningen. DPC inneholder DNA kan deretter bli quantitated med radiolabeled thymidine (hvis cellene var opprinnelig metabolically merket) eller en DNA-selektiv fluorescerende farge som Hoechst 33258. Disse metodene er reproduserbare og krever et lite antall trinn. Men gir de ikke informasjon om naturen av den kjemiske krysskobling som protein er knyttet til DNA. Videre er det viktig å merke seg disse analyser kan overvurdere DPC reparere feilaktig scoret ufullstendig reparasjon, dvsproteolytisk bearbeiding å mindre DNA-peptid krysskoblinger som ikke kan være lett fanget eller bidrar, bona fide DNA reparasjon.
Comet analyser kan brukes å visualisere DPC-formasjonen i celler14. I disse eksperimentene, tilstedeværelse av DPCer redusere DNA overføringen som deretter kan reverseres ved pretreating med proteinasen K. Lengden på halen kan derfor brukes til å beregne DPC-formasjonen. Men som nevnt ovenfor, opprette DPC-forming stoffer andre typer DNA skade som kan endre hale lengde. Denne protokollen er også svært teknisk og krever kompetanse og opplæring i AC confocal bildebehandling.
Massespektrometri kan brukes å studere DPC reparasjon kinetics etter behandling med crosslinking agenter15,16,17. Disse eksperimentene behandle celler med DPC-danner agenter og isolere DPCer via biotin fange eller fenol: kloroform (1:1) utvinning. Massespektrometri kan deretter brukes til å identifisere krysskoblet proteiner eller quantitate antall DPCer dannet over tid. Den store fordelen med denne tilnærmingen er natur data produsert. Er det mulig å presist katalogen typer proteiner som blir krysskoblet etter eksponering for en xenobiotic oval, men denne protokollen er dyrt, tidkrevende, og er begrenset av krysskobling som kan oppdages.
Maizels et al. utviklet en følsom 'RADAR"(rask tilnærming til DNA adduct utvinning) analysen å quantitate immunodetection DNA-protein addukter samt en ELISA-baserte RADAR analysen18,19. Disse analyser er spesielt nyttig for overlapping DNA-protein mellomprodukter som transiently danne i celler og generere prøver egnet for masse spectroscopy å identifisere nye protein addukter. Denne immunodetection analysen avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer til å fange de DNA-protein er krysskoblet, og derfor kan ikke være i stand til å oppdage degradert DNA-peptid addukter skjemaet under reparasjon. Nylig en bestemt DPC reparere veien til utryddelse og en DNA-avhengige metalloprotease Spartan ble oppdaget i som DPCer er proteolyzed med mindre peptider under reparasjon20,21. Arvede mutasjoner i dette genet er forbundet med Ruijs-Aalfs syndrom i mennesker, en sykdom karakterisert ved genomisk ustabilitet, tidlig aldring og leverkreft22. Mus med genmodifiserte spartanske genet defekter vise lignende fenotyper23.
Verten celle aktivering av transcriptional aktivitet har vært brukt til å studere reparasjon av definerte lesjoner på transfekterte plasmider DNA underlag24,25. I disse eksperimentene, plasmider med DPCs (eller andre typer DNA lesjoner) som blokkerer transkripsjon av en journalist, som luciferase, er transfekterte i celler. Luminescence målinger tatt 24-72 h senere så er korrelert med DPC reparasjon. Men disse indirekte reparasjon analyser er i stand til å oppdage reparasjonshendelser tidligere enn 24 timer etter transfection og ikke kan skille mellom RNA polymerase omkjøringsvei av delvis reparerte underlag og fullstendig reparasjon.
Hver av metodene beskrevet ovenfor har fordeler og har bidratt til dagens modell for DPC reparasjon. Men SSPE-qPCR analysen omgår flere av begrensningene knyttet til disse andre tilnærminger og dermed kan gi mer spesifikk informasjon DPC reparasjonsmekanismene. For eksempel kan SSPE-qPCR analysen direkte måle reparasjon av områdespesifikke DPCer på DNA i intakt pattedyrceller. Denne metoden er allsidig og har blitt brukt til å få reparasjon resultater etter transfection i hamster og humane cellelinjer. Hva av plasmider kan utføres med lipofection eller electroporation i kulturperler pattedyr linjer. Det også sikrer at bare reparasjon av definerte DPCer er målt, og ikke andre typer DNA skade forårsaket av de fleste DPC-danner agenter. SSPE-qPCR er enkel å utføre, billig og rask. Resultatene ved hjelp av denne analysen har oppdaget reparasjonshendelser så tidlig som 2t etter hva. Bruker denne metoden, kan variabler som kan påvirke DPC reparasjon resultater studeres på en måte som er sensitiv og effektiv. For eksempel ennå rollen transkripsjon i DPC reparasjon vurderes grundig. På grunn av fleksibiliteten til SSPE-qPCR analysen, kan crosslinking stedet for DPC redigeres for å løse dette spørsmålet. Innføring av en opprinnelse i replikering til DPC-bærende plasmider kan i tillegg brukes til å løse påvirkning av replikering på DPC reparasjon. I tillegg kan flere krysskoblinger opprettes på plasmider undersøke forskjellene i reparasjon av et enkelt DPC versus flere krysskoblinger. Dette er spørsmål som ville være vanskelig å besvare med chromosomal DNA, men kan enkelt løses ved hjelp av SSPE-qPCR analysen. Samlet, SSPE-qPCR analysen krever renset, plasmider DNA i mikrogram mengder som inneholder en leksjonen på en kjent plassering. Addukter foruten DPC kan brukes i denne analysen, men lesjonen må være dugelig av sperring utvidelse av Taq utvalg.
Protocol
1. generasjon av DPC inneholder plasmider
- Kombinere 80 pmol av oligonucleotide som inneholder en 8-oxoguanine rester (20 µL) med 10 enheter av T4 polynucleotide kinase (1 µL) i 10 x ligase buffer (5 µL). Legge til vann for å nå et samlet volum på 50 µL og ruge på 37 ° C i 30 min i et oppvarmet vannbad.
- Kombinere de phosphorylated oligonucleotide (50 µL), 80 pmol single-strandet DNA (80 μL), 100 enheter Taq utvalg (20 µL) i 10 x Taq reaksjon buffer (25 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTPs (20 µL), NEB buffer 2 (25 µL) og 8 µg BSA (20 µL) til total 260 µL. Incubate til eksempel på en thermocycler satt på 75 ° C i 15 min etterfulgt av 37 ° C i 5 minutter. Deretter legge 60 U av T4 utvalg (20 µL), 8000 U T4 ligase (20 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTPs (20 µL), NEB buffer 2 (15 µL) og 8 µg BSA (20 µL) til å summere 375 µL. ruge reaksjonen overnatting på 37 ° C (figur 1A).
- Opprette en 50/50 buffer-mettet fenol: kloroform blanding. Legg like volum av hver komponent, mix, og spinne i en bord centrifuge 21,130 x g for 5 min. kloroform stasjoner vannet ut av buffer-mettet fenol å danne to lag: en øvre, vandig lag og en bunn, organisk lag. Legge til 375 µL av lavere, organisk laget primer forlengelsen reaksjonen, mix, og spinne i en bord centrifuge 21,130 x g for 5 min.
FORSIKTIG: Fenol og kloroform er farlige stoffer og forholdsregler bør tas for å unngå kontakt med øyne eller hud.- Etter sentrifugering, nøye pakke ut det øverste laget og bland med ammonium acetate lagt til en siste konsentrasjon av 0,3 M etterfulgt av 2 volumer av 100% etanol. Lagre løsningen ved 20 ° C i minst 30 min eller over natten.
- Spinn eksemplet i en bord centrifuge på 15 000 x rpm på 4 ° C for 10 min. Fjern nedbryting og vaske pellet i 1 mL av 70% etanol. Spinne eksemplet i en bord sentrifuge på 15 000 x rpm på 4 ° C for 5 min. fjerne nedbryting og resuspend pellet i 100 µL av vann.
- Kombiner 50 µL av DNA fra det tidligere trinnet med 16 µL 6 x gel-lasting fargestoff og 34 µL vann og kan geleelektroforese på en 0,8% lav-smelte agarose gel inneholder 0,5 µg/mL ethidium bromide. Kjøre gel på 2 V/cm på en 10 cm gel for 6 h 1 x TAE buffer. Avgiftsdirektoratet supercoiled bandet med et barberblad og veie gel sektoren (figur 1A). Kjøre en positiv kontroll å tjene som en markør for hvor covalently lukket, supercoiled DNA overfører.
FORSIKTIG: Ethidium bromide er en mutagen forholdsregler bør tas for å unngå hudkontakt. Også er det viktig å minimere tiden det plasmider prøven er eksponert for UV for å redusere dannelsen av UV photoproducts.- Fordøye gel sektoren ved å legge 10% β-agarase reaksjon bufferen for hver mg av gel vekt. Inkuber ved 65 ° C i 10 min og kult å 42 ° C. Legg til 10 U av β-agarase og ruge på 42 ° C i 1 time.
- Følgende inkubasjon måle volumet og legge ammonium acetate til en siste konsentrasjon av 0,3 M og chill på is 15 min. sentrifuge 15.000 x g i 15 min ved romtemperatur, samle nedbryting og legge 2 mengder isopropanol. Chill på 20 ° C over natten.
- Sentrifuge renset, supercoiled DNA for 10 min på 15 000 x rpm i en bord sentrifuge på 4 ° C og resuspend pellet i 40 µL av vann.
- Krysskobling 12 pmol (15 µL) av DNA til 36 pmol av oxoguanine glycosylase (1 µL) i bufferen som inneholder 100 mM NaCl (3 µL), 1 mM MgCl2 (3 µL), 20 mM Tris-HCl pH 7.0 (6 µL) og 10 mM natrium cyanoborohydride (2 µL) å nå et endelig antall 30 µL ved 37 ° C i 30 min26. Fjern 1 µL av krysskoblet prøve og fortynne i 500 µL av vann som en 0t peker og analysere på PCR i trinn 3.
2. kCl/SDS nedbør
- For å visualisere crosslinking effektivitet, fordøye begrensning 1 µg av krysskoblet plasmider med 1 μL BspDI 10 x buffer ved 37 ° C i 1 time å generere to ulike størrelse DNA fragmenter.
Merk: Én fragment krysskoblet protein (4.4 kb) og den andre vil ikke (2,8 kB) (figur 1B).- Dele opp prøvene i halv, legger SDS både til en siste konsentrasjon på 0,5% og ruge ved 65 ° C i 10 min.
- Legge til KCl (siste konsentrasjon 100 mM) til en av prøvene og Inkuber på is 5 min.
- Sentrifuge begge eksempler på 12.000 x g i 5 min på 4 ° C og kjøre supernatants på en agarose gel å anslå den prosent Bøyning protein DNA12.
Merk: KCl/SDS nedbør brukes for kvalitetskontroll, ikke substrat forberedelse.
3. hva i pattedyrceller
- 1 dag før transfection, plate 0.5 x 106 celler/vel i en 6-vel plate. Neste dag, bland 1,5 µg (30 µL) av DPC inneholder plasmider (fra trinn 1.6) med 300 µL av serum-fri kultur medier. I en annen tube, bland 12 µL av transfection reagensen og 300 µL av serum-fri kultur medier. Kombiner 300 µL av utvannet DNA med 300 µL av utvannet transfection reagensen og ruge i 5 minutter ved romtemperatur. Legge til 250 µL av komplekser hvert av to brønner og ruge minimum 1 h på 37 ° C.
- Etter inkubasjon fjerne media, legge til 1 mL av 0,6% SDS/0,01 M EDTA, og ruge ved romtemperatur for 10-15 min. skrape cellene med en gummi politimann og overføre til en 1,5 mL microfuge tube. Legg 200 µL av 5 M NaCl (siste konsentrasjon på 1 M), inverter forsiktig 5 ganger, og ruge på 4 ° C over natten27.
- Sentrifuge eksemplene på 21,130 x g i en bord sentrifuge på 4 ° C i 30 min, samle supernatant, etanol bunnfall som beskrevet ovenfor, og resuspend i 50 µL av vann.
4. SSPE-qPCR
- Bland sammen 1 µL av gjenopprettede DNA fra hvert tidspunkt (inkludert 0 h), 2 x SYBR grønne PCR master mix (30 µL), 27 µL av vann og 1 µL (100 pMol) av primer utfyllende til den skade stranden av plasmider (Primer R, figur 2). Utføre PCR bruker følgende: innledende pre smelte i 10 min ved 90 ° C, etterfulgt av 8 sykluser av: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 min. Syklusen er ferdig 8 legge 1 µL (100 pMol) den andre primeren totalt 60 µL (Primer L, figur 2)28 (se Tabell for materiale for reagens detaljer).
- Mix 1 µL av unamplified fikset hvert tidspunkt (inkludert 0 h), 2 x master mix (30 µL), 27 µL av vann og 1 µL av hver primer (100 pMol) totalt 60 µL DNA.
- Laste inn en 96-brønns PCR plate med eksemplene fra trinn 4.1 og 4.2 (20 µL/Vel, i tre eksemplarer) og utfører qPCR for 30 sykluser med forholdene beskrevet ovenfor.
- Gjennomsnittlig CT verdiene fra hvert sett av tre eksemplarer prøver. Trekk CT-verdiene som er generert i trinn 4.1 fra i trinn 4.2 å få delta CT verdi for hvert utvalg. Trekk 0t tidspunktet fra delta CT verdien fjerne enhver bakgrunn (se Representant resultater inndelingen en detaljert beskrivelse).
- Konvertere deltaet CT verdien i prosent reparasjon ved hjelp av formelen:
Representative Results
For å utnytte SSPE-qPCR analysen for å vurdere Mobiltlf DPC reparasjon, må en tilstrekkelig mengde (µg beløp) høy kvalitet DPC reparasjon underlaget være forberedt. For å få dette produktet, var en oligonucleotide som inneholder en 8-oxoguanine rester glødet til utfyllende single-strandet DNA, primer utvidet og gel renset for å sikre at bare covalently lukket sirkulær produktet ble brukt for transfections (figur 1a). denne rapporten fokuserer på underlag som borohydride-fangst til å opprette en kovalente krysskobling mellom rekombinant menneskelig oxoguanine glycosylase og en ribose på en double-strandet sirkulær plasmider molekyl, selv om det analoge tilnærminger kan brukes til å få kjemisk mangfoldig DPC underlag. Oxoguanine glycosylase/borohydride overlapping strategien er spesielt attraktivt gitt ekstremt høy effektivitet av crosslinking reaksjonen. Som vist i figur 1B, KCl/SDS nedbør utført på en DPC substrat som hadde vært fordøyd i to fragmenter selektivt og nesten kvantitativt utarmet DNA fragmentet skjuler DPC. Disse resultatene støtter konklusjonen at egentlig 100% av plasmider substrat molekyler inneholder en protein krysskobling.
SSPE-qPCR-analysen som er beskrevet i delen protokollen utnytter CT-verdiene som er generert av qPCR til å beregne prosent av DPC reparasjon etter transfection i pattedyrceller. Som figur 2 illustrerer, blokkerer de protein er krysskoblet Taq utvalg fra utvide 'R' primer herdet til DPC inneholder strand. En andre, kritisk funksjon i denne analysen er inkorporering av åtte runder av SSPE reaksjoner (med R primer) før du utfører qPCR analysen. Mens uskadet (eller reparerte) DNA bli utvidet under disse SSPE reaksjoner, vil opprette en binding området for nedstrøms 'L' primer, skadet DNA (eller ufullstendig reparerte DNA) ikke utvides. Følgelig øker SSPE overflod av hver uskadet (eller reparerte) strand ved eight-fold. Dette betyr at reparert eksempler der SSPE trinnet er utført før qPCR vises en CT-verdi som er tre enheter lavere enn innhentet for en identisk prøve der SSPE ikke ble utført før qPCR (figur 2). Tre enhet forskjellen i CT verdier observert i to behandlinger, referert til som ΔCT, gjenspeiler faktum at 8 = 23. Denne delta CT verdi kan brukes til å beregne mobilnettet DNA-reparasjon aktivitet ved hjelp av formelen: prosent DNA-reparasjon = (2ΔCT /23) x 100. Kontroll eksperimenter bekreftet at en delta CT verdi av ca 3 konsekvent ble observert når uskadet substrat plasmider ble utsatt for SSPE-qPCR (data ikke vist).
Tabell 1 viser eksempel CT verdiene som ble generert fra DPC inneholder plasmider underlag som utvinnes fra kinesiske hamster lunge fibroblaster 3 h og 8 timer etter transfection (tabell 1A), samt fra tid null prøvene, dvs, prøver som var forberedt som beskrevet i delen protokollen, men ikke transfekterte i celler (tabell1B). Tabellen inneholder også på ΔCT, og prosent reparere verdier (beregnet ved hjelp av formelen 2ΔCT/23 x 100) fra prøvene. Som illustrert i tabellen 1A, prosent reparasjon beregnet fra prøver høstet 3t 8 timer etter hva var 66% og 93% henholdsvis. Disse verdiene er deretter trukket fra fikk fra analyse av 0t prøve å fastslå prosent reparere. Tabellen 1B viser CT verdier for to forskjellige 0t prøvene som effektiv crosslinking var eller ikke var oppnådd før transfection. Effektivt resulterte krysskoblet eksempel i en delta CT verdien av 0,8 mens en dårlig krysskoblet prøve resulterte i en delta CT verdi på 2,5. Hittil har det ikke vært mulig å nøyaktig fastslå kilden til 0,8 bakgrunn signalet i den effektivt krysskoblet 0t prøven. Det er usannsynlig at denne bakgrunnen gjenspeiler et lavt nivå av enten spontan DPC-fjerning, eller er på grunn av lave Taq utvalg "omgå" syntese gjennom lesjonen DPC: omfattende eksperimentering utført på høyrenset single-strandet M13 substrat konsekvent gitt en delta CT verdien av ca 0,8, bakgrunn dvsidentisk til dette' ' forlengelsen i DPC inneholder underlag. Derfor er det sannsynlig at det er en liten grad av mis fylling av 'R' primer under SSPE som resulterer i genereringen av en liten mengde produkt som kan senere bli forsterket når 'L' primer og qPCR utført. Innsats for å eliminere denne bakgrunnen ved å manipulere PCR forhold har til, ikke klarte å rette denne feilen. Imidlertid tillater subtraksjon strategi beskrevet ovenfor nøyaktig estimering av DPC reparasjon aktivitet. Det er verdt å merke seg at ineffektiv crosslinking av protein på plasmider vil resultere i en opphøyet bakgrunnen verdi. Dette er avbildet i eksempeldataene i tabellen 1B hvor ineffektiv protein-DNA crosslinking resulterte i en høyere deltaet CT verdi for tid 0. Kontroll eksperimenter utføres derfor alltid før igangsetting transfections og underlag med delta CT verdier opphøyet over den 0,8 terskelnivå forkastes. Som nevnt i qPCR-protokollen, er hvert utvalg delt inn i 3 brønner for å sikre pipettering konsekvens. Disse gjentak feltuttrykket deretter for å få CT verdien for den prøven. Replikerer at avviker mer enn ± 0.1 er eliminert fra datasettet. Hvis alle tre gjentak avviker mer enn ± 0,1 fra hverandre, er SSPE-qPCR analysen redone til konsistente verdier er oppnådd. Erfaring viser at minst 3 uavhengige transfections må utføres for å få pålitelige gjennomsnitt verdier som kan deretter utsettes for statistisk analyse for å fastslå påvirkning av ulike parametere på DPC reparasjon effektivitet.
Figur 1. Generering av en DPC inneholder plasmider. (A) en oligonucleotide som inneholder en 8-oxo-guanine rester (rød) er herdet til single-strandet DNA (fet svart sirkel) og forlenget for å opprette double-strandet plasmider (primer utvidelse produkt angitt av stiplet linje). Etter geleelektroforese i ethidium bromide, bandet tilsvarer supercoiled DNA (rød boks) er forbrukeravgift fra en lav-smelte agarose gel og fordøyd med β-agarase. Baner: (1) molekylvekt markør, (2) single-strandet DNA, (3) double-strandet DNA, (4) primer utvidet utvalg. (B) Oxoguanine glycosylase (forkortet hOGG1, avbildet som en oransje ring) er krysskoblet til 8-oxo-guanine rester via natrium cyanoborohydride og resulterende DPC underlaget fordøyd for å skape et 2800 base-par, gratis DNA fragment og en 4,400 Base-par fragment knyttet til protein. SDS legges til utvalget er delt inn i to deler, hvorav ett er behandlet med KCl og sentrifugeres til sediment DPC inneholder DNA (avbildet som en oransje pellet). Nedbryting fra denne siste prøven (avbildet som blå væske i sentrifuge tube) og prøven ikke utsatt for KCl er utsatt for gel geleelektroforese. Baner: (1) molekylvekt markør, (2) -KCl, (3) + KCl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kvantifisering av skadet plasmider via SSPE-qPCR. Plasmider DNA er denaturert og en primer utfyllende til den skadede stranden (R) er herdet og utvidet. Denne prosessen gjentas totalt 8 sykluser. Med et skadet substrat (øverst) Taq utvalg er blokkert av DPC lesjonen og vil ikke gi full lengde produktet tråder. I kontrast med et reparert substrat (nederst) vil Taq utvalg produsere fulle produkt tråder som inneholder webområdet bindende for innføring L. Etter 8 sykluser, primer L legges og syklusen terskelverdier fastsettes ved hjelp av qPCR. Eksempel forsterkning resultater for skadet og uskadet underlag illustrert til høyre med den røde linjen som representerer DNA som gjennomgikk primer filtypen før qPCR og blå representerer DNA som ikke var primer utvidet før qPCR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Tabellen 1A | ||||
| Tid | -Primer forlengelse | + Primer forlengelse | Δ CT | Prosent reparasjon |
| (2ΔCT/23x 100) | ||||
| 3t | 23,5 | 21,1 | 2.4 | 66 |
| 8 h | 29,4 | 26,5 | 2.9 | 93 |
| Tabellen 1B | ||||
| Tid | -Primer forlengelse | + Primer forlengelse | Δ CT | Prosent bakgrunn |
| (2ΔCT/23x 100) | ||||
| 0 h | 15,4-tommers | 14.6 | 0,8 | 22 |
| 0 h | 15,4-tommers | 12,9 | 2.5 | 71 |
Tabell 1: beregne prosent reparere ved hjelp av CT-verdiene som er generert fra SSPE-qPCR. (A) reparasjon av en DPC inneholder substrat transfekterte i V79 kinesisk hamster lunge fibroblaster 3 h og 8 timer etter hva. (B) SSPE-qPCR av 0t prøver ikke transfekterte i celler. I ett eksempel effektiviteten av crosslinking reaksjonen DNA og oxoguanine glycosylase var høy (dette eksemplet gitt en lav delta CT verdi) mens i andre utvalget effektiviteten av protein crosslinking var lav (dette eksemplet gitt en relativt høy delta CT verdi). Se Representant resultater for detaljer.
Discussion
Metoden SSPE-qPCR tilbyr mange fordeler over andre tilnærminger ved å undersøke reparasjon av en homogen befolkning som inneholder en enkelt, definert DPC leksjonen. Det er bemerkelsesverdig at i tillegg til å kontrollere identiteten til protein og typen kjemisk krysskobling brukes til å koble protein til DNA, er det mulig å enkelt manipulere sekvens sammenheng som DPC lesjonen er innført. Vi har utforsket påvirkning på DPC reparasjon av introdusere lesjonen enten malen eller koding strand av en plasmider nedstrøms av en aktiv promotor locus. På samme måte er vi i ferd med å undersøke påvirkning på DPC reparasjon av replikering bruker en M13 plasmider inneholder en SV40 opprinnelse i replikering transfekterte i HEK293T celler. Analysen beskrevet her direkte tiltak DPC reparasjon, i motsetning til andre strategier som verten celle aktivering som indirekte estimater reparere aktivitet24,25. I tillegg er systemet robust, følsom og kvantitative. I motsetning til andre systemer, som måler DPC fjerning, denne analysen finner bare fullstendig reparasjonshendelser, dvs, det krever ikke bare at DPC lesjonen fjernes, men at integriteten til dobbeltsidig DNA være fullt restaurert17. Dette er fordi abasic nettsteder og kutt og brudd i phosphodiester ryggraden blokkere analysen så effektivt som de opprinnelige DPC lesjon29.
Mens denne rapporten fokuserer på en bestemt type DPC, som ble opprettet av borohydride fangst av et enzym reaksjon mellomliggende, vi utvikler for tiden tilnærminger for å studere reparasjon av DPCer andre proteiner og lesjoner som protein sammenhengen til DNA oppstår gjennom nukleosid base, i stedet for ribose plasseringen. Bruker reductive amination, har vi opprettet protein og peptid krysskoblinger festet til guanine eller cytosine av en DNA primer30. Disse oligonucleotides var renset til homogenitet og brukes til å generere supercoiled plasmider inneholder DNA-protein og DNA-peptid krysskoblinger. Mens effektiviteten av disse reaksjonene er noe redusert i forhold til den oxoguanine glycosylase krysskobling fremgangsmåten beskrevet i detalj ovenfor, de var likevel vellykket og tillater undersøkelse av reparasjon av disse underlag i vill-type og nukleotid excision reparasjon-mangelfull pattedyr cellelinjer. Vi har også brukt SSPE-qPCR analysen for å studere reparasjon av oxoguanine lesjoner og en syntetisk ribose-kolesterol konjugert, som tidligere ble vist repareres via mobilnettet nukleotid excision reparasjon maskiner31. Som figur 2 viser grafisk, reparasjon av noen leksjonen at blokker primer utvidelse av Taq utvalg kan i prinsippet måles ved hjelp av SSPE-qPCR analysen.
Aktuelle modeller for DPC reparasjon foreslår at større DPCs (> 10 kDa) er utsatt for proteolytisk bearbeiding mindre peptid lesjon før fjerning32,33,34. Mest sannsynlig kandidater ansvarlig for denne proteolyse er proteasome eller en bestemt protease i menneskelige celler kalt spartanske20,21,35,36,37, 38. videre etterforskning rollene av disse proteaser kan bli utført med SSPE-qPCR analysen. Proteasome hemmere kan brukes til å pretreat celler før transfection med DPC inneholder underlag. Alternativt kan spartanske knockdown linjer være transfected med skadet Plasmidene å belyse sin rolle i proteolyse av større DPCer.
Uansett metoden brukes til å opprette de er krysskoblet eller av DNA lesjonen natur, er det verdt å understreke at SSPE-qPCR-metodikk er kritisk avhengig av evnen til å generere betydelige mengder homogen DPC-plasmider substrat. Trinn avgjørende for denne analysen inkluderer rensing av covalently, lukket-sirkulært plasmider etter primer utvidelse for å eliminere alle nicked eller lineær plasmider molekyler. Disse forurensningene må elimineres for å sikre at alle etterfølgende DPC reparasjon observert ikke er på grunn av nick-rettet eller dobbel-strand pause-rettet reparasjonsprosessene. Unnlatelse av å få tilstrekkelig mengder supercoiled DNA etter primer forlengelsen reaksjoner kan overvinnes ved å variere forholdet mellom oligonucleotide til enkelt-strandet DNA. Et annet viktig skritt for metoden SSPE-qPCR er crosslinking effektiviteten av protein til plasmider. I denne studien, en effektiv og enzymatiske reaksjonen ble brukt til krysskobling oxoguanine glycosylase protein til en 8-oxo-guanine lesjon. Sub optimal crosslinking kan forbedres ved å variere hvor mye protein lagt til reaksjonen.
Mens resultatene som beskrives i denne rapporten, avhengig av lipofection å innføre DPC reparasjon underlag i mottakerens celler, er det ingen grunn, en priori, andre transfections-metoder kan ikke brukes. Vi har utført forstudier og observert at electroporation39 kan også brukes. Men det er verdt å merke seg at i vår erfaring, electroporation hva effektivitet er redusert sammenlignet med lipofection, og vi fant det nødvendig å bruke bærer DNA (opptil 5 µg) i tillegg til de 1,5 µg av DPC substrat for å få reparasjonsdata. Samlet gir metoden SSPE-qPCR beskrevet ovenfor en innovativ måte å utelukkende undersøke DPC reparasjon på plasmider DNA og generere ny innsikt i DNA skade responsen.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner støttes av trening Grant 5T32HL007741. Vi takker Natalia Tretyakova (University of Minnesota) og Ashis Basu (Universitetet i Connecticut) og deres lab medlemmer for støtte og tekniske råd under tidlig og mellomliggende stadier av dette arbeidet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
| Taq polymerase | NEB | M0267L | |
| ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
| dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| T4 polymerase | NEB | M0203L | |
| T4 ligase | NEB | M0202L | |
| β-agarase | NEB | M0392S | |
| Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
| Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
| Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
| BspD1 | NEB | R0557S | |
| NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
| StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |
References
- Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes. Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
- Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences. Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).
- At Groehler, A. t, Degner, A., Tretyakova, N. Y. Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).
- Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation. J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).
- Dizdaroglu, M., Gajewski, E. Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone. Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).
- Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin. Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).
- Speit, G., Schutz, P., Merk, O. Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines. Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).
- Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J.
- Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution. Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).
- Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas. Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).
- Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells. Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).
- Zhitkovich, A., Costa, M. A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo. Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).
- Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).
- Merk, O., Reiser, K., Speit, G. Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay. Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).
- Loeber, R. L., et al. Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards. Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).
- Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. 1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells. J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).
- Groehler, A. t, Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells. Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).
- Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
- Kiianitsa, K., Maizels, N. Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay. Nucleic Acids Research. 42 (13), e108 (2014).
- Stingele, J., et al. Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
- Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair. Mol Cell. 64, 704-719 (2016).
- Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).
- Lessel, D., et al. Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features. Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).
- Baker, D. J., et al. Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells. J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).
- Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay. Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).
- Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair. Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).
- Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).
- Lee, H. W., et al. Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells. Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).
- Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency. Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).
- Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy. Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).
- George, J. W., et al. Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation. Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).
- Minko, I. G., et al. Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease. Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).
- Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).
- Reardon, J. T., Sancar, A. Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease. PNAS. 103, 4056-4061 (2006).
- Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
- Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
- Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis. Cell. 159 (2), 346-357 (2014).
- Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes. Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).
- Potter, H., Heller, R., et al. Transfection by Electroporation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , CHAPTER Unit-9.3 (2003).
