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Behavior

Determinação não-invasiva, elevado-throughput da duração do sono em roedores

doi: 10.3791/57420 Published: April 18, 2018

Summary

Nós descrevemos um método de alta produtividade de medição sono por meio de monitoramento de casa-gaiola baseado em atividade. Este método oferece vantagens sobre métodos tradicionais baseados em EEG. Ele é bem validado para a determinação da duração total de sono e pode ser uma ferramenta poderosa para monitorar o sono em roedores modelos de doenças humanas.

Abstract

Tradicionalmente, o sono é monitorado por uma eletroencefalograma (EEG). Estudos de EEG em roedores exigem a implantação cirúrgica de eletrodos seguido de um período de recuperação longo. Para realizar uma gravação de EEG, o animal é conectado a um receptor, criando um baraço antinatural para montagem da cabeça. Monitorização de EEG é demorado, carrega o risco para o animal e não é um cenário completamente natural para a medição de sono. Métodos alternativos para detectar o sono, particularmente em uma moda de alta produtividade, avançou enormemente o campo de pesquisa do sono. Aqui, descrevemos um método validado para a detecção de sono através do monitoramento de casa-gaiola baseado em atividade. Estudos anteriores mostraram que o sono avaliado através deste método tem um alto grau de acordo com definido por medidas tradicionais baseados em EEG de sono. Considerando que este método é validado para o tempo total de sono, é importante notar que o sono tal duração deve ser avaliada por um EEG que tem melhor resolução temporal. O EEG também pode diferenciar movimento rápido dos olhos (REM) e não - sono REM, dando mais detalhes sobre a natureza exata do sono. Não obstante, determinação de sono baseado em atividades pode ser usada para analisar vários dias de sono imperturbável e avaliar o sono como uma resposta a um evento agudo (como estresse). Aqui, nós mostramos o poder deste sistema para detectar a resposta dos ratos para injeções intraperitoneal diárias.

Introduction

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Sono tem funções importantes para a restauração do corpo e cérebro a carga diária de vigília1a seguir. Tem sido demonstrado que o sono desempenha um papel na retenção da memória e de plasticidade cerebral geral1. O EEG é o padrão ouro para detectar sono2. Em roedores, monitorização de EEG requer implantação cirúrgica de eletrodos afixados um monte de cabeça, após o qual o animal precisa de um período de tempo para se recuperar de2. Após a recuperação, o animal está ligado ao dispositivo de gravação e é dado a outro período de habituação2. Por causa desses períodos necessários de recuperação e habituação, EEG é demorado e trabalhoso e não pode ser razoavelmente executada em grande escala. Além disso, o procedimento cirúrgico de implante de eletrodo carrega um risco inerente ao animal. Finalmente, a análise de dados para marcar o sono em estudos de EEG também é muito trabalhosa. Uma alternativa, método não-invasivo, de alta produtividade de monitoramento do sono iria ajudar muito pesquisa sono roedores.

Um baseado na atividade casa-gaiola sistema de monitoramento utilizado para detectar o sono aborda as limitações dos estudos de EEG. A premissa simples é que um animal inativo é provável que um animal adormecido. Tem sido demonstrado que 40 s de inatividade contínua (guardada em 10 épocas de s) é uma medida confiável de sono, medida com um EEG (mostrado para ter 88-94% de concordância)3. Sistemas de monitoramento de casa-gaiola podem ser usados para estudar os grandes grupos de animais com tempo de configuração mínima. Mostramos que é preciso animais cerca de um dia para se habituar a habitação individual na casa-gaiola monitoramento sistema4 em contraste com as semanas de recuperação necessários para EEG estudos2. Além disso, algumas configurações podem também detectar parâmetros fisiológicos, tais como temperatura corporal, frequência cardíaca, atividade e alimentação. Temperatura e batimentos cardíacos são determinados a partir da implantação de um pequeno transmissor. Esses parâmetros podem fornecer mais informações sobre o mouse e podem ser usados em paralelo com a gravação de sono para aumentar ainda mais a nossa compreensão do sono e como é afetado.

Embora seja uma ferramenta poderosa, existem algumas limitações para os tipos de dados que podem ser adquiridos a partir de monitoramento baseado em atividade de casa-gaiola. Estudos de EEG podem diferenciar entre o REM e não REM de sono, que podem ser importantes para uma compreensão mais profunda da arquitetura do sono. Sistemas de monitoramento baseado na atividade casa-gaiola só podem fornecer dados para a duração total de sono. Além disso, embora a saída para monitoramento baseado em atividade de casa-gaiola dá informações sobre a duração de tal sono, nós não posso avaliar com precisão duração tal devido a limitação inerente de 40 s intervalos3. Apesar dessas limitações, casa-gaiola monitoramento da duração de sono fornece uma medida importante e biológica que possam influenciar muitos fatores a jusante, incluindo a saúde do animal e comportamento5.

Monitoramento de casa-gaiola baseado em atividade tem sido usado para detectar o sono em muitos estudos indicando sua versatilidade. Citamos uma amostra destes estudos4,6,7,8,9,10,11,12. Além do método apresentado, existem outros métodos de detecção de sono através de monitoramento baseado em atividade, cada um contendo suas próprias limitações de13,14. Alguns desses estudos examinar longos períodos de sono ininterrupto (72 h) enquanto alguns examinar sono em blocos de 24 h. Neste estudo, apresentamos a análise de sono para cada período de 24 h após a resposta de injeções diárias de intraperitoneal (IP) e a mudanças periódicas de gaiola em um modelo do rato da frágil X síndrome (Fmr1 KO ratos). Nós escolhemos Fmr1 KO ratos porque eles reduziram o sono4 e são supor para ser hiper-reactivas a informação sensorial15. Nossos dados destacam a capacidade de detectar mudanças nos padrões de sono em resposta a um evento estressante. Este método é ideal para a obtenção de informações gerais sobre o sono em grandes coortes de ratos. O método pode ser útil para entender os efeitos de alterações genéticas específicas sobre o sono, os efeitos dos tratamentos farmacológicos, ou respostas aos eventos, como um fator de estresse. Além disso, o método fornece um meio simples de triagem para uma resposta antes de iniciar estudos mais envolvidos.

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Protocol

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Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de uso e National Institute de Mental Saúde Cuidado Animal e efectuados de acordo com os institutos nacionais de saúde orientações sobre os cuidados e uso de animais.

1. criação de unidades de deteção de dormir

  1. Compra o número desejado de unidades e software.
  2. Siga as instruções para configurar os sistemas de monitoramento.
    1. Alinhe um detector oposta de um emissor. Certifique-se que os raios infravermelhos estão enfrentando para dentro e estão alinhados na mesma altura.
    2. Use os parafusos para posicionar os detectores e emissores na altura desejada sobre a base de metal. A esta altura deve ser ajustada para que o fundamento da gaiola é abaixo do nível de raios infravermelhos, mas o feixe está na altura adequada para detectar a atividade do animal. Isso cria uma área interna de 27 cm × 32 cm (10.625 em × em 12,75).
      1. Se forem necessários mais parafusos, compra mais em um hardware armazenar (6-32 ¼ no parafuso de cabeça de Pan).
  3. Conecte cada detector com cada emissor. Ligue o emissor ao fornecido hub ligado ao receptor. Execute este para o x e os y de aviões. Repita este passo para todas as configurações.
  4. Conecte o receptor a um computador com o hub USB fornecido.

2. software instalação

  1. Instale o software de análise e selecione o arquivo de configuração de hardware fornecido como padrão. O arquivo de configuração de hardware somente deve ser alterado pela empresa.
  2. Clique em arquivo de | Abra configuração de experiência. Abra a configuração padrão do experimento.
  3. Clique experimento | Propriedades.
  4. Clique na guia verificação alterar a taxa de varredura de 10 s.
  5. Clique na guia atividade alterar a taxa de amostragem de atividade para 10 s.
  6. Clique em arquivo de | Salve o experimento como para salvar essas configurações para experiências futuras.

3. animal Setup

  1. Isoladamente da casa os ratos em gaiolas limpas que são 31 cm (12,25 polegadas) de comprimento e 16,5 cm (6,5 pol.) de largura. Para impedir que o mouse da criação da roupa de cama e obstruindo as vigas, use roupa de cama a uma profundidade de 3 mm. Não fornecem material de nidificação adicional para os ratos.
  2. Fornecer os ratos com acesso à comida e água ad libitum por meio de um alimentador de arame que repousa no topo da gaiola com as vigas. Se necessário, volte a encher a comida e mudar as garrafas de água quando as gaiolas são alteradas a cada 3-5 dias durante toda a duração do estudo.
  3. Alinhe a gaiola do rato dentro do feixe infravermelho configurar, garantindo que descansa em aproximadamente no meio das vigas de cobertura total.
  4. Garantir a luz ciclo escuro da sala é definido para espelhar o ciclo escuro luz das condições de habitação normal dos ratos, ou altere conforme o desejado, com base na experiência.

4. preparação e injeções de drogas

  1. Obter água estéril e ciclodextrina estéril.
  2. Para todas as injeções, use uma seringa de 1 mL com agulha hipodérmica 30,5 25,5-G. Uma seringa e agulha nova devem ser usados para cada rato.
  3. Para reduzir o tempo entre as injeções, reúna todas as seringas com antecedência.
  4. Para injeções ciclodextrina: preparar a solução de ciclodextrina adicionando 3 g de ciclodextrina para 10 mL de água para fazer uma solução de ciclodextrina 30%.
  5. Administre 0,3 mL de soro fisiológico ou ciclodextrina através da injeção de IP.

5. software para gravar sono

  1. Abra o arquivo de configuração de hardware padrão.
  2. Clique em arquivo de | Abra configuração de experiência. Abra o desejado ou padrão a configuração do experimento.
  3. Clique experimento | Instalação.
    1. Designe o local para salvar o arquivo de dados, bem como um local para salvar o arquivo de backup. O software requer que o arquivo de dados armazenados em Arquivos de programa sob a pasta de programa específico.
      Nota: dado que alguns computadores exibir os Arquivos de programa , como sensível, acesso ao arquivo de dados pode não ser possível após a experiência. Portanto, é recomendável salvar o arquivo de backup para área de outra, do não-sensíveis no computador local.
    2. Designar o animal ID para cada sono câmara e digite o peso do animal, se desejado. Se a câmara não está sendo usada no experimento, desmarcando a caixa irá desactivar daquela câmara. Uma vez que as informações de identificação são inseridas, clique em concluído.
  4. Clique em arquivo de | Salve experimentar como para salvar a configuração atual do experimento sob o nome de arquivo desejado.
  5. Clique experimento | Executar ou F5 para iniciar a gravação. Espere por uma época de 10 s para certificar-se de que todas as câmaras estão captando atividade. Como os animais só foram injetados, é altamente provável que os animais estará movendo-se o suficiente para ser detectado por raios infravermelhos.
    1. Se nenhuma atividade for detectada, tente mover a gaiola do rato manualmente para garantir que as vigas pegar o movimento. Continuar a resolução de problemas ou mover para uma câmara de trabalho, se a atividade ainda não é registrada.
      Nota: Execute o experimento assim que as injeções estão acabadas.
  6. Cubra as telas de computador com uma capa opaca para bloquear a luz. Cobrir as luzes piscando no medidor de atividade.
  7. Execute o experimento por 24 h.
    Nota: Devido ao tempo necessário para realizar as injeções, não será um total de 24 h. As injeções devem ser executadas ao mesmo tempo diariamente. Sono não deve ser gravado durante injeções.
  8. No dia seguinte, na época de injeções, clique experimento | Pare de para terminar a gravação. Clique em arquivo de | Exportação | Gerar assunto CSVs para coletar os dados brutos para cada rato.
    Nota: Pode levar algum tempo para exportar, então fazer isso imediatamente e em seguida proceder às injeções enquanto o computador está processando.
  9. Clique em arquivo de | Exportação | Sono para exportar o arquivo de sono para cada experimento, abrindo as matérias-primas. Arquivo de dados do CDT em qualquer computador que tenha o software instalado.
    1. Em Fonte de actividade de parâmetros de deteção, certifique-se de que as caixas de ambos os eixos x e y são verificadas.
    2. Em Épocas de limiar de dormir, certifique-se que 4 épocas são selecionadas.
    3. Sob o Limiar de atividade de limiar dormir, certifique-se de que 0 contagens são selecionadas.
    4. Em Ciclo claro/escuro, verifique o tempo apropriado para o ciclo claro/escuro.
    5. Em Análise janela, selecione o tempo desejado para análise. No caso dos estudos de injeção, deixe o dia como padrão. Defina o horário de início , como ExpSTART. Defina a duração como as 24:00 por 24 h. análise usando que o software pode ser feito por um período máximo de 72 h.
    6. Salve a configuração para poupar tempo para exportação de dados.
    7. Clique em Atualizar.
    8. Clique em Gerar arquivo CSV e salve o arquivo para o local desejado.

6. análise de dados

  1. Para cada sessão de gravação, abra o arquivo de sono. Para atribuir o ID de objecto, abra o arquivo CSV individual para cada câmara determinar a identificação do assunto. Grave o TOT sono hh para a luz e as trevas fases para todos os animais.
    1. Verifique no arquivo CSV individuais assunto inconsistências indicando a falha de gravação. Se o farol alto contagens são detectadas em um avião, mas não contagens são observadas no outro avião, isto indica falha de feixe.
      Nota: A "% dormindo" para as fases de claro e escuras é calculada durante o período de gravação total, que inclui as fases de claro e escuras. Para ciclos de claro/escuro de 12 h, multiplique esse número por 2 para obter a % "dormindo" no 12 h luz ou fase escura. Dado que os estudos de injeção não foi para um total de 24 h, o calculado "% dormindo" não é exato. Para gerar o correto "% dormindo", dividir o "TOT sleep hh" pelo "tempo decorrido de experimento: hh," multiplique por 2 e então multiplicar por 100 para obter a porcentagem. Se as injeções foram realizadas na fase de luz, então apenas a fase de luz precisa ser ajustado dessa forma.
  2. Desde que as fases e dias diferentes estão sendo comparadas uns com os outros, analise a duração do sono por cento para cada fase e cada dia.

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Representative Results

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Para determinar o efeito de injeções diárias no sono e se os animais se habituar às injeções, realizamos injeções diárias de IP por 14 dias consecutivos às 09:00 (ciclo de luz começou às 06:00) e gravou a duração do sono em 12 camundongos C57Bl/6J do Fmr1 KO. Usamos um dentro do projeto dos sujeitos, injetando cada animal com solução salina normal durante 4 dias consecutivos (dias 1-4) e em seguida ciclodextrina de 30% para as seguintes dez dias consecutivos (dias 5-14). Ciclodextrina foi selecionada porque ele pode ser usado para dissolver compostos hidrofóbicos para administração de drogas e estávamos interessados em como injeção de veículo pode influenciar o sono em ratos. Dada a longa duração da gravação, nós também mudamos gaiolas duas vezes por semana ao longo do estudo. Gaiola de alterações foram realizadas ao mesmo tempo como as injeções nos dias indicados. Nós relatamos o sono porcentagem média duração para a fase clara e escura nos 14 dias de injeções e alterações de gaiola (Figura 1). Animais não recebeu um período de habituação adicionais para o aparelho de sono sem injeções. Encontramos uma fase significativa x interação dia (F = 16.463) (p < 0,001), indicando que a variação na duração do sono sobre os quatorze dias diferiu entre as fases de claro e escuras. Post hoct-testes revelaram que, na fase de luz, duração do sono em 1 dia foi diferente do que em quase todos os outros dias. Isto é consistente com os efeitos da habituação à instalação mesmo sem injeções4do sono. Também na fase clara, dormir duração em dias 6, 9, e 13 (quando gaiolas foram alteradas após injeções de IP) foi significativamente diferente (p < 0,05) do que a duração do sono na vizinha dias indicando que a mudança de gaiola altera a duração do sono. Enquanto há ligeira variação diária em durações de sono (que é uma ocorrência normal), a diminuição significativa na duração do sono na fase da luz quando gaiolas foram alteradas sugere que a gaiola alterações afetam sono. Não houve diferença significativa na duração do sono na fase da luz nos dias da administração de ciclodextrina sem alterações de gaiola (ou seja, nos dias 5, 7, 8, 10, 11, 12 e 14). Estes dados indicam que os ratos habituados a injeções de IP de ciclodextrina em um tempo relativamente curto. Na fase de escura, duração do sono foi diferente entre os dias 2 e 6 (a primeira mudança de gaiola), sugerindo potencial compensação para a diminuição da duração do sono na fase da luz que ocorreu no dia 6. Uma apresentação alternativa da duração do sono que divide dias 4 a 6 em incrementos de 2 h mostra o efeito imediato de injeções e gaiola mudanças na duração do sono (Figura 2).

Figure 1
Figura 1: porcentagem de tempo de sono em fases escuras (B) e a luz (A) são mostrados em todo o período de quatorze dias de gravação. Ratos receberam injeções diárias de IP de solução salina (setas brancas) ou 30% ciclodextrina (setas pretas) às 09:00 na fase de luz. Caixas em torno as setas indicam uma mudança de gaiola. A fase x interação dia foi estatisticamente significante (p < 0,001). Post hoc t-testes sugerem que a duração do sono diferia em fase luz no dia 1 de outros dias, indicando a habituação à configuração do sono e as injeções de IP. Dormir foi reduzida por mudanças de gaiola nos dias 6, 9 e 13, em comparação com outros dias (dia 5, 7, 8, 10 11, 12 e 14). Duração do sono após injeções ciclodextrina foi relativamente estável ao longo dos dias quando as gaiolas não foram alteradas indicando que os ratos habituados a injeções de ciclodextrina o IP. Representam pontos significa ± erros-padrão da média (SEM) em 12 ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: porcentagem da duração do sono através de quadros de 2h começando após injeções de solução Salinas no dia 4 e terminando no final do dia 6. Cada ponto de dados é apresentado como o sono médio dos ratos durante a seguir um período de 2 h. Os ratos receberam injeções diárias de IP de solução salina (seta branca) ou 30% ciclodextrina (setas pretas). As injeções foram dadas às 09:00 e gravação de sono retomada depois de 1-1,5 h. caixas em torno as setas indicam uma mudança de gaiola. As gaiolas foram alteradas após injeções em 9 AM e gravações de sono reiniciadas às 11:00. Linhas cinzas indicam que ocorreu no ciclo de luz enquanto linhas pretas indicam que ocorreu no ciclo escuro sono sono. Pontos representam meios ± SEM em 12 ratos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Aqui, apresentamos um método não invasivo, de alto rendimento para a determinação da duração do sono com base no monitoramento da atividade na casa-gaiola. Este método de avaliação do tempo total de sono foi validado contra EEG estudos3. Monitoramento de casa-gaiola baseado em atividade é simples, não invasiva e aplicáveis aos estudos de população em grande número de animais. É limitada, em que não pode dar informações detalhadas sobre o sono (como tal duração e sono estágios do sono).

Armadilhas para este método de análise são bastante fáceis de detectar. É importante que nenhum dos feixes estão obstruídas durante o estudo. Isso pode ocorrer por um acúmulo de roupa de cama em uma área da gaiola. Isto pode ser minimizado limitando a altura da cama a 3 mm e removendo material adicional de aninhamento. Esta quantidade de roupa de cama é suficiente para cobrir o fundo da gaiola e não foram encontrados para afetar os níveis de estresse em ratos 17volumes de baixo da cama. Material adicional de aninhamento pode também interferir com a autorização do feixe e, portanto, não deve ser fornecido. Também é importante para garantir que todas as vigas estão funcionando corretamente durante o procedimento de instalação e examinar as gaiolas antes de acabar o estudo e extrair os dados. Se um feixe está com defeito, pode ocorrer uma superestimação da duração do sono. Uma avaria de feixe ou uma obstrução pode ser detectada durante a fase de análise de dados, observando cuidadosamente o arquivo CSV. Instâncias de alta conta com um eixo sem qualquer conta com o outro eixo indicam que um dos conjuntos de vigas estava com defeito ou obstruído. Isto pode ser devido a problemas de alinhamento (o detector não alinhado com o emissor), problemas de conexão, ou mau funcionamento do equipamento. Análise do arquivo de sono só perderia essa informação, e duração de sono poderia ser subestimada, se ele não está representando para ambas as direções de vigas.

Outra consideração da casa-gaiola sono monitoramento é a necessidade de alojamento simples. Ratos devem ser alojados isoladamente para garantir a gravação de sono é específica para cada rato sendo estudado. Portanto, a duração da avaliação do sono deve ser limitada para evitar o isolamento social prolongado. Além disso, porque os animais precisam de ser individualmente alojados para monitoramento de casa-gaiola, estudando animais antes do desmame não é possível. Além disso, mostramos que demora cerca de 24h para se habituar à condição de monitoramento de casa-gaiola de corpo único em camundongos em várias idades diferentes, mas pode ser necessário testar a habituação, se diferentes cepas ou ratos transgénicos que estão sendo estudados4. Os resultados do estudo atual também sugerem que as gaiolas não devem ser alteradas durante o experimento, para evitar a redução associada no sono.

Este método tem o poder de sono em um grande número de animais com mínimo trabalho e tempo de estudar. Portanto, promete ser útil para fenotipagem comportamental das diferentes linhas de roedores e para avaliar os efeitos de diferentes manipulações (incluindo estudos farmacológicos) sobre o sono.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostaria de reconhecer o Conselho Editorial do NIH companheiros pela assistência editorial. Esta pesquisa foi financiada pelo programa de pesquisa Intramural do NIMH (ZIA MH00889). RMS também foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado FRAXA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS) Columbus Instruments Equipment and software to analyze sleep duration
Captisol Research Grade Captisol RC-0C7-100 Captisol for dissolving hydrophobic compounds
30 G BD Needle 1/2 inch BD 305106 Needle for injections
BD Disposable Syringes Fisher 14-823-30 Syringes for injections
B6.129P2-Fmr1tm1Cgr/J Jackson Labs 3025 Fmr1 KO mice
Super Mouse 750 Mouse Cage Lab Products, Inc.  Homecages for the mice
SANI-Chips Bedding PJ Murphys Bedding for the mice

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Determinação não-invasiva, elevado-throughput da duração do sono em roedores
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Saré, R. M., Lemons, A., Torossian, A., Beebe Smith, C. Noninvasive, High-throughput Determination of Sleep Duration in Rodents. J. Vis. Exp. (134), e57420, doi:10.3791/57420 (2018).More

Saré, R. M., Lemons, A., Torossian, A., Beebe Smith, C. Noninvasive, High-throughput Determination of Sleep Duration in Rodents. J. Vis. Exp. (134), e57420, doi:10.3791/57420 (2018).

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