Summary
Målet med detta protokoll är att kvantifiera reparation av definierade DNA-protein antipyridinantikropp på plasmid DNA. Bort plasmider är transfekterade till mottagarens däggdjursceller linjer och lågmolekylärt skördas på flera tid punkter efter transfection. DNA reparation kinetik kvantifieras med hjälp av strand-specifik primer filändelsen följt av qPCR.
Abstract
Syftet med denna metod är att ge en flexibel, snabb och kvantitativa teknik för att undersöka kineticsen av DNA-protein crosslink (DPC) reparation i däggdjursceller linjer. Snarare än globalt testmetoder borttagning av xenobiotiska-inducerad eller spontana kromosomala DPC borttagning, undersöker denna analys reparation av en homogen, kemiskt definierade lesion specifikt infördes på en plats inom en plasmid DNA substrat. Allt detta tillvägagångssätt undviker användningen av radioaktiva ämnen och är inte beroende av dyra eller specialiserad teknik. Istället, det bygger på standard rekombinant DNA förfaranden och allmänt tillgängliga i realtid, kvantitativa polymerasen kedjar reaktion (qPCR) instrumentering. Med tanke på den inneboende flexibiliteten i strategin utnyttjas, storleken av tvärbunden protein, samt arten av den kemiska kopplingen och precisa DNA kan sekvens ramen för webbplatsen fastsättning varieras för att åtgärda dessa respektive bidrag parametrar till den övergripande effektiviteten i DPC reparation. Med den här metoden plasmider som innehåller en sitespecifik DPC var transfekterade celler och låg molekylvikt DNA återhämtade sig vid olika tillfällen efter transfection. Återvunna DNA utsätts sedan för strand-specifik primer filändelsen (SSPEN) med en primer som komplement till den skadada delen av Plasmiden. Sedan den DPC lesion block Taq-DNA-polymerasen, kan förhållandet mellan reparerade till un-reparerade DNA kvantitativt bedömas med qPCR. Tröskelvärden för cykel (CT) används för att beräkna procent reparera vid olika tidpunkter i respektive cell linjer. Specialföretaget för värdepapperisering-qPCR metoden kan också användas att kvantitativt bedöma reparation kinetik av någon DNA addukt att block-Taq-polymeras.
Introduction
Beskrivs häri kallas en PCR-baserad analys SSPEN-qPCR. Syftet med denna metod är att kvantifiera DPC reparation på plasmid DNA transfekterade in reparation bristfällig och kunnig däggdjursceller. Denna analys är snabb, kvantitativa, extremt flexibel och direkt åtgärder reparera aktivitet. Medan rapporten fokuserar på användning av denna metod att studera reparation av DPC-anrop, illustrerar resultat som presenteras nedan att reparation av någon lesion som blockerar Taq polymeras kan studeras med hjälp av denna metod.
Logiken bakom utvecklingen av denna metod är att få insikt i de mekanismer genom vilka däggdjursceller reparera DPC-anrop. Till skillnad från andra typer av DNA-skador är DPC-anrop kraftigt skiftande1,2. Studier har visat att hundratals av cellulära proteiner kan bli tvärbundna till DNA och som för varje protein det finns i princip många aminosyra sida kedjor som kunde bli kovalent kopplade till cellulär DNA3. Dessutom finns det många kemiska fästpunkter för proteiner på DNA ryggraden, inklusive flera positioner på nucleotide baser samt på ribos socker4,5. Denna kemiska mångfald väcker utsikten att olika biokemiska vägar kan åberopas för att reparera olika typer av DPC-anrop. Det var med denna oro i sinnet att Specialföretaget-qPCR analysen utvecklades.
Flera tekniker har utvecklats för att få inblick i molekylärbiologi av cellulära DPC reparation. Följande ger en översikt över de stora strategier som har utvecklats, med en sammanfattning av stora styrkor och svagheter varje äga. Det är värt att betona att medan denna sammanfattning är inriktad på studier av DPC reparation i däggdjursceller kultur system, betydande bidrag till den nuvarande modellen för DPC reparation har gjorts med hjälp av mikrobiell och cell-fria system som inte diskuteras i detta Manuskriptet.
Kanske är den lättaste strategi som kan vidtas för att få inblick i genetiken av DPC reparation att bedöma respektive känslighet till celldöd hos vildtyp och muterade celler utsätts för agenter som inducerar DPC6,7. Denna strategi är relativt snabb, billig och kräver inte specialistkompetens utöver möjligheten att utföra grundläggande cell kultur tekniker. Som motvikt till dessa fördelar är många begränsningar för detta synsätt bland annat följande. Första mäter analysen direkt inte DNA-reparation. Den arbetshypotes som ligger bakom denna strategi är att inactivating mutationer i gener som kodar för relevanta DNA reparation proteiner leder till en ansamling av DNA skada som utlösare programmerad celldöd. Dock kan, mutationer i gener som kodar för icke-DNA-reparation proteiner i princip, öka (eller minska) cellulär känslighet för xenobiotiska-inducerad celldöd. Det andra agenter som skapar DPC alltid framkalla andra typer av DNA-skador (ett undantag är 5-aza-2'-deoxycytadine, men denna agent också utarmar cellulära methyltransferase nivåer8). Därför är det tänkbart att ökad cellulär överkänslighet mot agenten i fråga kan återspegla defekter i reparation av interstrand antipyridinantikropp eller andra skador. För det tredje, som nämndes ovan, DPC representerar en oerhört heterogen klass består av olika typer av kemiska antipyridinantikropp, inbegriper partner från olika protein. Det är möjligt att medan reparation av en eller flera undertyper av dessa lesioner kan ändras i en viss genetisk bakgrund, inte kan denna skillnad är tillräcklig för att avsevärt ändra cellulära överkänslighet mot döden som induceras av denna agent. Sammanfattningsvis, medan denna strategi utgör en attraktiv utgångspunkt, betona begränsningarna ovan vikten av att fullfölja andra, mer direkta metoder för att studera kinetiken för DPC reparation.
Ett antal relaterade metoder har utvecklats för att uppnå detta mål. Utredarna har exempelvis utvecklat metoder att skilja mellan 'gratis' DNA och 'protein-bound' DNA9,10,11. Med dessa metoder, är det möjligt att jämföra steady state nivåer av DPC-anrop eller efter exponering för en DPC-producerande agent i olika genetiska bakgrunder. De två strategier som har använts mest innebära separera DPC-innehållande DNA från gratis DNA med hjälp av antingen en nitrocellulosa membran bindande strategi eller KCl/SDS nederbörd12,13. I den tidigare strategin celler lyserat och passerade genom ett filter av nitrocellulosa. Eftersom nitrocellulosa binder proteinet, behåller filtret protein-kopplade DNA, tillåter gratis DNA att passera. I den sistnämnda strategin separeras proteinbundet DNA från gratis DNA bygger på det faktum att SDS binder till protein men inte DNA, och kan utlösas av tillägg av KCl. Protein-kopplade DNA blir följaktligen olösliga medan obundna DNA förblir i lösning. DPC-innehållande DNA kan sedan vara quantitated med radiomärkt tymidin (om celler var ursprungligen metaboliskt märkt) eller genom ett DNA-selektiv fluorescerande färgämne som Hoechst 33258. Dessa metoder är reproducerbara och kräver ett litet antal steg. Men ger de inte information om arten av den kemiska crosslink genom vilket protein är kopplad till DNA. Dessutom är det viktigt att Observera att dessa analyser kan överskatta DPC reparera genom att falskeligen scoring ofullständig reparation, dvsproteolytiska bearbetning till mindre DNA-peptid antipyridinantikropp som inte kanske är lika lätt instängd eller fällning, som ärligt uppsåt DNA reparera.
Komet analyser kan användas för att visualisera DPC bildandet i celler14. I dessa experiment minska förekomsten av DPC DNA migration som kan sedan återföras genom förbehandling med proteinas K. Längden på svansen kan därför användas för att uppskatta DPC bildandet. Men som nämnts ovan, skapa DPC-bilda droger andra typer av DNA-skador som kunde förändra svanslängd. Detta protokoll är också mycket tekniska och kräver expertis och utbildning i confocal imaging.
Masspektrometri kan användas för att studera DPC reparation kinetik efter behandling med crosslinking agenter15,16,17. Dessa experiment behandla celler med DPC-bilda agenter och isolera DPC-anrop via utvinning för biotin capture eller fenol: kloroform (1:1). Masspektrometri kan sedan användas för att identifiera de tvärbundna proteinerna eller kvantifiera mängden DPC bildas över tid. Den stora fördelen med detta tillvägagångssätt är arten av de uppgifter som produceras. Det är möjligt att just katalog typerna av proteiner som blir tvärbundna efter exponering för en xenobiotiska, dock detta protokoll är dyrt, tidskrävande, och begränsas av typ av crosslink som kan upptäckas.
Maizels et al. utvecklat en känslig 'RADAR' (snabb inställning till DNA addukt återhämtning) analysen att kvantifiera immunodetection av DNA-protein addukter samt en ELISA-baserade RADAR assay18,19. Dessa analyser är särskilt användbara för svällning DNA-protein intermediärer som övergående bildar i celler och generera prover lämpliga för massa spektroskopi att identifiera nya protein addukter. Denna immunodetection analys bygger på tillgänglighet av antikroppar att fånga den DNA-protein crosslink och därför kanske inte kan upptäcka försämrad DNA-peptid addukter formuläret under reparation. Nyligen, en specifik DPC reparera vägen kopplade till DNA-replikation och en DNA-beroende metalloprotease Spartan upptäcktes i vilken DPC-anrop är proteolyzed till mindre peptider under reparation20,21. Ärftliga mutationer i denna gen är associerade med Ruijs-Aalfs syndrom hos människor, en sjukdom som kännetecknas av genomisk instabilitet, för tidigt åldrande och levercancer22. Möss med genmanipulerade spartanska gen defekter visar liknande fenotyper23.
Värdcellen reaktivering av transkriptionell aktivitet har använts för att studera reparation av definierade lesioner på transfekterade plasmid DNA substrat24,25. I dessa experiment, plasmid som innehåller DPC-anrop (eller andra typer av DNA lesioner) som blockerar transkriptionen av en reporter, såsom luciferas, är transfekterade celler. Luminiscens mätningarna tagna 24-72 h senare sedan är korrelerade med DPC reparation. Men dessa indirekta reparation testmetoder är oförmögna att upptäcka reparation händelser tidigare än 24 h efter transfection och inte kan skilja mellan RNA-polymeras förbikopplingen av delvis reparerade substrat och komplett reparation.
Var och en av metoderna som beskrivs ovan har fördelar och har bidragit till den nuvarande modellen för DPC reparation. Dock SSPEN-qPCR analysen kringgår flera av de begränsningar som är associerade med dessa andra metoder och följaktligen kan ge mer specifik insikt i DPC reparationsmekanismer. Exempelvis kan den SSPEN-qPCR-analysen direkt mäta reparation av platsspecifika DPC på DNA i intakt däggdjursceller. Denna metod är mångsidig och har använts för att erhålla reparation resultat efter transfection i hamster och mänskliga cellinjer. Transfection av Plasmiden kan utföras med lipofection eller elektroporation i odlade däggdjursceller linjer. Det garanterar också att endast reparation av definierade DPC mäts, och inte andra typer av DNA-skada inducerad av de flesta DPC-bilda agenter. Den SSPEN-qPCR är enkelt att utföra, billig och snabb. Resultat som erhållits med hjälp av denna analys har upptäckt reparation händelser så tidigt som 2 h efter transfection. Med den här metoden kan variabler som kan påverka DPC reparation utfall studeras på ett sätt som är känslig och effektiv. Till exempel har rollen av transkription i DPC reparation ännu inte utvärderas noggrant. På grund av flexibiliteten hos SSPEN-qPCR-analys, kan crosslinking platsen för DPC manipuleras för att åtgärda denna fråga. Införandet av en beskärning av replikering till DPC-bärande Plasmiden kan dessutom användas att hantera påverkan av replikering på DPC reparation. Dessutom kan flera antipyridinantikropp skapas på plasmiden att undersöka skillnader i reparation av en enda DPC kontra flera antipyridinantikropp. Det är frågor som skulle vara svår att besvara med hjälp av kromosomala DNA men kan enkelt åtgärdas med Specialföretaget-qPCR-analys. Övergripande, Specialföretaget-qPCR analysen kräver renas, plasmid DNA i mikrogram mängder innehållande en lesion av en känd plats. Addukter förutom DPC kan användas i denna analys, dock lesionen måste kunna blockera förlängning av Taq polymeras.
Protocol
1. generering av DPC-innehållande Plasmid
- Kombinera 80 pmol av oligonukleotiden som innehåller en 8-oxoguanine rester (20 µL) med 10 enheter av T4 polynucleotide kinase (1 µL) i 10 x ligase buffert (5 µL). Tillsätt vatten för att nå en total volym på 50 µL och inkubera vid 37 ° C under 30 minuter i ett uppvärmt vattenbad.
- Kombinera den fosforylerade oligonukleotiden (50 µL), 80 pmol enkelsträngat DNA (80 μl), 100 enheter Taq-polymeras (20 µL) i 10 x Taq reaktion buffert (25 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTP (20 µL), NEB buffert 2 (25 µL) och 8 µg BSA (20 µL) till totalt 260 µL. Inkubera i provet i en termocykler vid 75 ° C under 15 minuter följt av 37 ° C i 5 min. Lägg sedan till 60 U av T4-polymeras (20 µL), 8000 U T4 ligase (20 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTP (20 µL), NEB buffert 2 (15 µL) och 8 µg BSA (20 µL) till totalt 375 µL. Inkubera reaktionen över natten vid 37 ° C (figur 1A).
- Skapa en 50: 50 buffert-mättade fenol: kloroform blandning. Lägg till lika stora volymer av varje komponent, mix, och snurra i en bordsskiva Centrifugera vid 21,130 x g för 5 min. kloroform enheter vatten ur den buffert-mättade fenol att bilda två lager: ett övre, vattenhaltigt lager och en botten, organiska skikt. Lägga till 375 µL av den lägsta, organiska lagret primer filändelsen reaktionen, mix, och snurra i en bordsskiva Centrifugera vid 21,130 x g i 5 min.
FÖRSIKTIGHET: Fenol och kloroform är farliga ämnen och försiktighetsåtgärder bör vidtas för att undvika kontakt med ögon och hud.- Efter centrifugering, försiktigt extrahera det översta lagret och blanda med ammoniumacetat till en slutlig koncentration på 0,3 M följt av 2 volymer av 100% etanol. Förvara lösningen vid-20 ° C i minst 30 min eller över natten.
- Snurra provet i en bordsskiva Centrifugera vid 15000 x rpm vid 4 ° C i 10 min. ta bort supernatanten och tvätta pelleten i 1 mL 70% etanol. Snurra provet i en bordsskiva Centrifugera vid 15000 x rpm vid 4 ° C för 5 min. avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 µL av vatten.
- Kombinera 50 µL av DNA från föregående steg med 16 µL 6 x gel-lastning färgämne och 34 µL vatten och omfattas av elektrofores på en 0,8% low-melt agaros gel innehållande 0,5 µg/mL etidiumbromid. Kör gelen vid 2 V/cm på en 10-cm gel för 6 h i 1 x TAE buffert. Punktskatt supercoiled bandet med ett rakblad och väga gel slice (figur 1A). Kör en positiv kontroll att fungera som en markör för där kovalent sluten, supercoiled DNA migrerar.
FÖRSIKTIGHET: Etidiumbromid är ett mutagen och försiktighetsåtgärder bör vidtas för att undvika kontakt med huden. Dessutom är det viktigt att minimera den tid som plasmiden provet utsätts för UV för att minska bildningen av UV ljusprodukter.- Smälta gel segmentet genom att lägga till 10% β-agarase reaktion buffert för varje mg av gel vikt. Inkubera vid 65 ° C i 10 min och låt svalna till 42 ° C. Tillsätt 10 U av β-agarase och inkubera vid 42 ° C för 1 h.
- Följande inkubation, mäta volymen och lägga ammoniumacetat till en slutlig koncentration på 0,3 M och chill på is för 15 min. Centrifugera vid 15000 x g i 15 min i rumstemperatur, samla in supernatanten och lägga till 2 volymdelar isopropanol. Chill på-20 ° C över natten.
- Centrifugera renat, supercoiled DNA i 10 min på 15 000 x rpm i en bordsskiva centrifug vid 4 ° C och återsuspendera pelleten i 40 µL av vatten.
- Crosslink 12 pmol (15 µL) av DNA till 36 pmol av oxoguanine glykosylas (1 µL) i buffert innehållande 100 mM NaCl (3 µL), 1 mM MgCl2 (3 µL), 20 mM Tris-HCl pH 7,0 (6 µL) och 10 mM natrium cyanoborohydride (2 µL) att nå en slutlig volym av 30 µL vid 37 ° C för 30 min26. Ta bort 1 µL av tvärbunden prov och späd i 500 µL vatten att fungera som en 0 h data peka och analysera på PCR i steg 3.
2. kCl/SDS nederbörd
- För att visualisera crosslinking effektivitet, smälta begränsning 1 µg av tvärbunden plasmiden med 1 μL BspDI i 10 x buffert vid 37 ° C för 1 h att generera två olika storlek DNA-fragment.
Obs: Ett fragment tvärbundna till protein (4,4 kb) och den andra kommer inte (2.8 kB) (figur 1B).- Dela upp proverna i hälften, lägga till SDS både till en slutlig koncentration av 0,5% och inkubera vid 65 ° C i 10 min.
- Lägg till KCl (slutlig koncentration 100 mM) till en av proverna och inkubera på is för 5 min.
- Centrifugera båda prover på 12 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C och kör supernatanterna på en agarosgel att uppskatta procent konjugationen av protein-DNA12.
Obs: KCl/SDS nederbörd används för kvalitetskontroll, inte substrat förberedelse.
3. transfection i däggdjursceller
- 1 dag före transfection, plåt 0,5 x 106 celler per brunn i en 6-bra platta. Nästa dag, blanda 1,5 µg (30 µL) av DPC-innehållande plasmiden (från steg 1,6) med 300 µL serum-fri kultur media. I en annan tube, blanda 12 µL transfection reagens och 300 µL serum-fri kultur media. Kombinera 300 µL utspädda DNA med 300 µL utspädda transfection reagens och inkubera i 5 min i rumstemperatur. Tillsätt 250 µL av komplexen till var och en av två brunnar och inkubera i minst 1 h vid 37 ° C.
- Efter inkubation, ta bort media, tillsätt 1 mL 0,6% SDS/0,01 M EDTA, och odla i rumstemperatur för 10-15 min. skrapa cellerna med en gummi-polis och överföra till ett 1,5 mL mikrofugrör. Tillsätt 200 µL 5 M NaCl (slutlig koncentration på 1 M), vänd försiktigt 5 gånger och inkubera vid 4 ° C över natten27.
- Centrifugera proverna vid 21,130 x g i en bordsskiva Centrifugera vid 4 ° C i 30 min, samla supernatanten, etanol fällningen som beskrivs ovan och återsuspendera i 50 µL av vatten.
4. Specialföretaget-qPCR
- Blanda ihop 1 µL av återvunna DNA från varje tidpunkt (inklusive 0 h), 2 x SYBR green PCR master mix (30 µL), 27 µL av vatten och 1 µL (100 pMol) primer kompletterande till skada delen av Plasmiden (Primer R, figur 2). Utföra PCR med följande villkor: inledande före smälta för 10 min vid 90 ° C, följt av 8 cykler av: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 min. Vid slutförandet av cykel 8 tillsätt 1 µL (100 pMol) av andra primern totalt 60 µL (Primer L, figur 2)28 (se Tabell av material för reagens Detaljer).
- Blanda 1 µL oförstärkta återhämtade DNA från varje tidpunkt (inklusive 0 h), 2 x master mix (30 µL), 27 µL av vatten och 1 µL av varje grundfärg (100 pMol) till totalt 60 µL.
- Ladda en PCR-plattan med 96 brunnar med prover från steg 4.1 och 4.2 (20 µL per brunn, i tre exemplar) och utföra qPCR för 30 cykler med hjälp av förhållandena som beskrivs ovan.
- Genomsnittliga CT-värdena från varje uppsättning tre exemplar prover. Subtrahera de CT-värden som genereras i steg 4.1 från dem i steg 4,2 till få deltan CT-värde för varje prov. Subtrahera 0 h tidpunkten från delta CT värdet att ta bort någon bakgrund (se Representativa resultat avsnitt för en detaljerad beskrivning).
- Konvertera deltan CT-värde i procent reparation med hjälp av formeln:
Representative Results
För att utnyttja SSPEN-qPCR analysen för att bedöma cellulära DPC reparation, måste en tillräcklig mängd (µg belopp) hög kvalitet DPC reparation substrat förberedas. För att få denna produkt, var en oligonukleotid som innehåller en 8-oxoguanine rester glödgat till kompletterande enkelsträngat DNA, primer extended och gel renas för att säkerställa att endast kovalent, stängda cirkulär produkt användes för transfections (figur 1a). detta betänkande fokuserar på substrat där natriumborhydrid-svällning används för att skapa en kovalent crosslink mellan rekombinant human oxoguanine glykosylas och en ribos enhet på en cirkulär dubbelsträngat plasmid molekyl, även om likartade metoder kan användas för att erhålla kemiskt olika DPC substrat. Oxoguanine glykosylas/natriumborhydrid svällning strategin är särskilt attraktiv med tanke på den extremt höga verkningsgraden av crosslinking reaktion. Som visas i figur 1B, KCl/SDS nederbörd utförs på DPC substrat som hade varit rötas i två fragment selektivt och nästan kvantitativt utarmat de DNA-fragment som härbärgerat DPC. Dessa resultat stöder slutsatsen att i princip 100% av Plasmiden substrat molekyler innehåller ett protein crosslink.
Specialföretaget för värdepapperisering-qPCR analysen beskrivs i avsnittet protokoll använder tredjeparts CT-värden som genereras av qPCR att beräkna procent av DPC reparation efter transfection i däggdjursceller. Som figur 2 illustrerar, blockerar den protein crosslink Taq polymeras från att utvidga den 'R' primer glödgas till DPC-innehållande delen. Ett andra, viktiga inslag i denna analys är införlivandet av åtta rundor av SSPEN reaktioner (med R primer) innan du utför den qPCR-analysen. Medan oskadad (eller reparerade) DNA kommer att utvidgas under dessa SSPEN reaktioner, kommer att skapa en bindande webbplats för nedströms 'L' primer, skadat DNA (eller ofullständigt reparerade DNA) inte att förlängas. Följaktligen ökar SSPEN överflödet av varje oskadad (eller reparerade) del av eight-fold. Detta innebär att repareras prover där steget Specialföretaget har utförts före qPCR visas ett CT-värde som är tre enheter lägre än vad som erhålls för en identisk prov där SSPEN inte utfördes före qPCR (figur 2). Tre-enheten skillnaden i CT-värden som observerats för de två behandlingar, kallad ΔCT, återspeglar faktumet att 8 = 23. Detta delta CT-värde kan användas för att beräkna cellulär DNA reparation aktivitet med hjälp av formel: procent DNA-reparation = (2ΔCT /23) x 100. Kontroll experiment bekräftade att ett delta CT-värde av cirka 3 observerades konsekvent när oskadade substrat plasmider utsattes för Specialföretaget-qPCR (inga data anges).
Tabell 1 illustrerar CT-exempelvärden som genererats från DPC-innehållande plasmid substrat som var återhämtat sig från kinesisk hamster lungfibroblaster 3 h och 8 h efter transfection (tabell 1A), såväl som från tid noll prover, dvs, prover som beretts enligt anvisningarna i avsnittet protokoll, men som inte transfekterade celler (tabell1B). Tabellen ger också ΔCT och procent reparera värden (formel 2ΔCT/23 x 100) erhålls från dessa prover. Som illustreras i tabell 1A, procent reparation beräknas från prover skördas 3 h och 8 h efter transfection var 66% och 93%, respektive. Dessa värden sedan subtraheras från som erhållits från analys av 0 h prov att bestämma procentuella reparera. Tabell 1B skildrar CT-värden för två olika 0 h prover där effektiv crosslinking var eller uppnåddes inte före transfection. Effektivt resulterade tvärbundna prov i ett delta CT-värde på 0,8 medan ett dåligt tvärbundna prov resulterade i ett delta CT-värde på 2,5. Hittills har det inte varit möjligt att exakt fastställa källan till 0.8 bakgrund signal i den effektivt tvärbundna 0 h provet. Det är osannolikt att denna bakgrund speglar en låg nivå av antingen spontan DPC-borttagning, eller är på grund av en låg nivå av Taq polymeras 'gå förbi' syntes genom DPC lesionen: omfattande experiment utförs på högrenade enkelsträngat M13 substrat konsekvent gett ett delta CT-värde av cirka 0,8, bakgrund dvsi princip identiskt med detta' ' förlängning ses i DPC-innehållande substrat. Det är följaktligen sannolikt att det är en liten grad av mis priming av 'R' primer under SSPEN som resulterar i generationen av en liten mängd produkt som kan därefter förstärkas när 'L' primern läggs och qPCR utförs. Ansträngningar för att eliminera denna bakgrund genom att manipulera PCR villkor har, hittills, har underlåtit att avhjälpa felet. Subtraktion strategin beskrivs ovan tillåter emellertid att korrekt uppskattning av DPC reparation aktivitet. Det är värt att notera att ineffektiva crosslinking av proteinet på plasmiden kommer att resultera i en förhöjd bakgrundsvärde. Detta skildras i exempeldata i tabell 1B där ineffektiva protein-DNA crosslinking resulterat i ett högre delta CT-värde för tid 0. Därför utförs alltid kontroll experiment innan transfections och substrat med delta CT-värden ovanför den 0,8 tröskelnivå ignoreras. Som nämns i protokollet qPCR, är varje prov uppdelad i 3 brunnar att säkerställa pipettering konsekvens. Dessa replikat är sedan i genomsnitt för att få värdet CT för urvalet. Replikerar att avvika mer än ± 0,1 elimineras från datauppsättningen. Om alla tre replikat avviker mer än ± 0,1 från varandra, är Specialföretaget-qPCR analysen redone tills konsekventa värden erhålls. Erfarenheten visar att minst 3 oberoende transfections måste utföras för att erhålla tillförlitliga genomsnittliga värden som sedan kan bli föremål för statistisk analys avgöra inverkan av olika parametrar på DPC reparation effektivitet.
Figur 1. Generation av en DPC-innehållande plasmid. (A) en oligonukleotid som innehåller en 8-oxo-guanin rester (röd) är glödgas till enkelsträngat DNA (fet svart cirkel) och extended för att skapa dubbelsträngat plasmid (primer filändelsen produkt anges med streckad linje). Efter elektrofores i etidiumbromid, bandet motsvarar supercoiled DNA (röd ruta) är censurerade från en low-melt agarosgel och smält med β-agarase. Körfält: (1) molekylvikt markör, (2) enkelsträngat DNA, (3) dubbelsträngat DNA, (4) primer utökade provet. (B) Oxoguanine glykosylas (förkortat hOGG1, avbildad som en orange cirkel) är tvärbundna till 8-oxo-guanin återstoden via natrium cyanoborohydride och den resulterande DPC-substraten rötas för att generera en 2.800 base-par, gratis DNA-fragment och en 4.400 baspar fragmentet bifogas proteinet. SDS läggs till provet som är sedan uppdelad i två delar, varav den ena behandlas med KCl och centrifugeras till sediment DPC-innehållande DNA (avbildad som en orange pellet). Supernatanten från denna sistnämnda prov (avbildad som blå vätska i centrifugröret) och provet inte utsätts för KCl utsätts för gelelektrofores. Körfält: (1) molekylvikt markör, (2) -KCl, (3) + KCl. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: kvantifiering av skadade plasmid via SSPEN-qPCR. Plasmid DNA är denaturerad och en primer som komplement till den skadade strand (R) är glödgas och utvidgas. Denna process upprepas för sammanlagt 8 cykler. Med en skadad substrat (överst), Taq polymeras blockeras av DPC lesionen och kommer inte att ge full längd produkt kardeler. Däremot med en reparerad substrat (botten), kommer att Taq polymeras producera fullängds produkt strängar som innehåller bindningsstället för primer L. Efter 8 cykler, primer L läggs, och cykeln tröskelvärdena bestäms med qPCR. Exempel på förstärkning resultat för skadade och oskadade substrat illustreras till höger med den röda linjen representerar DNA som genomgick primer filändelsen före qPCR och blå representerar DNA som inte var primer extended före qPCR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Tabell 1A | ||||
| Tid | -Primer filändelsen | + Primer filändelsen | Δ CT | Procent reparation |
| (2ΔCT/23x 100) | ||||
| 3 h | 23,5 | 21,1 | 2.4 | 66 |
| 8 h | 29,4 | 26,5 | 2,9 | 93 |
| Tabell 1B | ||||
| Tid | -Primer filändelsen | + Primer filändelsen | Δ CT | Procent bakgrund |
| (2ΔCT/23x 100) | ||||
| 0 h | 15,4 | 14,6 | 0,8 | 22 |
| 0 h | 15,4 | 12,9 | 2.5 | 71 |
Tabell 1: beräkna procent reparera med hjälp av CT-värden som genereras från Specialföretaget-qPCR. (A) reparation av DPC-innehållande substrat transfekterade i V79 Chinese hamster lungfibroblaster 3 h och 8 h efter transfection. (B) SSPEN-qPCR av 0 h prover inte transfekterade celler. I ett prov effektiviteten av crosslinking reaktion mellan DNA och oxoguanine glykosylas var hög (detta prov gav ett lågt delta CT-värde) medan i andra urvalet av protein crosslinking effektivitet var låg (detta prov gav en relativt hög delta CT-värde). Se text av Representativa resultat för detaljer.
Discussion
Metoden SSPEN-qPCR erbjuder många fördelar jämfört med andra tillvägagångssätt genom att undersöka reparation av en homogen befolkning som innehåller en enda, definierade DPC lesion. Det är anmärkningsvärt att förutom kontrollera identiteten hos proteinet och typen av kemisk crosslink används för att ansluta proteinet till DNA, är det möjligt att enkelt manipulera sekvens ramen som DPC lesionen introduceras. Vi har utforskat påverkan på DPC reparation av att införa lesionen på antingen mallen eller kodning strand av en plasmid nedströms av en aktiv promotor locus. Likaså, vi håller på att undersöka påverkan på DPC reparation av replikering med en M13 plasmid som innehåller en SV40 ursprung replikering transfekterade i HEK293T celler. Analysen som beskrivs häri direkt åtgärder DPC reparation, i motsats till andra strategier som värd cell reaktivering att indirekt uppskattningar reparera aktivitet24,25. Systemet är dessutom robust, känslig och kvantitativa. Till skillnad från andra system, som mäter DPC borttagning, denna analys endast upptäcker komplett reparation händelser, dvs, det kräver inte bara att DPC lesionen avlägsnas utan att integriteten för duplex DNA vara helt återställd17. Detta beror på att abasic platser och nicks eller avbrott i phosphodiester ryggraden blockera analysen så effektivt som de ursprungliga DPC lesion29.
Medan rapporten fokuserar på en viss typ av DPC, som skapades av natriumborhydrid svällning enzym reaktion mellanliggande, vi utvecklar för närvarande metoder för att studera reparation av DPC-anrop som involverar andra proteiner och lesioner där protein kopplingen till DNA sker genom nukleosid basen, i stället för ribos position. Använda reduktiv aminering, har vi skapat protein och peptid antipyridinantikropp fäst vid guanin eller cytosin bas av en DNA primer30. Dessa oligonukleotider var renas till homogenitet och används för att generera supercoiled plasmider som innehåller DNA-protein och DNA-peptid antipyridinantikropp. Samtidigt som effektiviteten i dessa reaktioner reduceras något i förhållande till oxoguanine glykosylas crosslink tillvägagångssätt som beskrivs i detalj ovan, de lyckades ändå och tillåta granskning av reparation av dessa substrat i vildtyp och nucleotide excision repair-brist på däggdjursceller linjer. Vi har också använt SSPEN-qPCR analysen för att studera reparation av oxoguanine lesioner och ett syntetiskt ribos-kolesterol konjugat, som visades tidigare repareras via den cellulära nucleotide excision repair maskiner31. Som figur 2 visar grafiskt, reparation av någon lesion att block primer förlängning av Taq polymeras kan, i princip mätas med Specialföretaget-qPCR-analys.
Aktuella modeller av DPC reparation tyder på att större DPC (> 10 kDa) utsätts proteolytiska behandling till mindre peptid lesionen före borttagning32,33,34. Troligaste kandidaterna ansvarar för denna proteolys är proteasom eller en specifik proteashämmare i mänskliga celler som heter spartanska20,21,35,36,37, 38. ytterligare utredningar in i roller av dessa proteaser kan genomföras med Specialföretaget-qPCR-analys. Proteasomhämmare kunde användas för att förbehandla celler före transfection med DPC-innehållande substrat. Alternativt kunde vara transfekterade spartanska knockdown cellinjer med skadade plasmider att belysa dess roll i proteolys av större DPC.
Oavsett vilken metod som används för att skapa crosslink eller DNA lesionen karaktär, är det värt att understryka att metoden SSPEN-qPCR är kritiskt beroende av förmågan att generera betydande mängder homogen DPC-plasmid substrat. Steg som är väsentliga för denna analys inkluderar rening av kovalent, stängd cirkulär plasmid efter primer förlängning för att eliminera någon nicked eller linjär plasmid molekyler. Dessa föroreningar måste elimineras för att säkerställa att eventuella efterföljande DPC reparation observerats inte beror på nick-riktad eller dubbel-strand paus-regisserad reparationsprocesser. Underlåtenhet att erhålla tillräckliga mängder av supercoiled DNA efter primer filändelsen reaktioner kan övervinnas genom att variera förhållandet mellan oligonukleotiden till enkelsträngat DNA. Ett annat viktigt steg för Specialföretaget-qPCR metoden, är crosslinking effektivitet av proteinet till Plasmiden. I denna studie användes en effektiv, enzymatisk reaktion till crosslink oxoguanine glykosylas proteinet till en 8-oxo-guanin lesion. Sub optimal crosslinking kan förbättras genom att variera mängden protein till reaktionen.
Medan resultaten beskrivs i denna rapport åberopade lipofection att införa DPC reparation substrat i mottagarens celler, det finns ingen anledning, en priori, andra transfections metoder inte kunde anställas. Vi har utfört preliminära studier och observerade att elektroporation39 kan också användas. Men det är värt att notera att vår erfarenhet, elektroporation transfection effektivitet minskas jämfört med lipofection och vi fann det nödvändigt att använda transportören DNA (upp till 5 µg) utöver de 1,5 µg av DPC substrat för att få reparera data. Specialföretaget för värdepapperisering-qPCR metoden som beskrivs ovan ger sammantaget ett innovativt sätt att uteslutande undersöka DPC reparation på plasmid DNA och generera nya insikter om DNA skador svaret.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner stöds av utbildning Grant 5T32HL007741. Vi tackar Natalia Tretyakova (University of Minnesota) och Ashis Basu (University of Connecticut) och medlemmarnas lab för stöd och teknisk rådgivning under de tidiga och mellanliggande stadier av detta arbete.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
| Taq polymerase | NEB | M0267L | |
| ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
| dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| T4 polymerase | NEB | M0203L | |
| T4 ligase | NEB | M0202L | |
| β-agarase | NEB | M0392S | |
| Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
| Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
| Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
| BspD1 | NEB | R0557S | |
| NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
| StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |
References
- Tretyakova, N. Y., Groehler, A., Ji, S. DNA-Protein Cross-links: Formation, Structural Identities, and Biological Outcomes. Accounts of chemical research. 48 (6), 1631-1644 (2015).
- Barker, S., Weinfeld, M., Murray, D. DNA-protein crosslinks: their induction, repair, and biological consequences. Mutat Res. 589 (2), 111-135 (2005).
- At Groehler, A. t, Degner, A., Tretyakova, N. Y. Mass Spectrometry-Based Tools to Characterize DNA-Protein Cross-Linking by Bis-Electrophiles. Basic Clin Pharmacol Toxicol. 121, 63-77 (2016).
- Barker, S., Weinfeld, M., Zheng, J., Li, L., Murray, D. Identification of mammalian proteins cross-linked to DNA by ionizing radiation. J Biol Chem. 280 (40), 33826-33838 (2005).
- Dizdaroglu, M., Gajewski, E. Structure and mechanism of hydroxyl radical-induced formation of a DNA-protein cross-link involving thymine and lysine in nucleohistone. Cancer Res. 49 (13), 3463-3467 (1989).
- Chvalova, K., Brabec, V., Kasparkova, J. Mechanism of the formation of DNA-protein cross-links by antitumor cisplatin. Nucleic Acids Res. 35 (6), 1812-1821 (2007).
- Speit, G., Schutz, P., Merk, O. Induction and repair of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks in repair-deficient human cell lines. Mutagenesis. 15 (1), 85-90 (2000).
- Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. Mechanisms of DNA-protein crosslink repair. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Kohn, K. W., Erickson, L. C., Ewig, R. A., Friedman, C. A. Fractionation of DNA from mammalian cells by alkaline elution. Biochemistry. 19 (15), 4629-4637 (1976).
- Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA damage and repair in mouse leukemia L1210 cells treated with nitrogen mustard, 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea, and other nitrosoureas. Cancer Res. 37, 2114-2122 (1977).
- Ewig, R. A., Kohn, K. W. DNA-protein cross-linking and DNA interstrand cross-linking by haloethylnitrosoureas in L1210 cells. Cancer Res. 38, 3197-3203 (1978).
- Zhitkovich, A., Costa, M. A simple, sensitive assay to detect DNA-protein crosslinks in intact cells and in vivo. Carcinogenesis. 13 (8), 1485-1489 (1992).
- Chiu, S. M., Sokany, N. M., Friedman, L. R., Oleinick, N. L. Differential processing of ultraviolet or ionizing radiation-induced DNA-protein cross-links in Chinese hamster cells. Int J Radiat Biol Relat Stud Phys Chem Med. 46 (6), 681-690 (1984).
- Merk, O., Reiser, K., Speit, G. Analysis of chromate-induced DNA-protein crosslinks with the comet assay. Mutat Res. 471 (1-2), 71-80 (2000).
- Loeber, R. L., et al. Proteomic analysis of DNA-protein cross-linking by antitumor nitrogen mustards. Chem Res Toxicol. 22 (6), 1151-1162 (2009).
- Gherezghiher, T. B., Ming, X., Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Y. 1,2,3,4-Diepoxybutane-induced DNA-protein cross-linking in human fibrosarcoma (HT1080) cells. J Proteome Res. 12 (5), 2151-2164 (2013).
- Groehler, A. t, Villalta, P. W., Campbell, C., Tretyakova, N. Covalent DNA-Protein Cross-Linking by Phosphoramide Mustard and Nornitrogen Mustard in Human Cells. Chem Res Toxicol. 29 (2), 190-202 (2016).
- Kiianitsa, K., Maizels, N. A rapid and sensitive assay for DNA-protein covalent complexes in living cells. Nucleic Acids Research. 41 (9), e104 (2013).
- Kiianitsa, K., Maizels, N. Ultrasensitive isolation, identification and quantification of DNA-protein adducts by ELISA-based RADAR assay. Nucleic Acids Research. 42 (13), e108 (2014).
- Stingele, J., et al. Mechanism and Regulation of DNA-Protein Crosslink Repair by the DNA-Dependent Metalloprotease SPRTN. Molecular Cell. 64 (4), 688-703 (2016).
- Vaz, B., et al. Metalloprotease SPRTN/DVC1 Orchestrates Replication-Coupled DNA-Protein Crosslink Repair. Mol Cell. 64, 704-719 (2016).
- Maskey, R. S., et al. Spartan deficiency causes accumulation of Topoisomerase 1 cleavage complexes and tumorigenesis. Nucleic Acids Res. 45 (8), 4564-4576 (2017).
- Lessel, D., et al. Mutations in SPRTN cause early onset hepatocellular carcinoma, genomic instability and progeroid features. Nature Genetics. 46 (11), 1239-1244 (2014).
- Baker, D. J., et al. Nucleotide excision repair eliminates unique DNA-protein cross-links from mammalian cells. J Biol Chem. 282 (31), 22592-22604 (2007).
- Ahn, B., Kang, D., Kim, H., Wei, Q. Repair of mitomycin C cross-linked DNA in mammalian cells measured by a host cell reactivation assay. Mol Cells. 18 (2), 249-255 (2004).
- Fromme, J. C., Bruner, S. D., Yang, W., Karplus, M., Verdine, G. L. Product-assisted catalysis in base-excision DNA repair. Nat Struct Biol. 10 (3), 204-211 (2003).
- Hirt, B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J Mol Biol. 26 (2), 365-369 (1967).
- Lee, H. W., et al. Monitoring repair of DNA damage in cell lines and human peripheral blood mononuclear cells. Anal Biochem. 365 (2), 246-259 (2007).
- Sikorsky, J. A., Primerano, D. A., Fenger, T. W., Denvir, J. DNA damage reduces Taq DNA polymerase fidelity and PCR amplification efficiency. Biochemical and biophysical research communications. 355 (2), 431-437 (2007).
- Wickramaratne, S., Mukherjee, S., Villalta, P. W., Scharer, O. D., Tretyakova, N. Y. Synthesis of sequence-specific DNA-protein conjugates via a reductive amination strategy. Bioconjug Chem. 24 (9), 1496-1506 (2013).
- George, J. W., et al. Restoration of nucleotide excision repair in a helicase-deficient XPD mutant from intragenic suppression by a trichothiodystrophy mutation. Mol Cell Biol. 21 (21), 7355-7365 (2001).
- Minko, I. G., et al. Initiation of Repair of DNA-Polypeptide Cross-Links by the UvrABC Nuclease. Biochemistry. 44 (8), 3000-3009 (2005).
- Minko, I. G., Zou, Y., Lloyd, R. S. Incision of DNA-protein crosslinks by UvrABC nuclease suggests a potential repair pathway involving nucleotide excision repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, (2002).
- Reardon, J. T., Sancar, A. Repair of DNA-polypeptide crosslinks by human excision nuclease. PNAS. 103, 4056-4061 (2006).
- Lopez-Mosqueda, J., et al. SPRTN is a mammalian DNA-binding metalloprotease that resolves DNA-protein crosslinks. eLife. 5, e21491 (2016).
- Stingele, J., Schwarz, M. S., Bloemeke, N., Wolf, P. G., Jentsch, S. A DNA-dependent protease involved in DNA-protein crosslink repair. Cell. 158 (2), 327-338 (2014).
- Duxin, J. P., Dewar, J. M., Yardimci, H., Walter, J. C. Repair of a DNA-Protein Crosslink by Replication-Coupled Proteolysis. Cell. 159 (2), 346-357 (2014).
- Stingele, J., Habermann, B., Jentsch, S. DNA-protein crosslink repair: proteases as DNA repair enzymes. Trends in Biochemical Sciences. 40 (2), 67-71 (2015).
- Potter, H., Heller, R., et al. Transfection by Electroporation. Current protocols in molecular biology. Ausubel, F. M., et al. , CHAPTER Unit-9.3 (2003).
