Summary
O objetivo do presente protocolo é quantificar a reparação de ligações cruzadas de ADN-proteína definidas no plasmídeo. Lesado plasmídeos são transfectados em linhas de células de mamíferos destinatário e peso molecular baixo colhidas em vários pontos de tempo pós-transfecção. Cinética de reparo de DNA são quantificados usando a extensão de vertente específica da primeira demão, seguido por qPCR.
Abstract
A finalidade desse método é fornecer uma técnica quantitativa, rápida e flexível para examinar a cinética de reparo de ADN-proteína crosslink (DPC) em linhas de células de mamíferos. Em vez de globalmente intra remoção de remoção de DPC cromossômica xenobiótico-induzido ou espontânea, este ensaio examina a reparação da lesão homogênea, quimicamente definida especificamente introduzida em um local dentro de uma carcaça de DNA do plasmídeo. Importante, esta abordagem evita o uso de materiais radioactivos e não é dependente de tecnologia altamente especializada ou cara. Em vez disso, ele conta com os procedimentos padrão de DNA recombinante e instrumentação (qPCR) reação em cadeia de polimerase em tempo real, quantitativo amplamente disponível. Dada a flexibilidade inerente da estratégia utilizada, o tamanho da proteína ligação cruzada, bem como a natureza da ligação química e o DNA preciso contexto sequência do site anexo pode ser variado para resolver as respectivas contribuições desses parâmetros para a eficiência global do reparo da DPC. Usando esse método, plasmídeos, que contém um site-specific DPC foram transfectados em células e baixo peso molecular de DNA recuperado em diversas vezes do pós transfection. DNA recuperado é sujeito a extensão de vertente específica da primeira demão (SEPI) usando um primer complementar para o fio danificado do plasmídeo. Desde a DPC lesão blocos Taq DNA polimerase, a proporção de DNA reparado para un-reparado pode ser quantitativamente avaliada utilizando qPCR. Limiares de ciclo (CT) são usados para calcular % reparar em vários pontos de tempo nas linhas respectivas células. Esse método SEPI-qPCR também pode ser usado para avaliar quantitativamente a reparação aduto de cinética de qualquer DNA polymerase de Taq que blocos.
Introduction
Aqui descritos é um ensaio de PCR-baseados do denominado SEPI-qPCR. A finalidade desse método é quantificar a reparação da DPC no plasmídeo que DNA transfectada em células de mamíferos reparação deficiente e proficiente. Este ensaio é rápido, quantitativo, extremamente flexível, e diretamente medidas reparar a atividade. Enquanto este relatório centra-se sobre a utilização desta metodologia para estudar a reparação de DPCs, os resultados apresentados a seguir ilustram que a reparação de qualquer lesão que bloqueia Taq polimerase pode ser estudada usando esta metodologia.
A lógica por trás do desenvolvimento desse método é obter conhecimento sobre os mecanismos através dos quais pilhas mamíferas reparar DPCs. Ao contrário de outros tipos de dano do ADN, DPCs são maciçamente diversas1,2. Estudos têm demonstrado que centenas de proteínas celulares podem tornar-se ligado ao DNA e que para cada proteína são, em princípio, inúmeras correntes laterais de aminoácido que poderiam tornar-se covalentemente ligadas para o celular de DNA3. Além disso, há numerosos pontos de fixação química de proteínas para a espinha dorsal de DNA, incluindo várias posições sobre as bases de nucleotídeos, bem como sobre a de4,de açúcar ribose5. Esta diversidade química gera a perspectiva de que vias bioquímicas distintas podem ser invocadas para reparar diferentes tipos de DPCs. Foi com esta preocupação em mente, que foi desenvolvido o ensaio da SEPI-qPCR.
Várias técnicas têm sido desenvolvidas para obter conhecimento sobre a biologia molecular do celular reparação DPC. A seguir fornece uma visão geral das principais abordagens que têm sido desenvolvidos, com um resumo dos principais pontos fortes e fracos de cada possui. Vale ressaltar que enquanto este resumo enfoca estudos de reparação DPC em sistemas de cultura de células de mamíferos, contribuições significativas para o modelo atual de reparação DPC foram feitas usando sistemas microbianos e livre de células que não são discutidos neste manuscrito.
Talvez a estratégia mais fácil que pode ser tomada para obter conhecimento sobre a genética do reparo DPC é avaliar a respectiva sensibilidade à morte celular observada nas células tipo selvagem e mutantes, expostas a agentes que induzem DPCs6,7. Esta estratégia é relativamente rápido, barato e não requer conhecimentos especializados, além da capacidade para executar técnicas de cultura de célula básica. Contrabalançar estas vantagens é inúmeras limitações dessa abordagem, incluindo o seguinte. Primeiro, o ensaio não mede diretamente reparação do DNA. O pressuposto de trabalho subjacente a esta estratégia é que resulta em acúmulo de DNA inactivar as mutações em genes que codificam proteínas de reparação de DNA relevantes dano que desencadeia a morte celular programada. No entanto, mutações em genes que codificam proteínas de reparo de ADN poderiam, em princípio, aumentar (ou reduzir) sensibilidade celular à morte celular induzida por xenobiótico. Em segundo lugar, a agentes que criam DPCs invariavelmente induzem outros tipos de danos ao DNA (uma exceção é 5-aza-2'-deoxycytadine, mas este agente também esgota methyltransferase celular níveis8). Consequentemente, é concebível que a hipersensibilidade celular melhorada para o agente em questão pode refletir defeitos no reparo de interstrand ligações cruzadas ou outras lesões. Em terceiro lugar, como foi mencionado acima, DPCs representam uma classe muito heterogênea composta de diferentes tipos de ligações químicas cruzadas, envolvendo parceiros de diferentes proteínas. É possível que enquanto a reparação de um ou mais subtipos dessas lesões pode ser alterada em um determinado fundo genético, esta diferença pode não ser suficiente para alterar significativamente a hipersensibilidade celular à morte induzido por este agente. Em resumo, enquanto esta estratégia representa um atraente ponto de partida, as limitações acima descritas destacam a importância de perseguir outras formas mais diretas para estudar a cinética de reparação DPC.
Uma série de abordagens relacionadas foram desenvolvida para alcançar este objectivo. Por exemplo, os investigadores desenvolveram métodos para distinguir entre DNA 'livre' e 'ligados a proteína' DNA9,10,11. Usando essas abordagens, é possível comparar os níveis de estado estacionário de DPCs ou seguir a exposição a um agente DPC-produzindo em diferentes origens genéticas. As duas estratégias que têm sido mais amplamente utilizadas envolvem separar DPC-contendo DNA de DNA gratuito, utilizando uma estratégia de vinculação de membrana de nitrocelulose ou KCl/SDS precipitação12,13. A primeira abordagem células são lysed e passadas através de um filtro de nitrocelulose. Porque nitrocelulose vincula a proteína, o filtro mantém o DNA proteína ligada, permitindo o DNA livre a passagem. Na estratégia de último ligados a proteína DNA é separado do DNA gratuito baseado no fato de que SDS liga a proteína, mas não de DNA e pode ser precipitado pela adição de KCl. Por conseguinte, DNA proteína ligada torna-se insolúvel enquanto desacoplado DNA permanece em solução. DPC-contendo DNA pode então ser quantificado utilizando timidina radiolabeled (se as células metabolicamente inicialmente foram rotuladas) ou por uma tintura fluorescente DNA-seletiva como Hoechst 33258. Esses métodos são reprodutíveis e exigem um pequeno número de etapas. No entanto, eles não fornecem informações sobre a natureza do crosslink química através da qual a proteína é anexada ao DNA. Além disso, é importante observar, estes ensaios podem superestimar DPC reparar marcando falsamente reparo incompleto, ou seja, proteolíticas processamento de ligações cruzadas de DNA-peptídeo menores que não podem ser facilmente preso ou precipitado, como autêntico DNA reparação.
Ensaios de cometa podem ser usados para visualizar a formação da DPC em células14. Nesses experimentos, a presença de DPCs diminuir a migração do DNA que então pode ser revertida por pretreating com proteinase K. Portanto, o comprimento da cauda pode ser usado para estimar a formação de DPC. No entanto, como mencionado acima, drogas formadoras de DPC criam outros tipos de danos no DNA que poderiam alterar o comprimento da cauda. Este protocolo também é altamente técnico e exige especialização e treinamento em imagiologia confocal.
Espectrometria de massa pode ser usada para estudar a cinética de reparação DPC após o tratamento com agentes de reticulação15,16,17. Estas experiências tratam células com DPC-formando agentes e isolar DPCs através de extração de biotina captura ou fenol: clorofórmio (1:1). Espectrometria de massa, em seguida, pode ser usada para identificar as proteínas de ligação cruzada ou dosar a quantidade de DPCs formado ao longo do tempo. A principal vantagem desta abordagem é a natureza dos dados produzidos. É possível precisamente catálogo dos tipos de proteínas que se tornam quitosana após a exposição a um xenobiótico, no entanto, este protocolo é caro, demorado e é limitada pelo tipo de referência cruzada que pode ser detectado.
Et al . Maizels desenvolveu um RADAR' sensível' (aproximação rápida de DNA aduto recuperação) ensaio para dosar immunodetection de ADN-proteína adutos bem como um ensaio de ELISA-baseado RADAR18,19. Estes ensaios são especialmente úteis para aprisionando intermediários de ADN-proteína que transitoriamente formam-se nas células e geram amostras adequadas para espectroscopia de massa identificar a nova proteína adutos. Este ensaio de immunodetection depende da disponibilidade de anticorpos para capturar o crosslink ADN-proteína e, portanto, pode não ser capaz de detectar DNA degradado-peptídeo adutos que se formam durante a reparação. Recentemente, um DPC específica reparação via ligada à replicação do DNA e um DNA-dependente metalloprotease Spartan foi descoberto quais DPCs são proteolyzed péptidos menores durante a reparação20,21. Mutações herdadas neste gene estão associadas com síndrome Ruijs-Aalfs em humanos, uma doença caracterizada pela instabilidade genômica, envelhecimento prematuro e câncer de fígado22. Ratos com o gene espartano geneticamente defeitos exibem semelhante fenótipos23.
Reativação de célula hospedeira de atividade transcricional tem sido usada para estudar a reparação de lesões definidas presentes no DNA de plasmídeo transfectadas substratos24,25. Nesses experimentos, o plasmídeo contendo DPCs (ou outros tipos de lesões do ADN) que bloqueiam a transcrição de um repórter, como a luciferase, são transfectadas em células. Medições de luminescência tomado 24-72 h depois então estão correlacionados com DPC reparar. No entanto, estes ensaios de reparação indirecta são incapazes de detectar eventos de reparo mais cedo do que de transfeccao pós 24h e não conseguem distinguir entre RNA polimerase bypass de substratos parcialmente reparados e reparo completo.
Cada um dos métodos descritos acima tem vantagens e tem contribuído para o atual modelo de reparação DPC. No entanto, o ensaio da SEPI-qPCR contorna várias das limitações associadas com estas outras abordagens e, consequentemente, pode fornecer insights mais específico sobre mecanismos de reparo do DPC. Por exemplo, o ensaio da SEPI-qPCR diretamente pode medir reparação de DPCs site-specific no DNA em células de mamíferos intactas. Este método é versátil e tem sido usado para obter resultados de reparação após transfecção em hamster e linhas de células humanas. Transfecção do plasmídeo pode ser executada usando lipofection ou eletroporação em linhas de células de mamíferos cultivadas. Ele também garante que a única reparação de DPCs definidos é medida, e não outros tipos de danos no DNA induzidos por maioria DPC-formação de agentes. A SEPI-qPCR é rápida, barata e fácil de executar. Os resultados obtidos neste ensaio detectaram reparação eventos tão cedo quanto do pós-transfection 2h. Usando esse método, variáveis que podem influenciar os resultados de reparação DPC podem ser estudadas de forma sensível e eficiente. Por exemplo, o papel da transcrição em reparação DPC ainda tem que ser rigorosamente avaliados. Devido à flexibilidade do ensaio SEPI-qPCR, o site de reticulação da DPC pode ser manipulado para abordar esta questão. Além disso, a introdução de uma origem de replicação para o plasmídeo DPC-rolamento pode ser usada para abordar a influência da replicação em reparação DPC. Além disso, várias ligações cruzadas podem ser criadas no plasmídeo para examinar diferenças na reparação de um único DPC contra várias ligações cruzadas. Estas são perguntas que seriam difícil de responder usando DNA cromossômico, mas podem ser facilmente resolvidas usando o ensaio de SEPI-qPCR. No geral, o ensaio da SEPI-qPCR requer purificado, DNA do plasmídeo em quantidades micrograma contendo uma lesão de um local conhecido. Adutos além de DPC pode ser usado neste ensaio, no entanto, a lesão deve ser capaz de bloquear a extensão pelo polymerase de Taq.
Protocol
1. geração de DPC-contendo plasmídeo
- Combine 80 pmol do oligonucleotide contendo um resíduo de 8-oxoguanine (20 µ l) com 10 unidades de quinase de polinucleotido T4 (1 µ l) em tampão de ligase 10 x (5 µ l). Adicione água para atingir um volume total de 50 µ l e incubar a 37 ° C por 30 min em um banho de água aquecida.
- Combinar do oligonucleotide fosforilado (50 μL), 80 pmol de ADN single-stranded (80 μL), polymerase de Taq 100 unidades (20 µ l) em 10 x Taq amortecedor da reação (25 µ l), ATP de 100mm (20 µ l), dNTPs 10 mM (20 µ l), NEB buffer 2 (25 µ l) e 8 µ g de BSA (20 µ l) de total de 260 µ l. Incubar a amostra em um thermocycler definido em 75 ° C por 15 min, seguido de 37 ° C por 5 min. Em seguida, Adicionar 60 U de T4 polimerase (20 µ l), 8.000 U T4 ligase (20 µ l), 100 mM ATP (20 µ l), dNTPs 10 mM (20 µ l), NEB buffer 2 (15 µ l) e 8 µ g de BSA (20 µ l) de total de 375 µ l. Incubar a reação durante a noite a 37 ° C (figura 1A).
- Crie uma mistura de fenol: clorofórmio saturado de buffer de 50: 50. Adicionar volumes iguais de cada componente, mistura e girar em uma mesa centrifugar 21.130 x g por 5 min. de água drives clorofórmio fenol saturado de reserva para formar duas camadas: uma camada superior, aquosa e uma parte inferior, a camada orgânica. Adicione 375 µ l da camada inferior, orgânica para a reação de extensão da primeira demão, mistura e girar em uma centrífuga de mesa no 21.130 x g por 5 min.
Cuidado: Fenol e clorofórmio são substâncias perigosas e devem ser tomadas precauções para evitar o contacto com a pele ou olhos.- Após centrifugação, cuidadosamente Extraia a camada superior e misture com acetato de amônio, adicionado a uma concentração final de 0,3 M, seguido de 2 volumes de etanol a 100%. Armazene a solução a-20 ° C por um período mínimo de 30 min ou durante a noite.
- Girar a amostra em uma centrífuga de mesa a 15.000 rpm x a 4 ° C por 10 min. Retire o sobrenadante e lavar o sedimento em 1 mL de etanol a 70%. Gire a amostra em uma centrífuga de mesa a 15.000 rpm x a 4 ° C por 5 min. Retire o sobrenadante e resuspenda o pellet em 100 µ l de água.
- Combine 50 µ l de DNA da etapa anterior com 16 µ l 6 x tintura gel de carregamento e 34 µ l água e sujeitos a eletroforese em agarose de baixo ponto de fusão um 0,8% do gel contendo brometo de etídio 0,5 µ g/mL. Funcione o gel em V/cm 2 em um gel de 10 cm para h 6 em 1 x TAE de buffer. Impostos especiais de consumo a banda supercoiled usando uma lâmina de barbear e pesar a fatia do gel (figura 1A). Execute um controle positivo para servir como um marcador para onde migra o DNA supercoiled, covalentemente fechado.
Atenção: O brometo de etídio é um agente mutagénico e devem ser tomadas precauções para evitar o contacto com a pele. Além disso, é importante minimizar o tempo que a amostra de plasmídeo é exposta aos raios UV para reduzir a formação de photoproducts de UV.- Digeri a fatia do gel, adicionando 10% β-agarase amortecedor da reação para cada mg de gel de peso. Incubar a 65 ° C durante 10 min e frio a 42 ° C. Adicionar 10 U de β-agarase e incubar a 42 ° C por 1h.
- Seguir incubação, medir o volume e adicionar o acetato de amônio a uma concentração final de 0,3 M e chill no gelo por 15 min. centrifugar a 15.000 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente, recolher o sobrenadante e adicionar 2 volumes de isopropanol. Relaxar a-20 ° C durante a noite.
- Centrifugue o DNA purificado, supercoiled por 10 min a 15.000 rpm de x em uma centrífuga de mesa a 4 ° C e resuspenda o pellet em 40 µ l de água.
- Crosslink 12 pmol (15 µ l) de DNA para 36 pmol de oxoguanine glycosylase (1 µ l) em tampão contendo 100 mM de NaCl (3 µ l), 1 mM MgCl2 (3 µ l), 20 mM Tris-HCl pH 7.0 (6 µ l) e 10 mM de sódio cyanoborohydride (2 µ l) para alcançar um volume final de 30 µ l a 37 ° C para 30 min26. Remover 1 µ l de amostra de quitosana e diluir em 500 µ l de água para servir como um h 0 dados apontam e analisar na PCR na etapa 3.
2. kCl/SDS precipitação
- Para visualizar a eficiência de reticulação, restrição digerir 1 µ g do plasmídeo de quitosana com 1 μL BspDI no buffer de x 10 a 37 ° C por 1 h gerar dois fragmentos de DNA diferentes de tamanho.
Nota: Um fragmento será ligado à proteína (4,4 kb) e o outro não vai (2,8 kB) (figura 1B).- Dividir as amostras em metade, adicionar SDS para ambos a uma concentração final de 0,5% e incubar a 65 ° C por 10 min.
- Adicionar o KCl (concentração final 100 mM) para uma das amostras e incubar no gelo por 5 min.
- Centrifugue a ambas as amostras a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C e executar os sobrenadantes em um gel de agarose para estimar a conjugação por cento de proteína-ADN12.
Nota: Precipitação de KCl/SDS é usada para controle de qualidade, não de preparadores.
3. transfection em células de mamíferos
- 1 dia antes de transfeccao, placa de 0,5 x 106 células/poço em uma placa de 6. No dia seguinte, misture 1,5 µ g (30 µ l) do plasmídeo contendo DPC (da etapa 1.6) com 300 µ l de soro livre de meios de cultura. Em outro tubo, misture 12 µ l de reagente de transfeccao e 300 µ l de soro livre de meios de cultura. Combinar a 300 µ l de DNA diluído com 300 µ l de reagente de transfeccao diluídos e incubar durante 5 min à temperatura ambiente. Adicionar 250 µ l dos complexos para cada um dos dois poços e incubar durante um período mínimo de 1 h a 37 ° C.
- Após incubação, remova a mídia, adicionar 1 mL de EDTA SDS/0,01 M de 0,6% e incubar a temperatura ambiente por 10-15 min. Raspe as células usando um policial de borracha e transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Adicionar 200 µ l de 5 M NaCl invertido de (concentração final de 1 M), gentilmente 5 vezes e incubar a 4 ° C durante a noite27.
- Centrifugar as amostras a 21.130 x g em uma centrífuga de mesa a 4 ° C por 30 min, recolher o sobrenadante, precipitado de etanol como descrito acima e Resuspenda em 50 µ l de água.
4. SEPI-qPCR
- Misture 1 µ l de DNA recuperado de cada ponto do tempo (incluindo 0 h), 2 x SYBR green mestre mistura PCR (30 µ l), 27 µ l de água e 1 µ l (100 pMol) de primer complementar para a vertente de dano do plasmídeo (Primer R, Figura 2). Realizar PCR usando as seguintes condições: inicial pré-derreter por 10 min a 90 ° C, seguido de 8 ciclos de: 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 min. Após a conclusão do ciclo 8 adicionar 1 µ l (100 pMol) do segundo primer ao total 60 µ l (L de Primer, Figura 2)28 (consulte Tabela de materiais para obter detalhes de reagente).
- Misturar 1 µ l de peças recuperou o DNA de cada ponto do tempo (incluindo 0 h), 2 x mestre mix (30 µ l), 27 µ l de água e 1 µ l de cada primer (100 pMol) ao total 60 µ l.
- Carregar um prato PCR de 96 poços com as amostras de etapas 4.1 e 4.2 (20 µ l/poço, em triplicado) e executar qPCR para 30 ciclos usando as condições acima descritas.
- Média os valores de CT de cada conjunto de amostras de três vias. Subtrai os valores de CT gerados na etapa 4.1 na etapa 4.2 para obter o valor de CT para cada amostra de delta. Subtrai a ponto de tempo de 0 h do valor de delta CT para remover qualquer fundo (ver Resultados de representante para uma descrição detalhada de seção).
- Converta o valor de CT delta em reparação por cento, usando a fórmula:
Representative Results
Para utilizar o SEPI-qPCR ensaio para avaliar a reparação celular do DPC, uma quantidade suficiente (montantes de µ g) de alta qualidade DPC reparação substrato deve estar preparada. Para obter este produto, um oligonucleotide contendo um resíduo de 8-oxoguanine foi recozido para complementar ADN single-stranded, primeira demão estendido e gel purificada para garantir que apenas covalentemente, produto circular fechado foi usado para transfections (Figura 1a). este relatório centra-se em substratos que retêm o borohidreto é usado para criar uma ligação covalente crosslink entre glycosylase oxoguanine humana recombinante e uma unidade de ribose em uma molécula double-stranded plasmídeo circular, embora análoga abordagens pode ser usado para obter quimicamente diversos substratos DPC. A estratégia de captura glycosylase/borohidreto de oxoguanine é especialmente atraente, dada a altíssima eficiência da reação de reticulação. Como mostrado na figura 1B, precipitação de KCl/SDS executada sobre um substrato DPC que tinha sido digerido em dois fragmentos seletivamente e quantitativamente quase esgotado o fragmento de DNA, abrigando a DPC. Estes resultados suportam a conclusão que essencialmente 100% das moléculas de substrato do plasmídeo contêm uma ligação cruzada de proteínas.
O ensaio da SEPI-qPCR descrito na seção de protocolo utiliza valores de CT gerados por qPCR para calcular a porcentagem de reparação DPC após transfecção em células de mamíferos. Como ilustra a Figura 2 , o crosslink proteína bloqueia a Taq polimerase de alargarem a cartilha de 'R' recozida para strand DPC-contendo. Uma segunda, crítica característica deste teste é a incorporação de oito rodadas de reações SEPI (usando o primer R) antes de realizar o ensaio de qPCR. Enquanto o DNA danificado (ou reparado) será estendido durante estas reações SEPI, criando um sítio de ligação para o primer 'L' a jusante, danificado ou o ADN (incompleta reparado) não será estendido. Por conseguinte, SEPI aumenta a abundância de cada vertente não danificado (ou reparado) por eight-fold. Isso significa que o reparado amostras em que foi realizada a etapa SEPI antes da qPCR exibirá um valor de CT que é menor do que os obtidos para uma amostra idêntica em que SEPI não foi realizada antes da qPCR (Figura 2) três unidades. A diferença de três-unidade no CT valores observados para os dois tratamentos, referidos como ΔCT, reflete o fato de que 2 = 83. Este valor de CT do delta pode ser usado para calcular a atividade de reparação de DNA celular usando a fórmula: reparo de ADN por cento = (2ΔCT /23) x 100. Controle de experiências confirmaram que um delta valor de CT de aproximadamente 3 foi consistentemente observada em plasmídeos de substrato não danificados foram sujeitos a SEPI-qPCR (dados não mostrados).
Tabela 1 mostra valores de exemplo CT que foram gerados de DPC-contendo substratos de plasmídeo que foram recuperados de fibroblastos pulmonares de hamster chinês 3 h e post-transfecção de h 8 (tabela 1A), bem como do tempo zero amostras, ou seja,, amostras que foram preparadas conforme descrito na seção de protocolo, mas não transfectadas em células (tabela1B). A tabela também fornece o ΔCT, e por cento reparar valores (calculado usando a fórmula 2ΔCT23 x 100) obtidos a partir destas amostras. Conforme ilustrado na tabela 1A, a reparação por cento calculada a partir de amostras colhidas 3 h e pós-transfecção 8 h foi 66% e 93%, respectivamente. Esses valores são subtraídos então daí resultantes da análise da amostra h 0 para determinar a porcentagem reparar. Tabela 1B retrata valores de CT para duas amostras diferentes h 0 em que reticulação eficiente foi ou não foi alcançada antes do transfection. Eficientemente amostra de quitosana resultou em um delta valor de CT de 0,8, Considerando que uma amostra mal quitosana resultou em um delta valor de CT de 2.5. Até à data, não foi possível determinar com precisão a origem do sinal no fundo 0,8 a amostra de 0 h eficientemente quitosana. É improvável que este fundo reflete um nível baixo de qualquer remoção de DPC espontânea, ou é devido a um baixo nível de Taq polimerase 'ignorar' síntese através da lesão DPC: experimentação extensiva realizada em substrato de M13 single-stranded altamente purificado consistentemente rendeu um delta valor de CT de aproximadamente 0,8, ou seja, essencialmente idêntico a este 'fundo' extensão de visto em substratos contendo DPC. Por conseguinte, é provável que haja um pequeno grau de mis escorva do primer 'R' durante a SEPI que resultados na geração de uma pequena quantidade de produto que posteriormente pode ser amplificado quando o primer 'L' é adicionado e qPCR executadas. Esforços para eliminar este fundo manipulando-se as condições PCR têm, até à data, não conseguiram corrigir este defeito. No entanto, a estratégia de subtração descrita acima permite a estimativa exacta da actividade de reparação DPC. Vale a pena notar essa reticulação ineficiente da proteína para o plasmídeo resultará em um valor de fundo elevado. Isso é retratado nos dados de exemplo fornecidos na tabela 1B onde reticulação de proteína-ADN ineficiente resultou em um delta maior valor de CT para tempo 0. Portanto, experimentos de controle são invariavelmente realizados antes de iniciar o transfections e substratos com valores de CT delta elevados acima a 0.8 nível limite são descartados. Como mencionado no protocolo qPCR, cada amostra é dividida em 3 poços para garantir a consistência de pipetagem. Estas réplicas são então média para obter o valor de CT para aquela amostra. Replica-se de que se afastam mais do que ± 0,1 são eliminados do conjunto de dados. Se todos os três repetições se desvie mais de ± 0.1 do outro, o ensaio da SEPI-qPCR é refeito até obtidos são consistentes. A experiência mostra que pelo menos 3 transfections independentes devem ser realizados para obter valores médios confiáveis que podem, em seguida, ser submetidos à análise estatística para determinar a influência de vários parâmetros na eficiência DPC reparação.
Figura 1. Geração de um plasmídeo contendo DPC. (A), do oligonucleotide contendo um resíduo de 8-oxo-guanina (vermelho) recozido para ADN single-stranded (círculo preto em negrito) e ampliado para criar o plasmídeo double-stranded (produto de extensão de cartilha indicado pela linha tracejada). Após eletroforese em brometo de etídio, a banda correspondente ao DNA supercoiled (caixa vermelha) é extirpada de um gel de agarose de baixo ponto de fusão e digerida com β-agarase. Pistas: (1) Peso Molecular marcador, (2) single-stranded DNA, DNA de cadeia dupla (3), amostra estendida (4) da primeira demão. (B) Oxoguanine glycosylase (abreviado hOGG1, retratado como um círculo laranja) é ligado ao resíduo 8-oxo-guanina através de cyanoborohydride de sódio e o resultante DPC substrato digerido para gerar um par de base 2.800, fragmento de DNA gratuito e um 4.400 fragmento de pares de base anexado à proteína. SDS é adicionado à amostra, que é então dividido em duas porções, uma das quais é tratada com KCl e centrifugada para sedimentos DPC-contendo DNA (retratado como um pellet de laranja). O sobrenadante deste último exemplo (retratado como fluido azul no tubo de centrífuga) e a amostra não expostos ao KCl estão sujeitos a electroforese do gel. Pistas: marcador (1) Peso Molecular, (2) -KCl, (3) + KCl. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: quantificação do plasmídeo danificado através de SEPI-qPCR. Plasmídeo é desnaturado e um primer complementar para a strand danificado (R) é recozido e estendido. Este processo é repetido para um total de 8 ciclos. Com uma carcaça danificada (topo), polymerase de Taq é bloqueado pela lesão DPC e não irá produzir fios de produto de comprimento total. Em contraste, com um substrato reparado (parte inferior), polymerase de Taq produzirá fios completos no produto que contém o sítio de ligação para primeira demão L. Após 8 ciclos, cartilha L é adicionada, e valores de limite do ciclo são determinados usando qPCR. Resultados de amplificação exemplo para substratos danificados e sem danos são ilustrados no lado direito com a linha vermelha que representa o DNA que submeteu-se a extensão da primeira demão antes da qPCR e azul que representa o DNA que não foi a primeira demão estendido antes da qPCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Quadro 1A | ||||
| Tempo | -Extensão primer | + Extensão primer | Δ CT | Porcentagem de reparação |
| (2ΔCT23x 100) | ||||
| 3 h | 23.5 | 21.1 | 2.4 | 66 |
| 8 h | 29,4 | 26,5 | 2.9 | 93 |
| Tabela 1B | ||||
| Tempo | -Extensão primer | + Extensão primer | Δ CT | Plano de fundo por cento |
| (2ΔCT23x 100) | ||||
| 0 h | 15,4 | 14,6 | 0.8 | 22 |
| 0 h | 15,4 | 12.9 | 2.5 | 71 |
Tabela 1: cálculo por cento reparar usando valores de CT gerados a partir de SEPI-qPCR. (A) reparação de um substrato contendo DPC transfectadas em fibroblastos de pulmão de hamster chinês V79 3 h e pós-transfecção 8 h. (B) SEPI-qPCR de 0 h amostras não transfectadas em células. Em uma amostra a eficiência da reação de reticulação entre DNA e oxoguanine glycosylase foi alta (esta amostra rendeu um valor baixo delta CT) enquanto na outra amostra a eficiência da proteína reticulação foi baixa (esta amostra rendeu um relativamente alto delta Valor do CT). Ver texto de Representante resultados para obter detalhes.
Discussion
O método SEPI-qPCR oferece inúmeras vantagens sobre outras abordagens examinando-se a reparação de uma população homogênea, contendo uma única lesão DPC definida. Vale ressaltar que além de controlar a identidade da proteína e o tipo de crosslink química usada para se conectar a proteína ao DNA, é possível manipular facilmente no contexto de sequência em que a lesão DPC é introduzida. Nós exploramos a influência na reparação do DPC de introdução a lesão em qualquer modelo ou codificação vertente de um plasmídeo a jusante de um locus promotor ativo. Da mesma forma, estamos no processo de investigar a influência na reparação do DPC de replicação usando um plasmídeo M13 que contém uma origem de replicação transfectada em células HEK293T do SV40. O ensaio aqui descritos, diretamente, reparação DPC medidas, ao contrário de outras estratégias como a reativação de célula do hospedeiro que indiretamente estimativas reparar atividade24,25. Além disso, o sistema é robusto, sensível e quantitativa. Ao contrário de outros sistemas, que medem a remoção da DPC, este ensaio só detecta eventos de reparo completo, ou seja, exige não só que a lesão DPC ser removidos, mas que a integridade do DNA duplex estar totalmente restaurada17. Isso ocorre porque sites básica e cortes ou quebras na espinha dorsal fosfodiéster bloqueiam o ensaio tão eficazmente como o original de lesão DPC29.
Enquanto este relatório se concentra em um determinado tipo de DPC, que foi criado por interceptação de boro-hidreto de uma reacção enzimática intermediária, estamos atualmente desenvolvendo abordagens para estudar o reparo de DPCs envolvendo outras proteínas e lesões em que a ligação de proteínas para o DNA ocorre através da base nucleosídeo, ao invés da posição de ribose. Usando aminação redutora, criamos ligações cruzadas de proteínas e peptídeos ligadas à guanina ou citosina base de um DNA primer30. Estes oligonucleotídeos foram purificados de homogeneidade e usados para gerar supercoiled plasmídeos contendo ligações cruzadas do DNA-proteínas e DNA-peptídeo. Enquanto a eficiência destas reações é um pouco reduzida em relação ao que da oxoguanine glycosylase crosslink abordagem descrita no detalhe acima, eles, no entanto, foram bem sucedidos e permitem a análise da reparação destes substratos em selvagem-tipo e linhas de reparação deficiente pilha mamífera nucleotídeo excisão. Também usamos o ensaio da SEPI-qPCR para estudar a reparação de lesões oxoguanine e um conjugado de ribose-colesterol sintético, que anteriormente foi mostrado para ser reparado através do nucleotídeo celular excisão reparação máquinas31. Conforme a Figura 2 mostra graficamente, reparação de qualquer lesão que extensão da primeira demão de blocos pelo polymerase de Taq pode, em princípio, ser medido usando o ensaio de SEPI-qPCR.
Modelos atuais de reparação DPC sugerem que maiores DPCs (> 10 kDa) estão sujeitos a processamento proteolítica menor lesão de peptídeo antes da remoção de32,33,34. Candidatos mais prováveis responsáveis por esta proteólise são a Proteassoma ou uma protease específica em células humanas, chamado Spartan20,21,35,36,37, 38. outras investigações sobre os papéis dessas proteases podem ser realizadas usando o ensaio de SEPI-qPCR. Inibidores do Proteassoma poderiam ser usados para o pré-tratamento de células antes de transfecção com substratos contendo DPC. Alternativamente, linhas celulares knockdown espartano poderiam transfected com plasmídeos danificados para elucidar seu papel na proteólise de DPCs maiores.
Independentemente do método usado para criar o crosslink ou da natureza da lesão do DNA, é salientar que a metodologia SEPI-qPCR depende criticamente a capacidade de gerar quantidades substanciais de substrato de DPC-plasmídeo homogênea. Passos essenciais para esta análise incluem purificação de covalentemente, plasmídeo circular fechado após a extensão da primeira demão para eliminar qualquer cortado ou moléculas lineares do plasmídeo. Estes contaminantes devem ser eliminados para garantir que qualquer reparação DPC subsequente observada não é devido a processos de reparação de ruptura-dirigido dirigido por nick ou dobro-costa. Falha ao obter quantidades suficientes de DNA supercoiled seguindo as reacções de extensão da primeira demão pode ser superada variando a razão do oligonucleotide para single-stranded DNA. Mais um importante passo para o método SEPI-qPCR, é a eficiência de reticulação da proteína para o plasmídeo. Neste estudo, utilizou-se uma reação enzimática, eficiente para crosslink a proteína de glycosylase de oxoguanine para uma lesão de 8-oxo-guanina. Reticulação sub ideal pode ser melhorada, variando a quantidade de proteína adicionada para a reação.
Enquanto os resultados descritos neste relatório baseou-se na lipofection para introduzir substratos de reparação DPC em células destinatários, não há nenhuma razão, a priori, outros métodos de transfections não podem ser empregados. Nós temos realizado estudos preliminares e observou que aquele electroporation39 também pode ser usado. No entanto, é interessante notar que em nossa experiência, eficiência de transfeccao eletroporação é reduzida em comparação com lipofection, e achamos necessário usar DNA portador (até 5 µ g) Além a 1,5 µ g de DPC substrato para obter dados de reparação. No geral, o método SEPI-qPCR descrito acima fornece uma forma inovadora de exclusivamente examinar reparação DPC no plasmídeo e gerar novos insights sobre a resposta de dano do ADN.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner é suportado pelo subsídio de formação 5T32HL007741. Agradecemos a Natalia Tretyakova (Universidade de Minnesota) e Ashis Basu (Universidade de Connecticut) e seus membros de laboratório para apoio e aconselhamento técnico durante o início e estágios intermediários deste trabalho.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
| Taq polymerase | NEB | M0267L | |
| ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
| dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| T4 polymerase | NEB | M0203L | |
| T4 ligase | NEB | M0202L | |
| β-agarase | NEB | M0392S | |
| Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
| Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
| Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
| BspD1 | NEB | R0557S | |
| NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
| StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |
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