Summary
我们描述了一种高通量的测量睡眠的方法, 以活动为基础的家庭网箱监测。这种方法比传统的基于脑电图的方法具有优势。它在确定总睡眠持续时间方面得到了很好的验证, 可以成为监测人类疾病模型中睡眠的有力工具。
Abstract
传统上, 睡眠是由脑电图 (EEG) 监控的。啮齿类动物的脑电图研究需要手术后电极的植入, 然后是长时间的恢复期。为了执行脑电图记录, 动物被连接到一个接收器, 形成一个不自然的拴在头上安装。脑电图监测是耗时的, 对动物携带风险, 并不是一个完全自然的测量睡眠的设置。其他的方法来检测睡眠, 特别是在高通量的方式, 将极大地推动睡眠研究领域。在这里, 我们描述了一种通过基于活动的家庭网箱监测来检测睡眠的验证方法。以往的研究表明, 通过这种方法评估的睡眠与传统的基于脑电图的措施所定义的睡眠有很大程度的一致。虽然这种方法是对总睡眠时间的验证, 重要的是要注意, 睡眠周期应该由一个有更好的时间分辨率的脑电图评估。脑电图还可以区分快速眼球运动 (rem) 和非 REM 睡眠, 更详细地说明睡眠的确切性质。然而, 基于活动的睡眠确定可以用来分析多天未受干扰的睡眠, 并评估睡眠作为对急性事件 (如压力) 的反应。在这里, 我们展示了这个系统的力量, 以检测小鼠对日常腹腔注射的反应。
Introduction
睡眠有重要的功能, 恢复身体和大脑后的每日负担的觉醒1。已经表明睡眠在记忆保留和一般大脑可塑性方面起着作用1。EEG 是检测睡眠2的黄金标准。在啮齿目动物, 脑电图监测需要手术植入的电极贴在头部安装, 之后, 动物需要一段时间来恢复2。恢复后, 该动物附着在录音设备上, 并给予另一段适应期2。由于这些必要的恢复和适应的时期, EEG 是费时费力的, 不能合理地执行大规模。此外, 电极植入的手术过程对动物有内在的危险。最后, 对脑电研究中评分睡眠的数据分析也非常费力。一种替代的、非侵入性的、高通量的睡眠监测方法将极大地帮助啮齿动物睡眠研究。
一种基于活动的家庭网箱监测系统用于检测睡眠, 解决了脑电图研究的局限性。简单的前提是不活泼的动物很可能是沉睡的动物。它已经表明, 四十年代连续不活动 (作废在十年代世纪) 是一个可靠的测量睡眠以脑电图测量 (显示有88-94% 协议)3。家庭网箱监测系统可用于研究大群动物, 设置时间最少。我们已经表明, 动物需要大约一天的时间习惯到家庭笼监控系统中的单个外壳, 与脑电图研究2所需的几周的恢复相比,4 。此外, 一些设置还可以检测的生理参数, 如核心体温, 心率, 活动, 和喂养。温度和心率是由一个小发射机的植入决定的。这些参数可以提供有关鼠标的更多信息, 并可与睡眠记录并行使用, 进一步增加我们对睡眠的理解以及它是如何受到影响的。
虽然它是一个强大的工具, 但对于可以从基于活动的家庭笼监视中获取的数据类型有一些限制。脑电图研究可以区分 rem 和非 rem 睡眠, 这可能是一个重要的深入了解睡眠结构。基于活动的家庭网箱监测系统只能提供用于总睡眠时间的数据。此外, 尽管基于活动的家庭网箱监测的输出提供了有关睡眠时间的信息, 但由于四十年代间隔的固有限制, 我们无法准确评估时间长短, 因为3。尽管有这些限制, 家庭网箱监测睡眠持续时间提供了一个重要的生物措施, 可能会影响许多下游因素, 包括动物的健康和行为5。
基于活动的家庭网箱监测已被用来检测睡眠在许多研究表明其通用性。我们引用了这些研究的示例4,6,7,8,9,10,11,12。除了所介绍的方法外, 还有其他方法可以通过基于活动的监视来检测睡眠, 每个测试都包含自己的限制13,14。其中一些研究检查长时间的不间断睡眠 (72 小时), 而一些检查睡眠在块24小时。在这项研究中, 我们提出了每24小时的睡眠分析后, 对每日腹腔 (IP) 注射和周期性笼改变的小鼠模型的脆弱 X 综合征 (Fmr1高鼠)。我们选择了Fmr1高鼠, 因为它们减少了睡眠4 , 并且被假定为对感官信息15的超反应。我们的数据突出了在应对紧张事件时检测睡眠模式变化的能力。该方法适用于获取大鼠群中睡眠的一般信息。该方法有助于了解特定基因改变对睡眠的影响, 药理治疗的效果, 或对事件的反应, 如压力源。此外, 该方法提供了一个简单的方法来筛选的反应之前, 开始更多的参与研究。
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Protocol
所有程序均经国家心理健康动物护理和使用委员会批准, 并按照国家卫生研究所关于动物的照料和使用指导方针进行。
1. 设置睡眠检测单元
- 购买所需的单位和软件数量。
- 按照说明设置监控系统。
- 对准发射器对面的探测器。确保红外光束朝内, 并在同一高度上对齐。
- 使用所提供的螺钉将探测器和发射器放置在金属支架所需的高度上。这种高度应调整, 使笼的床上用品低于红外光束的水平, 但光束是在适当的高度, 以检测动物的活动。这将创建一个27厘米 x 32 厘米的内部区域 (10.625 x 12.75 英寸)。
- 如果需要更多的螺丝, 购买更多的硬件商店 (6-32 ¼在潘头螺钉)。
- 将每个探测器与每个发射器连接起来。将发射器连接到与接收器相连的所提供的中枢。对 x 和 y 平面都执行此操作。对所有设置重复此步骤。
- 使用提供的 USB 集线器将接收器连接到计算机。
2. 软件设置
- 安装分析软件并选择提供的硬件配置文件作为默认值。硬件配置文件只应由公司更改。
- 单击文件 |打开实验配置。打开默认的实验配置。
- 单击实验 |属性。
- 单击扫描选项卡. 将扫描速率更改为十年代。
- 单击活动选项卡. 将活动采样率更改为十年代。
- 单击文件 |将实验保存为以保存这些配置设置以便将来进行实验。
3. 动物设置
- 单独安置老鼠在干净的笼子里是 31 cm (12.25 英寸) 长和 16.5 cm (6.5 英寸) 宽。为了防止老鼠建立床上用品和阻碍梁, 使用床上用品在深度3毫米。不要为老鼠提供额外的筑巢材料。
- 为老鼠提供食物和水的途径ad 随意通过一个电线馈线, 在笼子的顶部, 从梁的方式。如有必要, 在整个研究期间, 每3-5 天更换一只笼子, 将食物重新灌装并更换水瓶。
- 将鼠标笼对准红外光束设置, 确保其位于光束的中间, 以充分覆盖。
- 确保房间的光暗循环被设置为反射小鼠正常居住条件的光暗循环, 或者根据实验的需要进行改变。
4. 药物制剂和注射剂
- 获得无菌水和无菌环糊精。
- 对于所有注射, 使用1毫升注射器与 25.5-30.5 克皮下注射针。每只老鼠都应该使用一种新的无菌针头和注射器。
- 为了缩短注射时间, 请提前组装所有注射器。
- 用于环糊精注射: 将3克环糊精添加到10毫升水中, 制备环糊精溶液, 制作30% 环糊精溶液。
- 通过 IP 注射管理0.3 毫升的生理盐水或环糊精。
5. 记录睡眠的软件
- 打开默认硬件配置文件。
- 单击文件 |打开实验配置。打开所需的或默认的实验配置。
- 单击实验 |安装程序。
- 指定保存数据文件的位置以及保存备份文件的位置。该软件要求数据文件存储在特定程序文件夹下的程序文件中。
注意: 由于某些计算机将程序文件视为敏感的, 因此在实验之后可能无法访问数据文件。因此, 建议将备份文件保存到本地计算机上的另一个不敏感区域。 - 指定动物 ID 到每个睡眠室并且输入动物的重量, 如果需要。如果实验中没有使用腔室, 则取消选中该框将停用该腔。输入标识信息后, 单击完成。
- 指定保存数据文件的位置以及保存备份文件的位置。该软件要求数据文件存储在特定程序文件夹下的程序文件中。
- 单击文件 |将实验保存为以将当前的实验配置保存在所需的文件名下。
- 单击实验 |运行或F5启动录制。等待一个十年代的时代, 以确保所有的房间都在回升活动。当动物被注射的时候, 很有可能这些动物会移动到足以被红外光束探测到。
- 如果未检测到任何活动, 请尝试手动移动鼠标笼, 以确保光束拾取移动。如果仍未记录活动, 则继续故障排除或移至工作室。
注: 在注射完成后, 立即运行实验。
- 如果未检测到任何活动, 请尝试手动移动鼠标笼, 以确保光束拾取移动。如果仍未记录活动, 则继续故障排除或移至工作室。
- 用不透明的盖子遮住电脑屏幕, 挡住光线。覆盖活动指示器上的闪烁灯。
- 运行实验24小时。
注: 由于需要的时间来执行注射, 它不会是一个完整的24小时。注射剂应在每天的同一时间进行。在注射过程中不应记录睡眠。 - 第二天, 在注射时, 单击实验 |停止以结束录制。单击文件 |出口 |生成主题 CSVs收集每个鼠标的原始数据。
注意: 导出可能需要一些时间, 所以立即执行此操作, 然后在计算机处理时进行注射。 - 单击文件 |出口 |休眠通过打开 raw 来导出每个实验的休眠文件。CDTA 安装了软件的任何计算机上的数据文件。
- 在检测参数活动源下, 确保选中了 x 轴和 y 轴框。
- 在休眠阈值世纪下, 确保选择了4个纪元。
- 在休眠阈值活动阈值下, 确保选中了0计数。
- 在光/暗循环下, 检查光照/暗循环的适当时间。
- 在分析窗口下, 选择所需的分析时间。在注入研究的情况下, 将日期保留为默认值。将开始时间设置为 ExpSTART。将持续时间设置为 24:00, 24 h. 使用该软件的分析最多可以执行72小时。
- 保存配置以节省导出数据的时间。
- 单击更新。
- 单击生成 CSV 文件并将文件保存到所需位置。
6. 数据分析
- 对于每个录制会话, 打开休眠文件。若要分配主题 id, 请打开每个分庭的单个 CSV 文件以确定主题 id。记录所有动物的光和暗相的hh:mm:ss 睡眠的。
- 检查单个主题 CSV 文件中是否存在表明记录失败的不一致。如果在一平面中检测到高光束计数, 但在另一平面上没有观测到任何计数, 则表示光束故障。
注: 光和暗相的 "% 睡眠" 计算在整个记录期间, 包括光和暗相。对于12小时的光/暗循环, 将这个数字乘以 2, 得到 12 h 光或暗相的 "% 睡眠"。鉴于注射研究并没有完全24小时, 计算出的 "% 睡眠" 是不准确的。要生成正确的 "% 睡眠", 将 "hh:mm:ss 睡眠" 除以 "实验运行时间: hh:mm:ss", 乘以 2, 然后乘以100以获得百分比。如果在光相中进行注射, 则只有光相需要以这种方式进行调整。
- 检查单个主题 CSV 文件中是否存在表明记录失败的不一致。如果在一平面中检测到高光束计数, 但在另一平面上没有观测到任何计数, 则表示光束故障。
- 由于不同的天和阶段正在进行比较, 分析每个阶段和每天的睡眠时间百分比。
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Representative Results
为了确定每日注射对睡眠的影响, 以及动物是否习惯注射, 我们每天在上午9:00 进行14天的 IP 注射 (光循环始于凌晨6:00), 并记录12个Fmr1 C57Bl/6J 小鼠的睡眠时间。我们使用了一个在主题的设计, 每一个动物注射正常生理盐水连续4天 (天 1-4), 然后30% 个环糊精连续十天 (天 5-14)。环糊精的选择, 因为它可以用来溶解疏水性化合物的药物管理, 我们有兴趣的是如何对车辆注射可能影响睡眠的小鼠。由于记录时间长, 我们在整个研究中每周都更换两次网箱。笼子的变化是在同一时间进行的注射, 在指定的日子。我们报告在14天的注射和保持架变化期间, 光和暗相的平均睡眠持续时间 (图 1)。动物没有接受另外的适应期间到睡眠用具, 不用注射。我们发现了一个重要的相位 x 天交互 (F = 16.463) (p < 0.001), 表明在十四天的睡眠时间变化在光和暗相之间是不同的。Post hoct-测试显示, 在光照阶段, 1 天的睡眠持续时间与几乎所有其他日子不同。这与习惯对睡眠设置的影响是一致的, 即使没有注射4。另外在轻的阶段, 睡眠持续时间在天 6, 9 和 13 (当笼子被改变了在 IP 射入以后) 是明显地不同的 (p < 0.05) 比睡眠持续时间在邻居天表明笼子变动改变睡眠期间。虽然睡眠持续时间有轻微的昼夜变化 (这是正常发生的情况), 但当笼子发生变化时, 在光阶段睡眠期间的显著减少表明笼形改变会影响睡眠。环糊精管理日的睡眠持续时间无笼型变化 (即,天5、7、8、10、11、12和 14), 无明显差异。这些数据表明, 小鼠习惯于在相对较短的时间内对环糊精进行 IP 注射。在黑暗阶段, 睡眠持续时间在天2和6之间不同 (第一个笼子变动) 建议潜在的补偿为睡眠期间的减退在天发生在6日。睡眠持续时间的交替表示, 将天4到6分成2小时, 显示了注射和保持架变化对睡眠持续时间的直接影响 (图 2)。
图 1: 在十四天的记录期内显示光 (A) 和暗相 (B) 中睡眠时间的百分比.小鼠每天在上午9点接受了生理盐水 (白箭) 或30% 环糊精 (黑箭) 的 IP 注射。箭头周围的框表示笼子的变化。相 x 日交互作用有统计学意义 (p < 0.001)。后端 t-测试表明, 睡眠持续时间在1天的光照阶段不同, 这表明了对睡眠设置和 IP 注入的适应性。睡眠被减少了在天 6, 9 和13的笼子变动与其他天 (5, 7, 8, 10 11, 12 和 14)。环糊精注射液后的睡眠持续时间相对稳定, 因为网箱没有改变, 表明小鼠习惯于 IP 环糊精注射液。点代表了12只小鼠平均 (SEM) 标准误差。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 2 h 帧开始于4天的盐水注射后的睡眠持续时间百分比, 在6天结束时结束.每一个数据点都显示为小鼠的平均睡眠在接下来的2小时内。老鼠每天接受的是生理盐水 (白箭) 或30% 环糊精 (黑箭) 的 IP 注射。在上午9点进行注射, 1-1 后恢复睡眠记录. 箭头周围的5小时框表示笼子的变化。在上午9点注射后, 笼子被改变, 睡眠记录在上午11点恢复。灰色线表示在光循环中发生的睡眠, 而黑线表示在黑暗周期中发生的睡眠。点代表了12只小鼠的扫描电镜。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们提出了一种无创, 高通量的方法, 以确定睡眠时间的基础上的活动监测的家庭笼。这种评估总睡眠时间的方法已经验证了对脑电图研究3。基于活动的家庭网箱监测方法简单, 无创, 适用于大量动物的人口研究。它是有限的, 因为它不能提供睡眠的详细信息 (如睡眠时间和睡眠阶段)。
这种分析方法的缺陷相当容易检测。重要的是, 在研究中没有任何光束被阻挡。这可能是由在笼子的一个区域内的被褥积聚而产生的。通过将床上用品的高度限制为3毫米, 并去除附加的嵌套材料, 可以最大限度地减少这种情况。这一量的床上用品足以覆盖笼底和低床上用品体积没有发现影响的压力水平在小鼠17。另外的嵌套材料也可能干扰光束间隙, 因此不应提供。确保所有光束在安装过程中都能正常工作, 并在结束研究和提取数据之前检查笼子, 这一点也很重要。如果光束出现故障, 可能会发生过高估计的睡眠时间。通过仔细查看 CSV 文件, 可以在数据分析阶段检测到光束故障或障碍物。在一个轴上没有任何计数的高计数实例表明, 其中一组光束出现故障或受阻。这可能是由于对准问题 (探测器与发射器未正确对准)、连接问题或设备故障。对睡眠文件的分析只会错过这一信息, 如果没有对两个方向进行计算, 睡眠时间就会高估。
另一个考虑的家庭笼睡眠监测是需要的单一住房。老鼠必须单独安置, 以确保睡眠记录是特定的每一个被研究的老鼠。因此, 睡眠评估的持续时间应限于防止长期的社会隔离。另外, 由于动物需要单独安置在家庭笼子监视, 在断奶之前研究动物是不可能的。此外, 我们已经表明, 在几个不同年龄的小鼠中, 习惯的单壳家庭网箱监测条件需要大约24小时, 但如果研究4的不同菌株或转基因小鼠, 则可能需要进行适应性测试。目前的研究结果还表明, 在整个实验中不应改变网箱, 以避免睡眠的相关减少。
这种方法有能力研究大量的动物的睡眠, 很少的劳动和时间。因此, 它保证对不同啮齿动物线的行为分型和评估不同的操作 (包括药理学研究) 对睡眠的影响是有用的。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者希望感谢 NIH 研究员编辑委员会的编辑协助。这项研究由镍氢 (MH00889) 的壁内研究计划资助。RMS 也得到了 FRAXA 博士后奖学金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) | Columbus Instruments | Equipment and software to analyze sleep duration | |
| Captisol Research Grade | Captisol | RC-0C7-100 | Captisol for dissolving hydrophobic compounds |
| 30 G BD Needle 1/2 inch | BD | 305106 | Needle for injections |
| BD Disposable Syringes | Fisher | 14-823-30 | Syringes for injections |
| B6.129P2-Fmr1tm1Cgr/J | Jackson Labs | 3025 | Fmr1 KO mice |
| Super Mouse 750 Mouse Cage | Lab Products, Inc. | Homecages for the mice | |
| SANI-Chips Bedding | PJ Murphys | Bedding for the mice |
References
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