Summary
Le but du présent protocole est de quantifier la réparation des définis ADN-protéine crosslinks sur l’ADN de plasmide. Les plasmides lésés sont transfectés dans des lignées cellulaires de mammifères bénéficiaires et de faible poids moléculaire récoltée à plusieurs temps points après transfection. Cinétique de réparation de l’ADN sont quantifiées par extension d’amorce de volet spécifique suivie de qPCR.
Abstract
Cette méthode vise à fournir une technique quantitative, rapide et flexible pour étudier la cinétique de réparation crosslink (DPC) ADN-protéine dans les lignées cellulaires de mammifères. Plutôt que globalement dosage enlèvement d’enlèvement de DPC chromosomique spontanée ou induite de xénobiotiques, cet essai examine la réparation d’une lésion homogène, de constitution chimique définie spécifiquement introduite au même endroit dans un substrat de l’ADN de plasmide. Ce qui est important, cette approche évite l’utilisation de matières radioactives et n’est pas tributaire de la technologie coûteuse ou très spécialisés. Au lieu de cela, elle s’appuie sur l’ADN recombinant standard et largement disponible polymérase en temps réel, quantitative PCR (qPCR) instrumentation. Contexte de la séquence du site d’attachement peut varier compte tenu de la souplesse inhérente de la stratégie utilisée, la taille de la protéine réticulé, ainsi que la nature de la liaison chimique et l’ADN précis pour régler les contributions respectives de ces réparent les paramètres à l’efficacité globale du DPC. En utilisant cette méthode, plasmides contenant une DPC in situ ont été transfectés dans des cellules et de faible poids moléculaire ADN récupérés à divers temps après transfection. L’ADN récupéré est alors soumis à extension d’amorce de brin spécifiques (PESS) en utilisant une amorce complémentaire au strand endommagé du plasmide. Depuis le DPC lésion blocs Taq DNA polymerase, le ratio d’ADN réparé à non réparé peut être quantitativement évalué à l’aide de qPCR. Valeurs de cycle seuil (CT) servent à calculer le % de réparation à divers moments dans les lignées cellulaires respectives. Cette méthode de PESS-qPCR permet également d’évaluer quantitativement la réparation cinétique de tout ADN adduit cette polymérase de Taq de blocs.
Introduction
Décrit ci-après est un test d’amplification PCR appelé PESS-qPCR. Le but de cette méthode est de quantifier la réparation DPC sur le plasmide QU'ADN transfecté dans la réparation des cellules de mammifères déficient et compétents. Ce test est rapide, extrêmement souple, quantitative et directement des mesures de rechange activité. Alors que ce rapport se concentre sur l’utilisation de cette méthodologie pour étudier la réparation de la DPC, les résultats présentés ci-dessous illustrent que la réparation de toute lésion qui bloque Taq polymérase peut être étudié à l’aide de cette méthodologie.
Le raisonnement derrière le développement de cette méthode est de mieux comprendre les mécanismes par lesquels les cellules de mammifères réparer DPC. Contrairement à d’autres types de dommages à l’ADN, DPC est massivement divers1,2. Des études ont démontré que des centaines de protéines cellulaires peuvent devenir réticulé à l’ADN et que pour chaque protéine il y a, en principe, nombreux acides aminés des chaînes latérales qui pourraient devenir de façon covalente à l’ADN cellulaire3. En outre, il y a plusieurs points de fixation chimique pour des protéines sur l’épine dorsale de l’ADN, y compris plusieurs postes sur les bases nucléotidiques, ainsi que sur le ribose sucre4,5. Cette diversité chimique soulève la possibilité que des voies biochimiques distinctes peuvent etre INVOQUEES pour réparer différents types de DPC. C’est avec cette préoccupation à l’esprit que la PESS-qPCR a été développé.
Plusieurs techniques ont été développés pour obtenir un aperçu de la biologie moléculaire de la réparation cellulaire de DPC. Ce qui suit donne un aperçu des principales approches qui ont été développés, avec un résumé des principales forces et faiblesses de chaque possession. Il est important de souligner que ce résumé se concentre sur des études de réparation DPC dans les systèmes de culture de cellules de mammifères, significative au modèle actuel de réparation DPC ont contribué à l’aide de systèmes microbiens et acellulaire qui ne sont pas abordés dans ce manuscrit.
Peut-être la stratégie plus facile qui peut être prise pour mieux comprendre la génétique de la réparation de la DPC est d’évaluer la sensibilité respectif à la mort cellulaire observée dans les cellules de type sauvage et les mutants exposés à des agents qui induisent la DPC6,7. Cette stratégie est relativement rapide, peu coûteuse et ne nécessite pas de compétences spécialisées au-delà de la capacité d’exécuter des techniques de culture cellulaire de base. Contrebalancer ces avantages est nombreuses limites de cette approche notamment ce qui suit. Tout d’abord, l’essai ne mesure pas directement la réparation de l’ADN. L’hypothèse de travail qui sous-tend cette stratégie est qu’inactiver les mutations dans les gènes codant les protéines de réparation d’ADN entraîne une accumulation d’ADN dommages que déclenche la mort cellulaire programmée. Cependant, mutations dans les gènes codant des protéines non-réparation de l’ADN pourraient, en principe, améliorer (ou réduire) la sensibilité cellulaire à la mort cellulaire induite par xénobiotiques. Deuxièmement, des agents qui créent des DPC invariablement induisent des autres types de dommages à l’ADN (une exception est la 5-aza-2'-deoxycytadine, mais cet agent est aussi épuisée méthyltransférase cellulaire niveaux8). Par conséquent, il est concevable qu’une hypersensibilité cellulaire accrue à l’agent en question peut-être refléter des défauts de réparation des liaisons interchaînes ou autres lésions. Troisièmement, comme mentionné ci-dessus, DPC représente une classe très hétérogène composée de différents types de liaisons chimiques, impliquant des partenaires protéiques différents. Il est possible que tandis que la réparation d’un ou plusieurs sous-types de ces lésions peut-être être modifiée dans un fond génétique particulier, cette différence peut ne pas suffire à modifier de manière significative une hypersensibilité cellulaire à la mort induite par cet agent. En résumé, alors que cette stratégie représente un point de départ attractif, les limitations décrites ci-dessus soulignent l’importance de la poursuite d’autres méthodes plus directes pour étudier la cinétique de la réparation de la DPC.
Un certain nombre d’approches connexes ont été développé pour atteindre cet objectif. Par exemple, les enquêteurs ont mis au point de méthodes pour distinguer entre l’ADN « libre » et « protein-bound » ADN9,10,11. En utilisant ces approches, il est possible de comparer les niveaux de l’état d’équilibre de DPC ou après une exposition à un agent productrices de DPC dans différents fonds génétiques. Les deux stratégies qui ont été plus largement utilisées impliquent sépare ADN contenant du DPC gratuit ADN à l’aide d’une stratégie de liaison de la membrane de nitrocellulose ou KCl/SDS précipitations12,13. Dans la première approche, les cellules sont lysées et traverse un filtre de nitrocellulose. Parce que la nitrocellulose lie protéines, le filtre retient ADN protéines liées, permettant d’ADN libre de passer à travers. Dans cette dernière stratégie ADN protéinique est séparé du ADN gratuit basé sur le fait que SDS se lie aux protéines, mais pas d’ADN et peut être précipité par l’addition de KCl. En conséquence, liée à la protéine ADN devient insoluble ADN indépendant reste en solution. DPC-contenant l’ADN peut alors être dosée à l’aide de thymidine radioactive (si les cellules sont marquées au départ métaboliquement) ou par un colorant fluorescent sélectif de l’ADN comme Hoechst 33258. Ces méthodes sont reproductibles et nécessitent un petit nombre d’étapes. Toutefois, ils ne fournissent pas d’informations quant à la nature de la réticulation chimique grâce auxquels la protéine est fixé à l’ADN. En outre, il est important de noter que ces tests peuvent surestimer DPC réparer en marquant faussement réparation incomplète, c'est-à-direprotéolytique traitement pour petits crosslinks ADN-peptide qui sera ne peut-être pas aussi facilement pris au piège ou précipités, comme véritable ADN réparation.
Tests de comète peuvent être utilisés pour visualiser la formation DPC en cellules14. Dans ces expériences, la présence de DPC diminuer la migration de l’ADN qui peut ensuite être inversée par un pré-traitement avec la protéinase K. Par conséquent, la longueur de la queue peut être utilisée pour estimer la formation DPC. Toutefois, comme mentionné ci-dessus, formant des DPC médicaments créer d’autres types de dommages à l’ADN qui pourrait modifier la longueur de la queue. Ce protocole est également très technique et requiert un savoir-faire et une formation en imagerie confocale.
Spectrométrie de masse peut être utilisée pour étudier la cinétique de réparation DPC après un traitement avec des agents de réticulation pour15,16,17. Ces expériences traitent des cellules avec des agents de formation de DPC et isoler DPC via biotine capture ou phénol : chloroforme (1:1) l’extraction. Spectrométrie de masse permet ensuite d’identifier les protéines réticulé ou de doser la quantité de DPC formé au fil du temps. L’avantage majeur de cette approche est la nature des données produites. Il est possible au catalogue de précisément les types de protéines qui deviennent réticulé après exposition à un xénobiotique, toutefois, ce protocole est coûteux, chronophages et est limitée par le type de croisement de fichiers qui peut être décelé.
Maizels et al mis au point un « RADAR » sensible (approche rapide de l’ADN adduit récupération) test pour doser l’immunodétection d’ADN-protéines adduits ainsi que d’un RADAR par ELISA Test18,19. Ces analyses sont particulièrement utiles pour les piéger intermédiaires de protéines et l’ADN transitoirement forment dans les cellules et génèrent des échantillons appropriés pour la spectroscopie de masse identifier de nouvelles protéines adduits. Ce dosage immunodétection repose sur la disponibilité des anticorps pour capturer la réticulation des protéines et l’ADN et, cependant, ne doit pas être capable de détecter l’ADN dégradé-peptide adduits qui se forment lors de la réparation. Récemment, une DPC spécifique réparation voie liée à la réplication de l’ADN et une métalloprotéase d’ADN-dépendante Spartan a été découvert dans lequel DPC sont protéolysée aux peptides plus petits au cours de la réparation de20,21. Héritée des mutations dans ce gène sont associées par Ruijs-Aalfs syndrome chez l’homme, une maladie caractérisée par l’instabilité génomique, vieillissement prématuré et le cancer du foie,22. Souris présentant des défauts de gène spartiate génétiquement affichent semblables phénotypes23.
Réactivation de la cellule-hôte de l’activité transcriptionnelle a été utilisée pour étudier la réparation des lésions déterminées présentes sur l’ADN de plasmide transfected substrats24,25. Dans ces expériences, le plasmide contenant le DPC (ou autres types de lésions de l’ADN) qui bloque la transcription d’un reporter, par exemple de la luciférase, sont transfectés dans des cellules. Réparent les mensurations de luminescence prises 24 à 72 heures plus tard sont ensuite corrélés avec la DPC. Toutefois, ces tests de réparation indirecte sont incapables de détecter les événements de réparation antérieures à la version transfection après 24h et ne peut pas distinguer entre le contournement de l’ARN polymérase de substrats partiellement réparés et de réparation complete.
Chacune des méthodes décrites ci-dessus a des avantages et a contribué à l’actuel modèle de réparation de la DPC. Cependant, le test de la PESS-qPCR contourne plusieurs des limitations associées à ces autres approches et par conséquent peut fournir la perspicacité plus spécifique dans les mécanismes de réparation DPC. Par exemple, le dosage de la PESS-qPCR peut mesurer directement réparation de DPC in situ sur l’ADN dans les cellules mammifères intactes. Cette méthode est souple et a été utilisée pour obtenir des résultats de réparation après transfection dans des lignées cellulaires humaines et hamster. Transfection du plasmide peut être effectuée à l’aide de lipofection ou électroporation dans les lignées cellulaires de mammifères cultivées. Il assure également que seule réparation de DPC défini est mesurée, et pas d’autres types de lésions de l’ADN induite par la plupart des agents de formation de DPC. La PESS-qPCR est facile à réaliser, peu coûteuse et rapide. Résultats obtenus à l’aide de ce test ont détecté des événements de réparation dès transfection après 2 h. En utilisant cette méthode, les variables qui peuvent influencer les résultats de réparation DPC peuvent être étudiées de manière sensible et efficace. Par exemple, le rôle de la transcription dans la réparation de la DPC doit encore être rigoureusement évaluées. En raison de la flexibilité de l’essai de la PESS-qPCR, le site de réticulation de la DPC peut être manipulé pour répondre à cette question. En outre, introduction d’une origine de réplication dans le plasmide portant des DPC peut être utilisée pour traiter l’influence de la réplication sur la réparation de la DPC. En outre, plusieurs liaisons transversales peuvent être créés sur le plasmide d’examiner les différences dans la réparation d’un DPC unique par rapport aux liaisons multiples. Voilà les questions auxquelles seraient difficile de répondre à l’aide de l’ADN chromosomique, mais peuvent facilement être adressées à l’aide de l’essai de la PESS-qPCR. Dans l’ensemble, le dosage de la PESS-qPCR nécessite purifié, l’ADN plasmidique en quantités microgramme contenant une lésion d’un emplacement connu. Adduits outre DPC peut être utilisé dans ce test, cependant, la lésion doit être capable de bloquer l’extension de la Taq polymérase.
Protocol
1. génération du plasmide contenant du DPC
- Mélanger 80 pmol d’oligonucléotides contenant un résidu de 8-oxoguanine (20 µL) avec 10 unités de T4 polynucléotide kinase (1 µL) dans un tampon de ligase 10 x (5 µL). Ajouter de l’eau pour atteindre un volume total de 50 µL et incuber à 37 ° C pendant 30 min dans un bain d’eau chaude.
- Combiner l’oligonucléotide phosphorylée (50 µL), 80 pmol d’ADN simple brin (80 μL), 100 unités Taq polymérase (20 µL) dans le tampon de 10 réaction de x Taq (25 µL), ATP de 100 mM (20 µL), 10 mM dNTPs (20 µL), NEB tampon 2 (25 µL) et 8 µg BSA (20 µL) pour un total de 260 µL. Incuber les échantillon dans un thermocycleur fixé à 75 ° C pendant 15 min, suivie de 37 ° C pendant 5 min. Ensuite, ajoutez 60 U de T4 polymérase (20 µL), 8 000 U T4 ligase (20 µL), 100 mM ATP (20 µL), 10 mM dNTPs (20 µL), NEB tampon 2 (15 µL) et 8 µg BSA (20 µL) pour un total de 375 µL. Incuber la réaction pendant une nuit à 37 ° C (Figure 1 a).
- Créer un mélange de phénol : chloroforme tampon saturée de 50/50. Ajouter des volumes égaux de chaque composant, mix et tournent dans une centrifugeuse de table-top à 21 130 x g pendant 5 min. chloroforme lecteurs l’eau hors du phénol tampon saturée pour former deux couches : une couche aqueuse supérieure et un en bas, la couche organique. Ajouter 375 µL de la couche inférieure, bio dans la réaction d’extension amorce, mix et tournent dans une centrifugeuse de table-top à 21 130 x g pendant 5 min.
ATTENTION : Phénol et le chloroforme sont des substances dangereuses et devraient prendre les précautions nécessaires pour éviter le contact avec la peau ou les yeux.- Après centrifugation, soigneusement extrait la couche supérieure et mélanger avec de l’acétate d’ammonium ajoutée à une concentration finale de 0,3 M suivie de 2 volumes d’éthanol à 100 %. Conserver la solution à-20 ° C pendant au moins 30 min ou toute la nuit.
- Faire tourner l’échantillon dans une centrifugeuse de table-top à 15 000 tr/min de x à 4 ° C pendant 10 min. Retirez le surnageant et laver le culot dans 1 mL d’éthanol à 70 %. Faire tourner l’échantillon dans une centrifugeuse de table-top à 15 000 tr/min de x à 4 ° C pour 5 min. Retirez le surnageant et Resuspendre le culot dans 100 µL d’eau.
- Mélanger 50 µL d’ADN de l’étape précédente avec 16 µL 6 x chargement gel colorant et 34 µL d’eau et soumis à l’électrophorèse sur un gel d’agarose de la bas point de fusion 0,8 % gel contenant du bromure d’éthidium 0,5 µg/mL. Exécutez le gel à 2 V/cm sur un gel de 10 cm pendant 6 h dans 1 x TAE tampon. La bande surenroulée en utilisant une lame de rasoir et peser la tranche de gel (Figure 1 a) de l’accise. Exécutez un contrôle positif pour servir de marqueur pour où le fermé de façon covalente, supercoiled l’ADN migre.
ATTENTION : Le bromure d’éthidium est un agent mutagène et précautions doivent être prises pour éviter le contact avec la peau. En outre, il est important de réduire au minimum le temps que l’échantillon de plasmide est exposé aux UV afin de réduire la formation des photoproduits UV.- Digérer la tranche de gel en ajoutant 10 % β-l’agarase tampon de réaction pour chaque mg de gel de poids. Incuber à 65 ° C pendant 10 minutes et laisser refroidir à 42 ° C. Ajouter 10 U de β-l’agarase et incuber à 42 ° C pendant 1 h.
- Après incubation, mesurer le volume et ajouter l’acétate d’ammonium à une concentration finale de 0,3 M et froid sur la glace pendant 15 min. Centrifuger à 15 000 x g pendant 15 min à température ambiante, recueillir le surnageant et ajouter 2 volumes d’isopropanol. Faites refroidir à-20 ° C durant la nuit.
- Centrifuger l’ADN purifié, surenroulé pendant 10 min à 15 000 tr/min de x dans une centrifugeuse de table-top à 4 ° C et Resuspendre le culot dans 40 µL d’eau.
- Crosslink 12 pmol (15 µL) de l’ADN à 36 pmol d’oxoguanine glycosylase (1 µL) dans un tampon contenant 100 mM NaCl (3 µL), 1 mM MgCl2 (3 µL), 20 mM Tris-HCl pH 7,0 (6 µL) et 10 mM cyanoborohydrure de sodium (2 µL) pour atteindre un volume final de 30 µL à 37 ° C pendant 30 min26. Retirer 1 µL de l’échantillon réticulé et diluer dans 500 µL d’eau pour servir un 0 h données point et d’analysent le PCR à l’étape 3.
2. kCl/SDS précipitations
- Afin de visualiser l’efficacité de la réticulation, restriction digérer 1 µg du plasmide réticulé avec 1 μL BspDI dans un tampon x 10 à 37 ° C pendant 1 h générer deux fragments d’ADN tailles différentes.
Remarque : Un fragment sera réticulé à la protéine (4,4 Ko) et l’autre pas (2,8 Ko) (Figure 1 b).- Diviser les échantillons dans la moitié, ajouter le SDS à la fois à une concentration finale de 0,5 % et incuber à 65 ° C pendant 10 min.
- Ajouter KCl (concentration finale 100 mM) à l’un des échantillons et incuber sur glace pendant 5 min.
- Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 5 min à 4 ° C et exécuter les surnageants sur gel d’agarose pour estimer la conjugaison pourcentage de protéines, d’ADN12.
NOTE : Précipitation de KCl/SDS est utilisée pour le contrôle de la qualité, pas des préparation de substrat.
3. la transfection dans les cellules de mammifères
- 1 jour avant la transfection, plaque de 0,5 x 106 cellules/puits dans une plaque 6 puits. Le lendemain, mélanger 1,5 µg (30 µL) du plasmide contenant du DPC (de l’étape 1.6) avec 300 µL de milieux de culture sans sérum. Dans un autre tube, mélanger 12 µL de réactif de transfection et 300 µL de milieux de culture sans sérum. Mélanger 300 µL d’ADN dilué avec 300 µL de réactif de transfection dilué et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ajouter 250 µL des complexes dans chacun des deux puits et incuber pendant au moins 1 h à 37 ° C.
- Après incubation, retirez les supports, ajouter 1 mL d’EDTA de 0,6 % de SDS/0,01 M et incuber à température ambiante pendant 10-15 min. gratter les cellules à l’aide d’une spatule en caoutchouc et transférer dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Ajouter 200 µL de 5 inverti (concentration finale de 1 M), de M NaCl 5 fois doucement et incuber à 4 ° C durant la nuit27.
- Centrifuger les échantillons à x 21 130 g dans une centrifugeuse de table-top à 4 ° C pendant 30 min, recueillir le surnageant, précipité de l’éthanol comme décrit ci-dessus et remettre en suspension dans 50 µL d’eau.
4. PESS-qPCR
- Mélanger ensemble 1 µL d’ADN récupéré de chaque point dans le temps (y compris 0 h), 2 x mélange maître SYBR green PCR (30 µL), 27 µL d’eau et 1 µL (100 pMol) d’amorce complémentaire à la mèche de dommages du plasmide (Primer R, Figure 2). Effectuer de PCR avec les conditions suivantes : Initial avant de fondre pendant 10 min à 90 ° C, suivie de 8 cycles de : 90 ° C, 15 s, 65 ° C, 1 min. À la fin du cycle 8 Ajouter 1 µL (100 pMol) du deuxième primaire pour un total de 60 µL (Primer L, Figure 2)28 (voir Table des matières pour plus de détails de réactif).
- Mélanger 1 µL de non amplifiée ADN extraite de chaque point dans le temps (y compris 0 h), 2 x mélange principal (30 µL), 27 µL d’eau et 1 µL de chaque amorce (100 pMol) pour un total de 60 µL.
- Charger une plaque 96 puits PCR avec les exemples de mesures 4.1 et 4.2 (20 µL/puits, en triple exemplaire) et effectuer de qPCR pour 30 cycles en utilisant les conditions décrites ci-dessus.
- Moyenne des valeurs de CT de chaque série d’échantillons en triple. Soustraire les valeurs de CT générés à l’étape 4.1 de celles à l’étape 4.2 pour obtenir le delta de la valeur de l’EC pour chaque échantillon. Soustraire le point 0 h le temps de la valeur de delta CT pour supprimer n’importe quel fond (voir Résultats représentant l’article pour une description détaillée).
- Convertir la valeur CT de delta en pourcentage réparation à l’aide de la formule :
Representative Results
Afin d’utiliser le test de la PESS-qPCR afin d’évaluer la réparation cellulaire de DPC, une quantité suffisante (montants µg) de haute qualité DPC réparation substrat doit être préparée. Pour obtenir ce produit, un oligonucléotide contenant un résidu de 8-oxoguanine a été recuits pour complémentaire ADN monocaténaire, apprêt étendu et gel purifié pour que seulement par liaison covalente, produit circulaire fermé a été utilisée pour transfections (Figure 1 a). ce rapport se concentre sur des substrats dans lequel le borohydrure de piégeage est utilisé pour créer un croisement de fichiers covalente entre glycosylase recombinante humaine oxoguanine et une unité de ribose sur une molécule bicaténaire plasmide circulaire, quoique analogue des approches peut être utilisé pour obtenir chimiquement divers substrats DPC. La stratégie de piégeage glycosylase/borohydrure d’oxoguanine est particulièrement attractive étant donné la très grande efficacité de la réaction de réticulation. Comme illustré à la Figure 1 b, précipitations de KCl/SDS jouée sur un substrat DPC qui avait été digéré en deux fragments de manière sélective et presque quantitativement appauvri le fragment d’ADN contenant le DPC. Ces résultats appuient la conclusion qu’essentiellement 100 % des molécules de substrat plasmide contiennent une protéine crosslink.
Le dosage de la PESS-qPCR décrit dans la section protocole utilise valeurs CT générées par qPCR pour calculer le pourcentage de réparation DPC après transfection des cellules mammaliennes. Comme l’illustre la Figure 2 , la réticulation de protéine bloque la Taq polymérase de l’extension de l’amorce de « R » recuit au strand contenant du DPC. Une deuxième caractéristique critique de ce test est l’incorporation de huit cycles de réactions pess (à l’aide de l’apprêt R) avant d’effectuer le test de qPCR. Alors que l’ADN intact (ou réparé) sera prolongé au cours de ces réactions de la PESS, création d’un site de liaison pour l’amorce de « L » aval, ADN endommagé (ou incomplètement réparée ADN) ne sera pas prolongée. Par conséquent, PESS augmente l’abondance de chaque brin intact (ou réparé) par multiplié par huit. Cela signifie que réparé échantillons dans lequel l’étape de la PESS a été effectuée avant qPCR affichera une valeur de CT qui est inférieure à celle obtenue pour un échantillon identique dans lequel PESS n’a été effectuée avant qPCR (Figure 2) trois unités. La différence de trois unités de valeurs CT observée pour les deux traitements, dénommés ΔCT, tient au fait que 8 = 23. Ce delta valeur de CT peut être utilisé pour calculer la réparation de l’ADN cellulaire activité en utilisant la formule : réparation de l’ADN pourcentage = (2ΔCT /23) x 100. Expériences de contrôle a confirmé qu’un delta valeur CT d’environ 3 a été constamment observé lorsque les plasmides de substrat intacts sont soumises à la PESS-qPCR (données non présentées).
Tableau 1 illustre exemple CT les valeurs qui ont été générés à partir de substrats de plasmide contenant du DPC qui ont été récupérés de fibroblastes de poumon de hamster chinois 3 de h et de 8 h après transfection (tableau 1), ainsi que du temps zéro échantillons, c'est-à-dire, des échantillons qui ont été préparés comme décrit dans la section protocole, mais pas transfectés dans des cellules (tableau1 b). Le tableau indique également la ΔCT et valeurs de rechange pour cent (calculé selon la formule 2ΔCT23 x 100) obtenu à partir de ces échantillons. Comme illustré dans le tableau 1 a, la réparation de pourcentage calculée à partir des échantillons récoltés 3 h et transfection après 8 h était de 66 % et 93 %, respectivement. Ces valeurs sont ensuite soustraits de celle résultant de l’analyse de l’échantillon de 0 h à déterminer le pourcentage de réparation. Tableau 1 b représente des valeurs CT pour deux échantillons différents de 0 h dans lequel réticulation efficace était ou n’était pas atteint avant la transfection. Efficacement, réticulé échantillon conduit à un delta valeur CT de 0,8, alors qu’un échantillon faiblement réticulé a donné lieu à un delta valeur CT de 2,5. A ce jour, il n’a pas été possible de déterminer précisément la source du signal fond 0,8 dans l’efficacement réticulé échantillon de 0 h. Il est peu probable que ce contexte reflète un faible niveau de soit enlèvement de DPC spontanée, ou est due à un niveau faible de Taq polymérase « bypass » synthèse par la lésion de la DPC : vaste expérimentation effectuée sur substrat de M13 monocaténaire hautement purifiée constamment a donné un delta valeur CT d’environ 0,8, c'est-à-direessentiellement identique à cela « arrière-plan » extension vue dans des substrats contenant du DPC. Par conséquent, il est probable qu’il y a un faible degré de mauvaise l’amorçage de l’abécédaire « R » au cours de la PESS qui entraîne la génération d’une petite quantité de produit qui peut ensuite être amplifiée lorsque l’amorce de « L » est ajouté et qPCR effectuent. Ses efforts pour éliminer ce contexte en manipulant les conditions de la PCR ont, jusqu'à présent, n’a pas pu remédier à ce défaut. Toutefois, la stratégie de soustraction décrite ci-dessus permet une estimation précise de l’activité de réparation DPC. Il convient de noter cette réticulation inefficace de la protéine sur le plasmide se traduira par une valeur élevée de fond. Ceci est représenté dans l’exemple de données fourni l' tableau 1 b où réticulation ADN-protéine inefficace a entraîné un delta plu valeur de CT pour temps 0. Par conséquent, expériences de contrôle sont invariablement exécutés avant l’ouverture de transfections et substrats avec des valeurs de CT de delta élevés au-dessus de la 0,8 seuil sont ignorées. Comme mentionné dans le protocole de qPCR, chaque échantillon est divisé en 3 puits pour assurer l’uniformité de pipetage. Ces répétitions sont ensuite la moyenne pour obtenir la valeur de CT pour cet échantillon. Réplique que s’écarter de plus de ± 0,1 sont éliminées de l’ensemble de données. Si tous les trois répétitions s’écartent de plus de ± 0,1 les uns des autres, le dosage de la PESS-qPCR est refait jusqu'à obtient des valeurs cohérentes. L’expérience montre qu’au moins 3 transfections indépendantes doivent être effectuées afin d’obtenir des valeurs moyennes fiables qui peuvent alors être soumis à l’analyse statistique pour déterminer l’influence de divers paramètres sur l’efficacité de réparation DPC.
Figure 1. Génération d’un plasmide contenant du DPC. (A) un oligonucléotide contenant un résidu de la 8-oxo-guanine (rouge) est recuit à l’ADN simple brin (cercle noir "BOLD") et étendu pour créer le plasmide bicaténaire (produit d’extension amorce indiqué par la ligne pointillée). Après électrophorèse en bromure d’éthidium, la bande correspondant à l’ADN surenroulé (boîte rouge) est excisée d’un gel d’agarose de la bas point de fusion et digérée avec β-l’agarase. Voies : (1) poids moléculaire marqueur, ADN simple brin (2), ADN à double brin (3), (4) amorce étendu échantillon. (B) Oxoguanine glycosylase (abrégé hOGG1, dépeint comme un cercle orange) est réticulé à la 8-oxo-guanine de résidus par le cyanoborohydrure de sodium et la résultante DPC substrat digéré pour générer un 2 800 paires de bases, fragment d’ADN libre et un 4 400 fragment de paires de bases attachée à la protéine. SDS est ajouté à l’échantillon qui est alors divisé en deux parties, dont un est traité avec KCl et centrifugé à des sédiments contenant du DPC ADN (dépeint comme une pastille orange). Le surnageant de cet échantillon de ce dernier (représentée en bleu liquide dans le tube à centrifuger) et l’échantillon non exposés au KCl sont soumis à l’électrophorèse sur gel. Voies : marqueur (1) poids moléculaire, (2) -KCl, (3) + KCl. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Quantification du plasmide endommagé par l’intermédiaire de PESS-qPCR. L’ADN de plasmide est dénaturée et une amorce complémentaire au strand endommagé (R) est recuite et étendue. Ce processus est répété pour un total de 8 cycles. Avec un substrat endommagé (en haut), la Taq polymérase est bloquée par la lésion DPC et ne produira pas de brins de produit de pleine longueur. En revanche, avec un substrat réparé (en bas), Taq polymérase va produire des produits longs brins contenant le site de liaison pour apprêt L. Après 8 cycles, apprêt L est ajouté et cycle seuil valeurs sont déterminées à l’aide de qPCR. Exemple amplification résultats pour substrats endommagés et en bon état sont illustrés sur la droite avec la ligne rouge qui représente l’ADN qui a subi une extension d’amorce avant qPCR et bleu représentant l’ADN qui n’était pas primer étendu avant qPCR. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Tableau 1 a | ||||
| Temps | -Extension d’amorce | + Extension d’amorce | Δ CT | Pourcentage de réparation |
| (2ΔCT23x 100) | ||||
| 3 h | 23,5 | 21.1 | 2.4 | 66 |
| 8 h | 29,4 | 26,5 | 2.9 | 93 |
| Tableau 1 b | ||||
| Temps | -Extension d’amorce | + Extension d’amorce | Δ CT | Fond pour cent |
| (2ΔCT23x 100) | ||||
| 0 h | 15.4 | 14,6 | 0,8 | 22 |
| 0 h | 15.4 | 12,9 | 2.5 | 71 |
Tableau 1 : calcul de p réparation à l’aide de valeurs de CT de PESS-qPCR. (A) réparation d’un substrat contenant du DPC transfectées dans les fibroblastes de poumon de hamster chinois V79 3 de h et de 8 h après transfection. PESS-qPCR (B) des échantillons de 0 h non transfectés dans des cellules. Dans un échantillon de l’efficacité de la réaction de réticulation entre l’ADN et oxoguanine glycosylase est haute (cet exemple a donné une valeur faible delta CT) tandis que dans l’autre échantillon, l’efficacité de la réticulation des protéines est faible (cet exemple a donné un delta relativement élevé Valeur de CT). Voir le texte de Résultats représentant pour plus de détails.
Discussion
La méthode de PESS-qPCR offre de nombreux avantages par rapport aux autres approches en examinant la réparation d’une population homogène contenant une seule lésion DPC définie. Il convient de noter que, outre le contrôle de l’identité de la protéine et le type de réticulation chimique utilisé pour connecter la protéine à l’ADN, il est possible de facilement manipuler le contexte de la séquence dans laquelle la lésion de la DPC est introduite. Nous avons étudié l’influence sur la réparation de la DPC d’introduction la lésion soit sur le modèle ou brin d’un plasmide en aval d’un locus promoteur actif de codage. De même, nous sommes en train d’étudier l’influence sur la réparation de la DPC de réplication à l’aide d’un plasmide de M13 contenant une origine de SV40 de réplication transfectée dans des cellules HEK293T. Le test décrit ci-après directement réparation DPC de mesures, par opposition à d’autres stratégies telles que la réactivation de cellule hôte qu’indirectement les estimations réparer activité24,25. En outre, le système est robuste, sensible et quantitative. Contrairement aux autres systèmes, qui mesurent la suppression de la DPC, ce test détecte uniquement les événements de réparation complète, c'est-à-dire, il faut non seulement supprimer la lésion de la DPC mais que l’intégrité de l’ADN duplex entièrement restauré17. C’est parce que les sites duprojet et des entailles ou des pauses dans le squelette phosphodiester bloquent le dosage aussi efficacement que l’origine de lésion DPC29.
Alors que ce rapport se concentre sur un type particulier de DPC, qui a été créé par le borohydrure piégeage d’une réaction enzymatique intermédiaire, nous développons actuellement des approches pour étudier la réparation de DPC impliquant d’autres protéines et lésions dans lequel la liaison de protéines à l’ADN se produit par le biais de la base de nucléoside, plutôt que la position du ribose. À l’aide d’amination réductrice, nous avons créé des protéines et peptides crosslinks attaché à cytosine ou guanine base d’un ADN amorces30. Ces oligonucléotides ont été purifiés jusqu'à homogénéité et utilisés pour générer des plasmides surenroulés contenant des protéines et l’ADN et ADN-peptide crosslinks. Alors que l’efficacité de ces réactions est quelque peu réduite par rapport à celle de l’approche de crosslink glycosylase oxoguanine décrit en détail ci-dessus, ils ont néanmoins réussis et permettent l’examen de la réparation de ces substrats dans le sauvage et lignes de nucléotide excision déficients en réparation des cellules de mammifères. Nous avons aussi utilisé le test de la PESS-qPCR pour étudier la réparation des lésions oxoguanine et un conjugué de ribose-cholestérol synthétique, qui a déjà été démontré pour être réparé par les nucléotides cellulaires excision réparation machines31. Comme l’illustre la Figure 2 , réparation de toute lésion qu’extension d’amorce de blocs par la Taq polymérase peut, en principe, être mesurée à l’aide de l’essai de la PESS-qPCR.
Les modèles actuels de réparation DPC suggèrent que plus grand DPC (> 10 kDa) sont soumis à traitement protéolytique de petite lésion peptide avant enlèvement32,33,34. Candidats les plus probables responsables de cette protéolyse sont le protéasome ou une protéase spécifique dans les cellules humaines nommé Spartan20,21,35,36,37, 38. autres enquêtes portant sur les rôles de ces protéases peut être effectuée en utilisant le test de la PESS-qPCR. Inhibiteurs du protéasome pourraient servir à Prétraiter les cellules avant la transfection avec des substrats contenant du DPC. Alternativement, lignées cellulaires knockdown spartiate pourraient être transfectées avec plasmides endommagés à élucider son rôle dans la protéolyse de la plus grande DPC.
Quelle que soit la méthode utilisée pour créer la réticulation ou de la nature de la lésion de l’ADN, il est important de souligner que la méthodologie de la PESS-qPCR est critique dépend de la capacité de générer des quantités substantielles de substrat DPC-plasmide homogène. Étapes essentielles pour cette analyse comprennent la purification de façon covalente, plasmide circulaire fermé suite à extension d’amorce pour éliminer toute entaillé ou molécules linéaires de plasmide. Ces contaminants doivent être éliminés afin d’assurer que toute réparation ultérieure de DPC observée n’est pas en raison de processus de réparation de rupture dirigée nick-réalisé ou double brin. Défaut d’obtenir une quantité suffisante d’ADN surenroulé suite à des réactions primer extension peut-être être surmontée en faisant varier le rapport des oligonucléotides d’ADN simple brin. Une autre étape importante pour la méthode de la PESS-qPCR, est l’efficacité de la réticulation des protéines pour le plasmide. Dans cette étude, une réaction enzymatique efficace a été utilisée pour relier l’oxoguanine glycosylase protéine à une lésion de la 8-oxo-guanine. Réticulation secondaire optimale peut être améliorée en faisant varier la quantité de protéines ajoutées à la réaction.
Bien que les résultats décrits dans le présent rapport s’est appuyé sur lipofection d’y introduire des substrats de réparation DPC de cellules réceptrices, il n’y a aucune raison, a priori, autres méthodes transfections ne peuvent être employés. Nous avons effectué des études préliminaires et a fait observer que d’électroporation39 peut également être utilisé. Toutefois, il est intéressant de noter que dans notre expérience, efficacité de transfection électroporation est réduite par rapport à lipofection et nous avons jugé nécessaire d’utiliser l’ADN de transporteur (jusqu'à 5 µg) Outre les 1,5 µg de DPC substrat pour obtenir réparation des données. Globalement, la méthode de la PESS-qPCR décrite ci-dessus fournit un moyen novateur d’examiner réparation DPC sur l’ADN de plasmide exclusivement et de générer de nouvelles idées sur la réponse aux dommages de l’ADN.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été financé par le National Institutes of Health (ES023350). Lisa Chesner est pris en charge par la subvention de formation 5T32HL007741. Nous remercions Natalia Tretyakova (Université du Minnesota) et Ashis Basu (Université du Connecticut) et leurs membres de laboratoire pour l’appui et des conseils techniques au début et les étapes intermédiaires de ce travail.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-oxoguanine modified oligo | Midland Certified Reagent Company | NA | Sequence: 5’AGGGTTTTCCA (8-oxo-dG)TCACGACGTT 3’ |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Single-stranded M13 | NEB | N4040S | |
| Taq polymerase | NEB | M0267L | |
| ATP, 100mM | Thermo Scientific | R0441 | |
| dNTP Mix, 10mM each | Thermo Scientific | R0192 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| T4 polymerase | NEB | M0203L | |
| T4 ligase | NEB | M0202L | |
| β-agarase | NEB | M0392S | |
| Oxoguanine glycosylase 1 | NEB | M0241S | |
| SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4309155 | green PCR master mix |
| Primer R | UMN Genomic Center | NA | 5’CGGCTCGTATGTTGTGTG 3’ |
| Primer L | UMN Genomic Center | NA | 5’ GCTGCAAGGCGATTAAGT 3’ |
| Lipofectamine Reagent | Invitrogen | 18324-012 | transfection reagent |
| BspD1 | NEB | R0557S | |
| NEB buffer 2 | NEB | B7002S | |
| StepOnePlus Real Time PCR System | Applied Biosystems | 4376600 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| Chloroform, reagent ACS, spectro grade | ACROS | 40463-5000 |
References
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