Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α

doi: 10.3791/57421 Published: June 14, 2018
* These authors contributed equally

Summary

نقدم هنا بروتوكولا لوصف التنمية والتحقق جزيء واحد الصفيف الرقمي أليسا المقايسة، الذي تمكن من كشف حساسية فائقة من جميع الأنواع الفرعية IFN-α في العينات البشرية.

Abstract

والهدف الرئيسي من هذا البروتوكول وصف التنمية والتحقق من انترفيرون (IFN)--الصفيف بجزيء واحد α الرقمية الإنزيم Enzyme-Linked المرتبط بالانزيم (ELISA). هذا النظام يتيح التحديد الكمي للبشرية IFN-α البروتين مع حساسية لم يسبق لها مثيل، ومع لا ه للأنواع الأخرى من إيفن.

الخطوة الرئيسية الأولى للبروتوكول هو اختيار الزوج جسم، تليها تصريف جسم التقاط الخرز باراماجنيتيك، وبيوتينيليشن الكشف عن الأجسام المضادة. وبعد هذه الخطوة، يمكن تعديل معلمات مختلفة مثل تكوين المقايسة وتركيز الأجسام المضادة للكشف عن تكوين المخزن المؤقت حتى يتم تحقيق أمثل حساسية. وأخيراً، يتم تقييم خصوصيتها وإمكانية تكرار نتائج أسلوب لضمان الثقة في النتائج. وهنا، وضعنا مقايسة صفيف جزيء واحد IFN-α مع حد من الكشف عن مليلتر fg 0.69 استخدام الأجسام المضادة عالية تقارب المعزولة من المرضى مع الطفرات بياليليك في البروتين منظم المناعة الذاتية (إير) مما تسبب في بولييندوكرينوباثي الذاتية متلازمة نوع 1/المناعة الذاتية بولييندوكرينوباثي-داء المبيضات-الأدمة الضمور (APS1/أبيسيد). الأهم من ذلك، أن هذه الأجسام المضادة تمكين الكشف عن جميع الأنواع الفرعية IFN-α 13.

هذه المنهجية الجديدة تسمح بالكشف والتحديد الكمي للبروتين IFN-α في العينات البيولوجية البشرية في تركيزات أتومولار للمرة الأولى. هذه أداة سوف تكون مفيدة للغاية في رصد مستويات هذا سيتوكين في صحة الإنسان والمرض الدول، معظم خاصة العدوى والمناعة الذاتية، وأوتوينفلاميشن.

Introduction

النوع الأول ايفنس هي عائلة السيتوكينات التي تلعب دوراً محوريا في تنسيق الاستجابات المناعية المضادة للفيروسات. أنها كانت أول من اكتشف إيزاك و 60 ليندنمان منذ سنوات1،2 ، ومن المعروف الآن أن هذه الأسرة غير متجانسة من البروتينية وتضم 14 فئات فرعية مختلفة (13 IFN-α المخططات و 1 IFN-β). نوع أنا ايفنس ضرورية لإزالة الألغام العدوى الفيروسية، ولكن أيضا قد تورط في علم الأمراض من مجموعة متنوعة من الدول الأمراض البشرية، بما في ذلك أمراض المناعة الذاتية الذئبة الحمامية الجهازية (SLE)، التهاب الأحداث (JDM)، ونوع أنا إينتيرفيرونوباثيس في نوع التأسيسي الذي أنا المستحثة IFN مما يشير إلى النتائج في علم الأمراض3،،من45،،من67.

دراسة النوع الأول من البروتين إيفن المستويات في العينات البيولوجية منذ تحديا لها أولية لتحديد الهوية كوسيلة "التدخل في مضمون"1،2. حاليا، ساندويتش Enzyme-Linked المرتبط بالانزيم (ELISA) هو الأسلوب الأكثر استخداماً للكشف عن البروتين IFN-α. وعلى الرغم من كونها محددة وبسيطة وسريعة، النوع الأول الساس IFN هذه القيود الهامة، مثل حساسية محدودة. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب قياس جميع أنواع فرعية IFN-α استخدام فحوصات متعددة كل مع قدرات الكشف والحساسية الخاصة. في حين هناك اليساس التجارية التي تكشف عن أنواع فرعية مختلفة من IFN-α، حساسيتها يقتصر (1.95 بيكوغرام/مل، 12.5 بيكوغرام/مل، و 12.5 بيكوغرام/مل، على التوالي) وهو غالباً غير كافية للكشف عن البروتين IFN-α في العينات البيولوجية. للتغلب على هذا التحديد، الوكيل البيولوجية عدة وضعت فحوصات لتحديد النوع الأول IFN بقياس التعبير الجيني المستحث أو النشاط الوظيفي8،،من910،11، 12 , 13 , 14-ومع ذلك، لا توفر هذه الاختبارات قياس مباشر للبروتين IFN-α.

في هذه الدراسة، استخدمت جزيء واحد صفيف رقمي أليسا التكنولوجيا لتطوير فحص للكشف عن الجزيئات البروتينية IFN-α واحد. أليسا الرقمية تستخدم في الكيمياء الأساسية نفسها أليسا التقليدية، بيد أن رد فعل يحدث في صفائف تضم 50,000 الفردية 46 فيمتوليتير الحجم الآبار15،16. استولت عليها الخرز باراماجنيتيك المغلفة بالأجسام المضادة جزيئات البروتين وحيد والمسمى بجسم كشف بيوتينيلاتيد، تليها ملزمة إنزيم المتقارن، ستريبتافيدين-β-جالاكتوسيداسي (SBG). في وقت لاحق، يتم تعليق الخرز مع الركازة إنزيم فلوروجينيك، ريسوروفين-β-د-جالاكتوبيرانوسيدي (RGP)، إلى صفائف جزيء واحد. بتقليل الحجم رد فعل 2 مليار مرة17، ارتفاع تركيز محلية إشارة الفلورسنت ويتحقق والتهم جزيء واحد يصبح ممكناً، كما يولد كل جزيء إشارة بأن الآن يمكن أن تكون موثوق بها قياس18. في جوهرها صفائف جزيء واحد قادرة على عد إيمونوكومبليكسيس واحدة وتحديد عدد متوسط من الإنزيمات كل حبة (AEB). عد ميكروويلس التي تم الكشف عن إشارة تصاريح الكمي/ترقيم جزيئات البروتينية، كما أن هناك علاقة طردية بين تركيز البروتين والنسبة بين إيمونوكومبليكسيد-الخرز وعدد إجمالي من الخرز موجودة في الدوائر الحجم فيمتوليتير.

يونغ وآخرون. إجراء دراسة تقييمية عبر منصة واسعة النطاق باستخدام تكنولوجيات مختلفة تسعة وأربعة سيتوكين تحديدكم بهدف مقارنة الدقة المقايسة، وحساسية، وترابط البيانات عبر منصات مختلفة19. وكان من النتائج الرئيسية للدراسة أن تعرض صفائف جزيء واحد وجزيء واحد عد المناعة حساسية أعلى للكشف عن السيتوكينات في مصل الدم البشري ضمن نطاق التركيز sub-pg/mL. جزيء واحد صفيف رقمي أليسا سيتوكين فحوصات قد استخدمت لدراسة دور تنف-α، وايل-6 في كرون المرض20, IFN-α في إينتيرفيرونوباثي و 7من مرضى المناعة الذاتية، ومختلف بوستترانسلاتيونالي تعديل أشكال ج-س-ج تشيموكيني عزر 10 (CXCL10) في الالتهاب الكبدي المزمن والمانحين صحي تلقي سيتاجليبتين21،22. وتشمل التطبيقات الأخرى قياس رودوبسين في المرضى الذين يعانون من اعتلال الشبكية السكري23؛ دراسة أمراض المخ من خلال قياسات نيوروفيلامينت المصل/بلازما الضوء24 واميلويد-β 1-42 الببتيد25، في السياق من التصلب المتعدد، ومرض الزهايمر، على التوالي. يمكن أيضا استخدام فحوصات الصفيف جزيء واحد للكشف عن العوامل الممرضة تحسين مثل وصف ل خزان الفيروسية فيروس نقص المناعة البشرية26، وأيضا للكشف عن الحمض النووي27 والصغرى الكشف28. ميزة رئيسية لهذه التكنولوجيا صفيف جزيء واحد هو هذا التنوع عالية، كما يمكن تطويرها مقايسة ضد أي أكثر من الفائدة إذا كان زوج جسم محدد متوفراً. وباﻹضافة إلى ذلك، البيرة المقايسة مجموعات متاحة تجارياً، مما يتيح تطوير فحوصات جديدة، البروتوكول الذي مفصل في شكل معدل أدناه.

هنا، يقدم وصفاً مفصلاً للخطوات الإنمائية والتحقق من الصحة مقايسة صفيف جزيء واحد تلك النتائج في زيادة حساسية للكشف عن البروتين IFN-α. ينبغي أن تكون الأجسام المضادة لجزيء واحد الصفيف فحوصات محددة للغاية، تجنب عبر التفاعل مع البروتينات ذات الصلة (مع خصوصية الأنواع النظر إذا كان ذات الصلة). ومن الناحية المثالية، ينبغي أن تختار الأجسام المضادة مع كد أصغر من 10-9 م؛ ويضمن عالية تقارب ملزمة قوية، مع إنتاج إشارة أعلى. حركية جسم مضاد-مستضد ملزمة أيضا هامة وسريعة كعلى وك بطءقبالة سوف يفضلون الجمعية ضد مستضد المعقدة. بدءاً زوج جسم يحتوي على أداء جيد في أليسا الكلاسيكية، مع حد من الكشف عن (اللد) من 1-100 بيكوغرام/مل، يزيد من فرص الحصول على مقايسة صفيف جزيء واحد حساسة للغاية. تشانغ والزملاء إجراء دراسات تفصيلية الحركية التفاعلات الجزيئية البيولوجية التي تحدث في كل خطوة، تقترح مجموعة من المعادلات للتنبؤ بالحساسية التحليلية18. أنها أظهرت أن الصفيف جزيء واحد يبدو أن أليسا الرقمية فعالة ضمن طائفة واسعة من الانتماءات جسم (دينار كويتي ~ 10−11 -109 م)، فضلا عن توليد إشارة أن أكثر اعتماداً على معدل هذه الأجسام المضادة.

للاستفادة من تقارب عالية نوع الأجسام المضادة ونحن استغل الأجسام المعزولة من المرضى الذين يعانون من متلازمة المناعة الذاتية بولييندوكرينوباثي ضمور 1/المناعة الذاتية بولييندوكرينوباثي-داء المبيضات-الأدمة (APS1/أبيسيد)29. ولأسباب غير مفهومة بعد، الغالبية العظمى من الأفراد إير التي تفتقر إلى وضع مجموعة أساسية عالية-اللذة الأجسام المضادة ضد جميع أنواع فرعية IFN-α29، واخترنا استنساخ الأجسام المضادة-إيفن-α اثنين من الانتماءات الملزمة التكميلية لمختلف المخططات IFN-α، حسب تقديرات القيم50 IC. المزيج من هذه الأجسام المضادة عالية تقارب فريدة من نوعها مع التكنولوجيا صفيف جزيء واحد تمكين التحديد الكمي المباشر ل IFN-α في تركيزات أتومولار (جي/mL). مثل الكشف عن البروتين IFN-α أولتراسينسيتيفي سوف تسهم في فهم أفضل لطبيعة وتنظيم والأثر البيولوجي استجابة المستحثة IFN في إعدادات مختلفة من المرض.

Protocol

1-اختيار الأجسام المضادة

  1. قبل البدء بالبروتوكول بمراجعة كافة خطوات رئيسية (الجدول 1) وتحديد الأجسام المضادة للمثلي.
    ملاحظة: لهذا البروتوكول اختيرت عالية تقارب الأضداد المضادة-إيفن-α-IC50 الذي يرد في الجدول 2 . اختر شكل تفضيلي، زوج يعمل جيدا مع أليسا التقليدية.

2-تصريف جسم التقاط الخرز باراماجنيتيك واختبار لتركيزات مختلفة

ملاحظة: الاحتفاظ دوماً حبة تصريف المخزن المؤقت (BCB) وحبه يغسل المخزن المؤقت (BWB) على الجليد أثناء عملية تصريف الأجسام المضادة.

  1. التقاط جسم Exchange المخزن المؤقت
    1. أن الكميات الأولى من الأضداد المضادة-إيفن-α A لاختبار 3 حبة مختلفة الاقتران نسب (0.038 ملغ/مل و 0.075 mg/mL و 0.3 مغ/مل).
      ملاحظة: تركيزات طلاء جسم منخفضة يمكن أن تكون مفيدة إذا كان يقدم المقايسة إشارة خلفية عالية. يجب مراعاة كمية الأجسام المضادة الأولية لخسائر تقدر بنسبة 30% أثناء عملية exchange المخزن المؤقت. وفقا لإرشادات الشركة المصنعة، وبغية الحد من الخلفية الأولية، تم اختبار تركيزات 0.05 مغ/مل، 0.1 مغ/مل، و 0.3 ملغ/مل، على الرغم من أن لم غالباً ما يتم الحصول على هذه القيم الدقيق نظراً لفقدان متغير المذكورة آنفا في المخزن المؤقت عملية الصرف.
    2. إضافة وحدة التخزين المطلوبة للجسم إلى عمود عامل تصفية جنبا إلى جنب مع BCB، يصل إلى 500 ميليلتر.
    3. الطرد المركزي الأعمدة في > 10,000 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل التدفق من خلال.
    4. أغسل العمود مرتين عن طريق إضافة إجمالي حجم 450 ميليلتر من BCB متبوعاً بالطرد المركزي في > 10,000 x ز لمدة 5 دقائق وتجاهل التدفق من خلال.
    5. وضع تصفية العمود يحتوي على الجسم في أنبوب ميكروسينتريفوجي نظيفة رأسا على عقب-الجزء المفتوح من العمود التي تواجهها داخل الأنبوب الجديد-والطرد المركزي في 800 x ز لمدة 1 دقيقة.
      ملاحظة: هذه الخطوة ستسمح جمع جسم تنظيفها. لا إضافة المخزن المؤقت مطلوب لهذه الخطوة.
    6. غسل الأغشية مع 50 ميليلتر BCB وأجهزة الطرد المركزي في 800 x ز لمدة 1 دقيقة كما هو الحال في 2.1.5.
    7. قياس تركيز الأجسام المضادة انخفاض حجم جهاز المطياف الضوئي باستخدام.
    8. إضافة BCB لتحقيق تركيز الأجسام المضادة المطلوبة وملاحظة الحجم النهائي.
      ملاحظة: سيتم استخدام كمية من 200 ميليلتر لوصف بقية البروتوكول، وحجم هذا يشار إليها بوصفها وحدات التخزين 2 (2V). كافة وحدات التخزين التالية كاشف ستكيف وفقا لذلك.
    9. دوامة والحفاظ على الجليد.
  2. إعداد حبة باراماجنيتيك
    1. نقل 2.8 × 108 حبات (100 ميليلتر = 1V) في أنبوب [ميكروفوج].
      ملاحظة: حجم الخرز فيعتمد على حجم النهائية التي تم الحصول عليها في 2.1.8.
    2. نبض تدور ووضع فاصل مغناطيسي لمدة 1 دقيقة وتجاهل مخفف وإزالة من المغناطيس.
    3. إضافة 2V BWB ودوامه ل 5 ق.
    4. كرر 2.2.2 و 2.2.3 مرتين مع BWB ومرتين أخريين مع BCB.
    5. 1V خرز إضافة 190 ميليلتر BCB، دوامة 5 s، تدور النبض وتخزين الخرز غسلها بالثلج.
  3. حبة التنشيط
    1. إضافة 1 مل BCB الباردة إلى قنينة 10 ملغ هيدروكلوريد كاربودييميدي 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) (EDC) ودوامه حتى يتم الحل متجانسة.
    2. ل 1V خرز إضافة 10 ميليلتر لتنمية الصادرات المخفف البارد لغسلها الخرز، ودوامه، وتبقى في شاكر 1,000 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: إعداد المؤسسة وإضافة إلى الخرز وينبغي أن يتم، في أسرع وقت ممكن نظراً لعدم استقرار الصادرات في المحاليل. أيضا، كتنمية الصادرات شدة رد الفعل، من المهم إلى تعليق حبة متجانسة قبل إضافة الصادرات من أجل منع التنشيط حبة غير متجانسة. بعد إضافة تنمية الصادرات، يجب أن تبقى حبات في التعليق.
  4. حبة تصريف جسم
    1. دوامة ونبض تدور الخرز المنشط. الآن وضع الخرز في فاصل مغناطيسي لمدة 1 دقيقة وتجاهل BCB طافية، وإزالة الأنبوب من المغناطيس.
    2. أغسل حبات مع 2V BCB. دوامة، نبض تدور، ووضع فاصل مغناطيسي لمدة 1 دقيقة. ثم تجاهل المخزن المؤقت BCB وإزالة الخرز من المغناطيس.
    3. إضافة البارد، وتبادلت المخزن المؤقت 200 ميليلتر (2V) من جسم إلى الخرز المنشط بسرعة.
    4. دوامة والحفاظ على ح 2 في شاكر في درجة حرارة الغرفة.
  5. حبة حظر والنهائي تنظيف
    1. تدور نبض تعليق الخرز المغلفة بالأجسام المضادة، وضعت في الفاصل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وقياس التركيز مع انخفاض حجم جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: هذه الخطوة ستوفر معلومات عن ما إذا كان المشبعة الخرز-أي القيم فوق الصفر سوف تشير إلى تشبع حبة-الكشف عن الأجسام المضادة للذوبان غير قادر على الربط بالخرز سوف تكون قابلة للقياس.
    2. إزالة الخرز مترافق من المغناطيس، وإضافة 2V BWB، دوامة 5 s وتدور النبض، ووضعت في الفاصل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.
    3. نقل المادة طافية إلى أنبوب جديد وقياس تركيز استخدام انخفاض حجم جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: هذه الخطوة ستوفر معلومات عن ما إذا كان يتم إصلاحها الأجسام المضادة ستابلي بالخرز. سوف تبين تركيز الأجسام المضادة يمكن اكتشافها في هذه المادة طافية مفرزة من الجسم من الخرز، الذي يحدث بانتظام. غالباً ما يعمل هذا الفحص حتى عندما تظل كميات صغيرة جداً من جسم التقاط المرفقة بالخرز.
    4. إزالة الخرز مترافق من المغناطيس، وإضافة 2V BWB، دوامة 5 s وتدور النبض، ووضعت في الفاصل المغناطيسي لمدة 1 دقيقة.
    5. إزالة الخرز مترافق من المغناطيس، وإضافة 2V حبة حجب المخزن المؤقت، دوامة ل 5 ق، واحتضان في شاكر لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    6. أغسل المغلفة بالأجسام المضادة وسدت الخرز x 3 مع 2V، مرة واحدة مع BWS، و 2 x مع "حبة مادة عازلة" (تجاهل جميع سوبيرناتانتس).
    7. تخزين الخرز المطلي والمحظورة في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام مع 2V حبة مادة عازلة.
      ملاحظة: قبل الاستخدام، الخرز يجب غسلها مرة واحدة مع كاشف/عينة "مادة" استخدام وحدة تخزين من 250 × حجم حبة/20، استخدام فاصل مغناطيسي.

3-الكشف عن الأجسام المضادة بيوتينيليشن

  1. الكشف عن الأجسام المضادة Exchange المخزن المؤقت
    1. تأخذ ميكروغرام 260 من استنساخ Ab المضادة-إيفن-α اثنين.
      ملاحظة: هذا يأخذ في الاعتبار خسارة 30% خلال exchange المخزن المؤقت، ويسمح لاختبار اثنين البيوتين/جسم مختلف النسب.
    2. المضي قدما ك 2.1 باستخدام "المخزن المؤقت" رد فعل بيوتينيليشن (BRB) بدلاً من BCB.
    3. قياس الحجم وتركيزات الأجسام المضادة، وضبط مستوى الصوت للحصول على تركيز نهائي 1 ملغ/مل.
      ملاحظة: هذا تركيز انطلاق مقترحة، ولكن يمكن أن يكون الأمثل إذا كان لا يحقق المقايسة الحساسية المطلوبة.
  2. الكشف عن الأجسام المضادة بيوتينيليشن
    1. تجلب N-هيدروكسيسوكسينيميدي-البولي إيثيلين-glycol4-البيوتين (دائرة الصحة الوطنية--PEG4--البيوتين) إلى درجة حرارة الغرفة وريسوسبيند مع ما مجموعة 400 ميليلتر من الماء المقطر لتحقيق تركيز 3.4 ملم.
    2. يقرر أن نسبة البيوتين: جسم إلى اختبار ومزيج الكشف عن الأجسام المضادة والبيوتين المخفف تبعاً لذلك (نسبة شاهقا يساوي 100 ميليلتر للكشف عن الأجسام المضادة وميليلتر 4.5 من البيوتين).
      ملاحظة: للبدء، اختبار نسب خمس وتفوقها.
    3. نبض تدور دوامة الجسم-البيوتين المزيج، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: لا حاجة هزة.
  3. بيوتينيلاتيد الكشف عن الأجسام المضادة تنقية
    1. نقل الأجسام المضادة بيوتينيلاتيد إلى مرشح جديد والمضي قدما ك 2.1، تنفيذ الخطوات الغسيل 3 مع مصرف جمهورية بوروندي (400 و 450 و 450 ميليلتر) ومجموعة نهائي.
    2. قياس حجم وتركيز بيوتينيلاتيد الكشف عن الأجسام المضادة المنقاة، ومخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

4-التحليل الأمثل

ملاحظة: استخدام البرامج لمحلل الصفيف في تكوين البيرة30جزيء واحد.
آلة محلل الصفيف جزيء واحد يتم التحكم بواسطة البرامج التي تسمح بتشغيل الفحص ستاندارديزيشنز، لأداء كوانتيفيكيشنز عينة، تعديل المعلمات الخارجية (حبة، الكاشف، SBG، RGP تركيزات؛ وتخفيف العينة...) والداخلية معلمات (عدد من الخطوات، أوقات الاحتضان...) لتحقيق الظروف المثلى المقايسة، ويمكن أيضا استخدامها لحساب النتائج (الخلفية، اللد، كميات). للحصول على الإعداد من محلل الصفيف جزيء واحد، وأن تحسب كاشف الكميات المطلوبة لكل جولة من التحسين، راجع إرشادات الشركة المصنعة. القيام بالجولات الأولى للتحسين باستخدام تكوين الخطوة 2.

  1. اختبار تركيبات لالتقاط الأجسام المضادة مترافق الخرز وبيوتينيلاتيد كشف الأجسام المضادة في كل التكوينات.
    1. اختبار تركيبات لمكافحة-إيفن-α مختلفة ثلاث التقاط تركيزات الأجسام المضادة مع نسب بيوتينيليشن ب مكافحة-إيفن-α مختلفة اثنين كالأجسام المضادة للكشف والقبض، والعكس بالعكس (الشكل 1) بتحديد الظروف الملائمة في برنامج محلل.
    2. اختيار تركيبة الأكثر حساسية، فالظروف التي من شأنها أن توفر أدنى اللد، واستخدامه لاتخاذ مزيد من الخطوات
      ملاحظة: الشكل 1 يبين كيف 0.3 ملغ/مل المضادة-إيفن-α تركيز حبة جسم ونسبة بيوتين: جسم من خمس مع جسم ب مكافحة-إيفن-α أدت إلى حساسية أعلى، كما يتضح من اللد 11.6 fg/مل. (انظر التكميلية الجدول 1). سيتم استخدام هذا المزيج لجميع الخطوات المقبلة. لاحظ أن يتحقق قدر كبير من الحساسية مع هذا التحليل خاصة قبل أي جولات للتحسين.

Figure 1
رقم 1: اختيار التوجه جسم، التقاط تركيز الأجسام المضادة في الخرز ونسبة بيوتينيليشن- تم اختبار التكوينات المختلفة الممكنة اثنين، استخدام أ المضادة-إيفن-α كجسم الالتقاط وب مكافحة-إيفن-α كالكشف عن الأجسام المضادة (A)، ونائب بالعكس (ب). IFNα-2 (ج) استخدمت مستضد. التقاط مختلف جسم تركيزات فضلا عن نسب البيوتين: جسم (B:A) خضعت أيضا لكل التكوينات. يظهر خط منقط اللد لأفضل حالة؛ مكافحة--IFN-α 0.3 ملغ/مل كالقبض ومكافحة-إيفن-α ب جسم البيوتين: الكشف عن نسبة 30 (اللد = 11.6 mg/mL المقابلة لقيمة AEB من 0.017265). تم استخدام تكوين الخطوة 2. البيوتين: جسم (B:A)- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. قارن 2 مقابل تكوين في الخطوة 3.
    ملاحظة: في الخطوة 3، هناك خطوات ثلاث حاضنات مختلفة، واحدة مع جسم التقاط، واحدة مع جسم الكشف وواحد ثالث نهائي للعلامات الإنزيم SBG. ومع ذلك، في الخطوة 2، التقاط وهي المحتضنة كشف الأجسام المضادة في وقت واحد مع أكثر الفائدة.
    1. تشغيل محلل الصفيف جزيء واحد مع التقاط وتركيز للكشف عن الأجسام المضادة ونسب من 4.1.2 تحديد تكوينات 2 والخطوة 3 التي تم تكوينها مسبقاً في محلل، إرشادات الشركة المصنعة التالية30.
    2. اختر التكوين الذي يسمح لحساسية أعلى والحفاظ عليه للخطوات المقبلة
      ملاحظة: كما هو مبين في الشكل 2 و التكميلية الجدول 2، التكوين 2-الخطوة أعطت حساسية أعلى قليلاً ونسبة إشارة/الخلفية لتركيز كل اختبار. ولذلك، أبقى التكوين 2-خطوة للخطوات المقبلة.

Figure 2
الشكل 2:2 مقابل 3-خطوة تكوين المقارنة. تم تقييم التكوينات 2 والخطوة 3 باستخدام 0.3 ملغ/مل من مكافحة-إيفن-α جسم كالقبض وب مكافحة-إيفن-α كالكشف عن الأجسام المضادة في نسبة 30 بيوتين: جسم. IFNα-2 (ج) استخدمت مستضد. في الخطوة 3 حالة، هناك خطوات ثلاث حاضنات مختلفة، واحدة مع جسم التقاط، واحدة مع جسم الكشف وواحد ثالث نهائي لوسم الإنزيم SBG. ومع ذلك، في الخطوة 2، التقاط وهي المحتضنة كشف الأجسام المضادة في وقت واحد مع أكثر الفائدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. تحسين تركيز للكشف عن الأجسام المضادة و SBG
    1. اختبار ثلاثة تركيزات مختلفة للكشف عن الأجسام المضادة (0.1 و 0.3 و 0.6 ميكروغرام/مل) جنبا إلى جنب مع ثلاثة تركيزات مختلفة من SBG (50 و 150 و 250 م) كما هو موضح أعلاه30.
    2. اختر إلى التركيزات التي يعطي حساسية أعلى والاحتفاظ بها للخطوات المقبلة.
      ملاحظة: يبين الشكل 3 أن كاشف 0.3 ميكروغرام/مل و SBG 150 م كانت الشروط التي أظهرت اللد الأمثل. وقدم هذه الشروط أيضا مستويات خلفية منخفضة ومتوسطة السعة، سلوك الذي ينتج القيم الجيدة الانحراف المعياري (SD) (تكميلية الجدول 3). تركيزات نموذجية تتراوح بين 0.1-1 ميكروغرام/مل للكشف عن الأجسام المضادة و 50-200 م ل SBG، على الرغم من أن تركيزات أعلى (مثلاً ما يصل إلى 300 م) هذه الأخيرة قد تكون مطلوبة. من المهم تجنب الظروف التي ستجعل الخلفيات أعلى من 0.02 AEB. وسيعزز زيادة تركيز الكاشف [مونوكلونل] جسم (ماب) أو SBG استجابة الإشارات والخلفية. ومع ذلك، إذا كانت الزيادة في إشارة تعلو التغير في الخلفية، سيحسن اللد. يمكن أن تنشأ حالة التي يسمح انخفاض في الخلفية أفضل التمييز بين آلة لفرز منخفضة.

Figure 3
الشكل 3: تحسين تركيز الكاشف و SBG- ثلاثة تركيزات مختلفة من بيوتينيلاتيد للكشف عن الأجسام المضادة (0.1 و 0.3 و 0.6 ميكروغرام/مل) جنبا إلى جنب مع ثلاثة تركيزات مختلفة من SBG (50 و 150 و 250 م) قيمت. يظهر خط منقط اللد لأفضل حالة؛ للكشف عن الأجسام المضادة 0.3 ملغ/مل و SBG 150 م (اللد = 0.09 ملغ/مل المقابلة لقيمة AEB من 0.017184). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. خطوات التحسين إضافية
    1. إذا لم يتحقق حساسية المطلوبة، اختبار مرات حضانة مختلفة لمختلف الخطوات باستخدام الخيارات التي تم تكوينها مسبقاً في برنامج محلل.
    2. إذا لم يكن المقايسة حساسية كافية، تحسين عدد الخرز الواحدة والتحليل باستخدام الخيارات التي تم تكوينها مسبقاً في برنامج محلل.
      ملاحظة: بمجرد بدء اختبار العينات البيولوجية، حجم العينة معلمة إضافية قابلة للتحسين. تأكد من أن تتم معالجة العينات وفقا لإجراءات الصحة والسلامة.

5-الاعتداء على خصوصية وإمكانية تكرار نتائج

  1. اختبار IFN-α المقايسة خصوصية، عن طريق اختبار المقايسة مع مختلف أنواع فرعية IFN-α والبروتينات ذات الصلة الأخرى (الشكل 4a و 4b).

Figure 4
الشكل 4: خصوصية وحساسية للمقايسة صفيف واحد جزيء IFNα الأمثل. (أ (IFN-β، IFN-λ1، IFN-λ2، IFN-ω، وخضعت البروتينات المؤتلف، جنبا إلى جنب مع الأنواع الفرعية (ب) 16 من IFN-α, IFN-γ بما في ذلك ثلاثة أنواع IFN-α2 (IFN-α2a و IFN-α2b إيفن-α2c). مقتبس من روديرو et al. 2017. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

  1. تقييم إمكانية تكرار نتائج للانزيم المحول بإجراء ثلاث تجارب نسخ متماثل مستقلة وتقييم تقلب المقايسة بين الوكالات (الشكل 5).
  2. حساب في اللد مقايسة
    ملاحظة: اللد كانت محسوبة باستخدام متوسط الفراغات الثلاثة + 3 الانحرافات المعيارية (SD)، وبالتالي الحصول على قيمة 0.23 fg/مل. كعامل تخفيف العينة القياسية هو 1:3، يعطي إدراج عامل التخفيف اللد 0.69 fg/مل.

Figure 5
الرقم 5: إمكانية تكرار نتائج للمقايسة الصفيف الأمثل من جزيء واحد عموم-إيفن-α- يدير ثلاثة مستقلة أجريت باستخدام اثنين الكثير مختلفة من الخرز. للشحنة الثانية، تم إجراء تجربتين مستقلة. كان حصل كل قياس في التكرارات. يمثل الخط المنقط في اللد، يعرف بإنزيم متوسط فارغة يعني كل حبة + SD لتشغيل جميع. IFN-α17 كمرجع، آخذا في الاعتبار أن المنحنى القياسي المشتقة هي الممثل لجميع الأنواع الفرعية IFN-α الأخرى، كما هو موضح في الشكل 4 باء. رسم يبين متوسط القيمة و SD (أشرطة الخطأ). إظهار الخطوط المنقطة اللد لتشغيل مختلفة؛ تشغيل 1: 0.073 fg مليلتر AEB = 0.006238، تشغيل 2: 0.113 fg مليلتر AEB = 0.007119، تشغيل 3: 0.043 fg مليلتر AEB = 0.05518). مقتبس من روديرو et al. 2017. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

6-البروتين المنافسة الإنزيم

  1. القيام مقايسة منافسة بروتين (كما هو موضح في الشكل 6 أسطورة) ولزيادة توضيح خصوصية المقايسة.
    ملاحظة: البلازما عينات من مرضى الذئبة الحمامية المجموعية (n = 5) واستخدمت.
    1. عندما يشتبه في أن يكون حاضرا في العينة البيولوجية الفيروسات، إعداد المخزن المؤقت للمنظمة عن طريق إضافة 200 ميليلتر من غير إيوينيك خافض للتوتر السطحي (0.5% نونيديت P40 بديل) إلى 40 مل كاشف/عينة مادة، ودوامه بقوة.
    2. الطرد المركزي العينات البيولوجية التي تحتوي على أكثر فائدة في ز 10,000 لمدة 15 دقيقة عند درجة 4 مئوية لإزالة الحطام الخلوية.
    3. 185 مزيج ميليلتر الكاشف/نموذج مخفف أو المنظمة المخزن المؤقت مع 100 ميليلتر من العينات البيولوجية (عامل التخفيف النهائي 3) والأضداد المضادة-إيفن-α ميليلتر 15 A (الأولى تركيز 1 ملغ/مل، وتركيز نهائي 50 ميكروغرام/مل) أو المخزن المؤقت. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. تشغيل عينات مع أو بدون الأجسام المضادة-إيفن-α في محلل الصفيف جزيء واحد كما هو موضح أعلاه.
      ملاحظة: في حالة إشارة التشبع، عينات ينبغي زيادة إضعاف. أيضا، هو 300 ميليلتر وحدة التخزين المطلوبة لتحليل التكرارات.

Figure 6
رقم 6: تحليل المنافسة البروتين. أجريت التجارب المنافسة باستخدام عينات من خمسة مرضى الذئبة الحمامية المجموعية مختلفة. كانت تثفيل العينات البيولوجية في ز 10.000 لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية. أنها قد تضعف 1/3 مع مخفف الكاشف/عينة تحتوي على NP40 للمنظمة الفيروسية. 15µl الأجسام المضادة-إيفن-α A (الأولى تركيز 1 ملغ/مل، وتركيز نهائي 50 ميكروغرام/مل) أو أضيفت المخزن المؤقت بإجمالي حجم 300 ميليلتر. أنجز حضانة في درجة حرارة الغرفة 30 دقيقة تحكم المجموعة هو مبين في الرمادي وعينات تعامل مع A المضادة-إيفن-α ويبين جسم أسود. يظهر الرسم البياني متوسط القيمة و SD (أشرطة الخطأ). يمثل الخط المنقط اللد (AEB = 0.024774، 0.8037 جي/mL). مقتبس من روديرو et al. عام 2017 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Representative Results

وباختصار، المغلفة مقايسة صفيف عموم-إيفن-α جزيء واحد مع حد كشف 0.69 fg/مل، استخدام تكوين 2-خطوة بالتقاط حبات مع 0.3 ملغ/مل من مكافحة-إيفن-α الأجسام المضادة ومكافحة-إيفن-α ب الكشف عن الأجسام المضادة بيوتينيلاتيد بنسبة بيوتين: جسم وقد وضعت 30. وكانت التركيزات المستخدمة في بيوتينيلاتيد الكشف عن الأجسام المضادة و SBG 0.3 ميكروغرام/ملليلتر و 150 م، على التوالي. قادر على كشف جميع المخططات IFN-α 13 هذه المقايسة محددة للغاية ولا عبر التفاعل مع نوع آخر من ايفنس. وهكذا، حين أنه ليس من الممكن تحديد وقياس كل الأنواع الفردية من IFN-α، كل منهم يمكن اكتشاف وقياس معا إعطاء قيمة تركيز الكلي ل IFN-α، التي تضم مختلف الفئات الفرعية 13.

لاستكشاف القيمة التشخيصية المحتملة لهذا التحليل وضعت حديثا، IFN-α البروتين في البلازما والمصل من الأشخاص الأصحاء قياس ومقارنة مع عينات من المرضى الذين يعانون من مرض الذئبة الحمراء و JDM. كما هو موضح في الشكل 7، تم اكتشاف مستويات عالية من البروتين IFN-α في كلا الأفواج المرض مقارنة بضوابط صحية. يشير الخط المنقط في اللد إليزا المتاحة تجارياً التقليدية، التي توضح كيفية هذا النهج سوف لا يكشف البروتين IFN-α في هذه المجموعات المريض على الرغم من الجمعيات المعروفة لهذا سيتوكين مع هذه تعمل. وعلاوة على ذلك، يمكن كمياً IFN-α على سجلات 5 من حجمها، وتوضح دينامية واسعة النطاق للمقايسة، مع مستويات ملحوظة بين 1-10 إف جي مليلتر يؤكد طبيعة حساسة للغاية المقايسة.

Figure 7
رقم 7: التقدير الكمي للبروتين IFN-α في البلازما والمصل من الأفواج المريض. وقد تم تعديل هذا الرقم من روديرو et al. 2017. البلازما من ضوابط صحية (n = 20)، والمرضى الذين يعانون من مرض الذئبة الحمراء (ن = 72) و JDM (ن = 43) تم اختباره مع المقايسة الصفيف جزيء واحد عموم--IFNα. تم إجراء تحليل استخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه (كروسكال-واليس) ودن لمقارنة عدة اختبار بين المجموعات. الوسيط هو مبين. خط منقط يشير إلى اللد أليسا المضادة-إيفن-α البشرية الإشارة (1.95 بيكوغرام/مل = 1950 جي/mL). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الخطوة الاعتبارات مرجع
1-جسم اختيار الزوج الهدف مختلفة [ابيتوبس] الجدول 2
تقارب عالية
سريع كفي /"ك بطء"قبالة
2-جسم الزوج التوجه اختر شروط مع حد أدنى "للكشف عن" الشكل 1
3-التقاط تركيز الأجسام المضادة
4-البيوتين: الكشف عن نسبة الأجسام المضادة
5-2 مقابل التكوين الخطوة 3 اختر الشرط مع أعلى نسبة إشارة: معلومات أساسية الشكل 2
6-الكشف عن الأجسام المضادة تركيز اختر شروط مع حد أدنى "للكشف عن" الشكل 3
7. تركيز [سبغ]
8-خصوصية تقييم ه الشكل 4
9-الحساسية تقييم الاعتراف بالأنواع الفرعية (أن وجد)
10-إمكانية تكرار نتائج تقييم تقلب الإنزيم الشكل 5

الجدول 1: موجز للخطوات الرامية إلى التنمية والاستغلال الأمثل للمقايسة الصفيف جزيء واحد- يلخص هذا الجدول مختلف الخطوات اللازمة لتطوير والتحسين مقايسة الصفيف جزيء واحد، من اختيار الزوج جسم حتى تقييم إمكانية تكرار نتائج أولية.

مستضد 8 ح 1 (A) 12 ح 5 (ب) سيفاليموماب رونتاليزوماب
IFNΑ1 28.3 51.3 460 22.63
IFNΑ2 2563 10.7 9.02 2.15
IFNΑ4 5.11 2.99 35.35 325.3
IFNΑ5 2.01 19.6 93.29 2.49
IFNΑ6 64.7 3.03 4.97 -
IFNΑ7 0.9 0.63 233.1 -
IFNΑ8 302 0.83 691 10.86
IFNΑ10 2.54 0.71 43.2 -
IFNΑ14 3224 2.1 14.52 0.9
IFNΑ16 1.83 32.99 59.18 28.65
IFNΑ17 2.21 0.77 890.9 23.86
IFNΑ21 2.78 12.87 1769 5.8

الجدول 2: اختيار جسم عموم-ألفا- IC50 (نانوغرام/مل) تحدد استخدام عنصر الاستجابة تحفز الانترفيرون (أيسر)-لوسيفراس تحييد المقايسة. ويبين الجدول القيم IC50 من مابس المستخدمة في الفحص الصفيف جزيء واحد لجميع أنواع فرعية IFN-α. 10,000 HEK 293 MSR الخلايا المصنفة في لوحات 96-جيدا نصف مساحة بيضاء وعكس transfected مع 50 نانوغرام ممزوجة مسبقاً أيسر-اليراع لوسيفراس مراسل و بنيات لوسيفراس رينيلا استخدام الكواشف تعداء وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. بنية التعبير عن لوسيفراس بمثابة عنصر تطبيع داخلي. كانت الخلايا المحتضنة بين عشية وضحاها في "خفض المصل المتوسطة" وتستكمل مع الأحماض الأمينية غير الأساسية مم 0.1، 0.5% مصل بقرى الجنين عند 37 درجة مئوية 5% CO2 في جو هوميديفيد، بيروفات صوديوم 1 مم. بعد الاحتضان بين عشية وضحاها، حفز الخلايا على 24 ساعة مع المتوسطة التي تحتوي على خليط α IFN البشري المؤتلف مع أو بدون مكافحة-إيفن-α مابس أو مراقبة مفتش أنه قد تم بريينكوباتيد ح 1 في 37 درجة مئوية. بعد 24 ساعة تحفيز، أجريت فحوصات مراسل لوسيفراس المزدوج وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. «-» لم تحدد. سيفاليموماب هو الإنسان الكامل، الغلوبولين مناعي G1 κ جسم [مونوكلونل] أن يربط وتحييد معظم الأنواع الفرعية IFN-α؛ رونتاليزوماب جسم [مونوكلونل] أنسنة ضد IFN-α. مقتبس من ماير et al. عام 2016 وروديرو et al. 2017.

التكميلية الجدول 1: اختيار التوجه جسم، التقاط تركيز الأجسام المضادة في الخرز ونسبة بيوتينيليشن- تم اختبار التكوينات المختلفة الممكنة اثنين، استخدام أ المضادة-إيفن-α كجسم الالتقاط وب مكافحة-إيفن-α كالكشف عن الأجسام المضادة (A)، ونائب بالعكس (ب). IFNα-2 (ج) استخدمت مستضد. التقاط مختلف جسم تركيزات فضلا عن نسب البيوتين: جسم (B:A) خضعت أيضا لكل التكوينات. تشبع (السبت). اللون البرتقالي: AEB القيم التي تم استخدامها لحساب اللد؛ واعتبرت هذه التركيزات فارغة كقيم AEB بقيت ثابتة. حسبت اللد كما "يعني فارغة" + 3SD- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الجدول 2: اختبار لتكوين 3-الخطوة 2 مقابل. تم تقييم التكوينات الخطوة 2 و 3-استخدام مستضد IFNα-2 (ج). AEB كذلك كإشارة/خلفية حصص الإعاشة (S/B) يتم عرض القيم لكل الشروط. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الجدول 3: تحسين تركيز الكاشف و SBG- ثلاثة تركيزات مختلفة من بيوتينيلاتيد للكشف عن الأجسام المضادة (0.1 و 0.3 و 0.6 ميكروغرام/مل) جنبا إلى جنب مع ثلاثة تركيزات مختلفة من SBG (50 و 150 و 250 م) قيمت. يتم عرض القيم AEB لشروط اختبار تسعة. اللون البرتقالي: AEB القيم التي تم استخدامها لحساب اللد؛ واعتبرت هذه التركيزات فارغة كقيم AEB بقيت ثابتة. حسبت اللد كما "يعني فارغة" + 3SD- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الجدول 4: خصوصية وحساسية للمقايسة صفيف واحد جزيء IFNα الأمثل. وترد إنزيم متوسط كل القيم الخرز عند اختبار IFN-β، IFN λ1، IFN-λ2، IFN-ω، و IFN-γ البروتينات المؤتلف (A)، جنبا إلى جنب مع الأنواع الفرعية 16 IFN-α (ب). «-» لم تحدد. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الجدول 5: إمكانية تكرار نتائج للمقايسة صفيف واحد جزيء IFNα الأمثل. يتم عرض القيم AEB يعني لكافة المجريات المستقلة الثلاثة إلى تركز fg مليلتر 10.000. «-» لم تحدد. تشبع (السبت). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الجدول 6: تحليل المنافسة البروتين. متوسط إنزيم كل حبات تظهر القيم لكل شروط اختبارها. تم إجراء القياسات في مكررة. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

هنا، نحن ووصف التنمية والتحقق جزيء واحد استنساخه بدرجة عالية، أولتراسينسيتيفي صفيف أليسا الرقمية للقياس الكمي المباشر من البروتين IFN-α في العينات البشرية (الخطوات الملخصة في الجدول 1). إحدى الخطوات الأكثر أهمية في التنمية للفحص هو اختيار جسم زوج16، مع الخصائص من حيث الحركية وملزمة حانمه يجري مفتاح مقايسة ناجحة. من المهم تجنب استخدام مقترن بالأجسام المضادة التي تستهدف حانمه نفسه أو التي تسبب عائق الفراغية. [بولكلونل] أجسام يمكن أن تستعمل كالكشف عن الأجسام المضادة للتغلب على هذه القيود. وإذا لم يتحقق في أي خطوة معينة حساسية المرجوة، كذلك ينبغي النظر إمكانيات التحسين. وقد يشمل استخدام أزواج جسم البديلة، وتغييرات في بارامترات مثل نوع البروتين (مثل جيش صرب البوسنة < الكازين)، الأس الهيدروجيني (6.0-8.5) والقوة الأيونية وقدرة التخزين المؤقت (مثل تركيزات كلوريد الصوديوم والفوسفات)، الخرز الناقل، أو وجود التوتر السطحي. طائفة واسعة من المعلمات يخدع الأمثل عند وضع مقايسة صفيف جزيء واحد. ومع ذلك، عموما، الشروط التي إعطاء نسب عالية إشارة: الخلفية ولودس الحد الأدنى هي تلك التي تفضل (انظر الشكل 1و الشكل 2و الشكل 3).

فيما يتعلق بخصوصية، أظهر الفحص IFN-α اختبار لا تفاعلية عبر لأي ايفنس الأخرى (β، γ، λ1، λ2، ω) (الشكل 4 أ) وكان قادراً على الكشف عن جميع أنواع فرعية IFN-α 13 (الشكل 4 باء). بيد أن التحليل أظهر تقارب أدنى للنوع الفرعي IFN-α2، (الشكل 4 باء و التكميلية الجدول 4). من المثير للاهتمام، حساسيات مختلفة لفئات مختلفة من IFN-α2 (أ، ب، ج) ولوحظت أيضا، الذي قد يكون بسبب إجراءات التصنيع متميزة أو تسلسل الأحماض الأمينية المختلفة، كما تم الحصول على الأنواع الفرعية IFN-α2 من التجارية المختلفة الموردين. مع هذا الاستثناء الوحيد، أعطى جميع الأنواع IFN-α الردود متشابهة جداً. وتجلى خصوصية المقايسة كذلك المعالجة المسبقة للعينات مع مكافحة-إيفن-α استنساخ، الذي ألغى الإشارة (الشكل 6 و التكميلية الجدول 6).

واحدة من المزايا الرئيسية لهذه التكنولوجيا أن أي أكثر من الفائدة يمكن أن يحتمل أن تكون مستهدفة16. وعلاوة على ذلك، يمكن اختبار العينات البيولوجية المختلفة، مثل المصل والبلازما والسائل الدماغي النخاعي، ليساتيس الخلوية، supernatants ثقافة31 والتنفس حتى32. عادة، يتم إضعاف 1:3 من البلازما لتجنب انسداد المحتملة من محلل الصفيف جزيء واحد. ومع ذلك، أكثر الفائدة يمكن أن تكون موجودة بتركيزات منخفضة جداً في العينة البيولوجية ذات الصلة وقد تكون تركيزات أعلى من العينة المطلوبة (اعتماداً على تحليل الحساسية)33. على الرغم من أن هناك إمكانية للإرسال المتعدد مع الحفاظ على حساسية جيدة34، هو عملية أكثر تحديا وفحوصات لقياس أكبر من 6 البروتينات داخل نفس التجارب بعد أن وضعت35.

القدرة على كشف وتحديد السيتوكينات والبروتينات البيولوجية الأخرى ذات الصلة مثل تركيزات منخفضة يفتح مجموعة جديدة كاملة من التطبيقات33،36. فمن المعروف جيدا أن بروتينات عديدة تمارس آثارها حتى بتركيزات منخفضة جداً، التي كانت أقل من الحد من الكشف عن اليساس أفضل37حتى الآن. بينما توفر تكنولوجيات المناعة الأخرى مزايا أكثر تقليدية أليسا19، نثبت هنا أن جزيء واحد صفيف رقمي أليسا منصة استنساخه وقوية للكشف عن أولتراسينسيتيفي السيتوكينات التركيز المنخفض في العينات البشرية. على هذا النحو، تتيح هذه التكنولوجيا إمكانات هائلة لاكتشاف العلامات البيولوجية وتحسين إدارة المريض لمجموعة واسعة من الأمراض.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

DD ويجك الاعتراف بدعم من وكالة الاستخبارات الوطنية (مشروع إيفنكس، لا. CE17001002) وإيمونوكوري AG لتوفير الأجسام المضادة. نشكر بريجيت بدر-مونير بيلون ناثاليا، كريستين بودمر، بيلو أليكس، ملكي إيزابيل وكارتر بيير لتقديم العينات السريرية. يجك يقر "مجلس البحوث الأوروبي" (GA 309449: الزمالات إلى يجك)، وإعانة دولة تديرها الوكالة الوطنية للبحوث (فرنسا) ضمن برنامج "الاستثمار من أجل المستقبل" إذ تضع الإشارة ANR-10-إياهو-01.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-IFN-α antibody A (8H1 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody B (12H5 clone) ImmunoQure AG NA Not commercially available
Anti-IFN-α antibody EBI-1 clone eBioscience BMS216C
Anti-IFN-α antibody BMS216BK clone eBioscience BMS216BK Not an ELISA kit but bulk abs
IFN α2c eBioscience BMS305 OK
IFN αI (17) PBL 11150-1
IFN α2a PBL 11100-1
IFN α2a PeproTech No longer available
IFN α2b PBL 11105-1
IFN α1 PBL 11175-1
IFN α4a (M1) PBL 11177-1
IFN α4b (a4) PBL 11180-1
IFN αB2 (a8) PBL 11115-1
IFN αC (a10) PBL 11120-1
IFN αD (a1) PBL 11125-1
IFN αG (a5) PBL 11135-1
IFN αF (a21) PBL 11130-1
IFN αH2 (a14) PBL 11145-1
IFN αJ1 (a7) PBL 11160-1
IFN αK (a6) PBL 11165-1
IFN αWA (a16) PBL 11190-1
IFN λ1 PeproTech 300-02L
IFN λ2 PeproTech 300-02K
IFN ω PeproTech 300-02J
IFN β PeproTech 300-02BC
IFN γ PeproTech 300-02
Anti-IFN-α ELISA PBL 41115.1
96-well plates Corning 3904
ISRE-Reporter Qiagen CCS-008L
Fu-GENE HD Transfection Reagent Promega E2311
Opti-MEM Reduced Serum Mediuem ThermoFischer Scientific 31985062
Dual-Luciferase Reporter assay Promega E1910
Nonidet P40 Substitute Sigma-Aldrich 74385
Spectrophotometer NanoDrop 1000 Thermo Scientific No longer available
Amicon micocentrifuge tubes - 0.5mL filtres Merck Millipore UFC505096
Bead Conjugation Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Non-Encoded Paramagnetic Beads Quanterix 101360
Bead Wash Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
EDC Fisher Scientific 11844071
Bead Blocking Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
Bead Diluent Buffer Quanterix 101362
Detector and Sample Diluent Quanterix 101359
Biotinylation Reaction Buffer Quanterix 102040 Can not be ordered separately
NHS-PEG4-Biotin Fisher Scientific 11891195
diH2O
Centrifuge for 1.7mL microcentrifuge tubes (Heraens Fresco 21 Centrifuge) Thermo Scientific 75002478
Standard laboratory vortex mixer (MS2 Minishaker) IKA MS2
Pipettes (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
Tips (10, 20, 200 and 1000 μl) Thermo Scientific
1.7mL microcentrifuge tubes Eppendorf
Magnetic separator that accomodates 1.7mL microcentrifuge tubes (Life Technologies DynaMag-2) ThermoFisher Scientific 12321D
Mini benchtop centrifuge (Galaxy MinisStar) VWR 521-2844
Mixer/Shaker (Eppendorf Thermomixer Comfort) Eppendorf
Single molecule array (Simoa) reagents
SBG, Bead and Detector Barcode Labels Quanterix 101652
15 mL Reagent Bottles Quanterix 102411
Simoa specimen 96-well plates Quanterix 101457
Simoa Discs Quanterix 100001
Simoa 2.0 conductive Tips Quanterix 101726
Simoa Cuvettes Quanterix 100803
Simoa SBG Reagent Quanterix 102295
Simoa RGP Reagent Quanterix 101736
Simoa System Buffer 1 Quanterix 100486
Simoa System Buffer 2 Quanterix 100487
Sealing Oil Quanterix 100206
ddH2O
Simoa HD-1 Analyzer Quanterix 100032
Technologies
Single molecule array (Simoa) Quanterix
Single molecule counting Erenna Immunoassay Systems Singluex

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Isaacs, A., Lindenmann, J. Classics in Oncology Virus Interference: I. The Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 258-267 (1957).
  2. Isaacs, A., Lindenmann, J., Valentine, R. C., Alerts, E. Pillars Article: Virus Interference. II. Some Properties of Interferon. Proc. R. Soc. London. Ser. B, Biol. Sci. 147, 268-273 (1957).
  3. Hunt, D., et al. Thrombotic Microangiopathy Associated with Interferon Beta. N. Engl. J. Med. 370, 1270-1271 (2014).
  4. Hooks, J. J., et al. Immune Interferon in the Circulation of Patients with Autoimmune Disease. N. Engl. J. Med. 301, 5-8 (1979).
  5. Greenberg, S. A., et al. Interferon-alpha/beta Mediated Innate Immune Mechanisms in Dermatomyositis. Ann. Neurol. 57, 664-678 (2005).
  6. Crow, Y. J. Type I interferonopathies a novel set of inborn errors of immunity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1238, 91-98 (2011).
  7. Rodero, M. P., Crow, Y. J. Type I interferon - mediated monogenic autoinflammation: The type I interferonopathies, a conceptual overview. J. Exp. Med. 213, 2527-2538 (2016).
  8. Lewis, J. A. A sensitive biological assay for interferons. J. Immunol. Methods. 185, 9-17 (1995).
  9. Meager, A. Biological assays for interferons. J. Immunol. Methods. 261, 21-36 (2002).
  10. Hua, J., Kirou, K., Lee, C., Crow, M. K. Functional Assay of Type I Interferon in Systemic Lupus Erythematosus Plasma and Association With Anti - RNA Binding Protein Autoantibodies. Arthritis Rheumatol. 54, 1906-1916 (2006).
  11. Niewold, T. B., Kariuki, S. N., Morgan, G. A., Shrestha, S., Pachman, L. M. Elevated serum interferon-alpha activity in juvenile dermatomyositis: associations with disease activity at diagnosis and after thirty-six months of therapy. Arthritis Rheumatol. 60, 1815-1824 (2009).
  12. Seo, Y., Kim, G., Kwak, H., Nam, J. Validation of a HeLa Mx2 / Luc Reporter Cell Line for the Quantification of Human Type I Interferons. Pharmacology. 84, 135-144 (2009).
  13. Li, Y., et al. Monocyte surface expression of Fcγ receptor RI ( CD64 ), a biomarker reflecting type-I interferon levels in systemic lupus erythematosus. Arthritis Res. Ther. 12, 1-12 (2010).
  14. Berger-Rentsch, M., Zimmer, G. A Vesicular Stomatitis Virus Replicon-Based Bioassay for the Rapid and Sensitive Determination of Multi-Species Type I Interferon. PLoS One. 6, e25858 (2011).
  15. Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
  16. Wu, D., Milutinovic, M. D., Walt, D. R. Single molecule array (Simoa) assay with optimal antibody pairs for cytokine detection in human serum samples. R. Soc. Chem. 140, 6277-6282 (2015).
  17. Simoa. Scientific Principle of SimoaTM (Single Molecule Array) Technology. Whitepaper 1.0. Quanterix Corp. 1-2 (2013).
  18. Chang, L., et al. Single molecule enzyme-linked immunosorbent assays Theoretical considerations. J. Immunol. Methods. 378, 102-115 (2012).
  19. Yeung, D., et al. Evaluation of highly sensitive immunoassay technologies for quantitative measurements of sub-pg / mL levels of cytokines in human serum. J. Immunol. Methods. 437, 53-63 (2016).
  20. Song, L., et al. Single molecule measurements of tumor necrosis factor α and interleukin-6 in the plasma of patients with Crohn's disease. J. Immunol. Methods. 372, 177-186 (2011).
  21. Meissner, E. G., Decalf, J., Casrouge, A., Masur, H. Dynamic Changes of Post-Translationally Modified Forms of CXCL10 and Soluble DPP4 in HCV Subjects Receiving Interferon-Free Therapy. PLoS One. 10, e0133236 (2015).
  22. Decalf, J., et al. Inhibition of DPP4 activity in humans establishes its in vivo role in CXCL10 post-translational modification: prospective placebo-controlled clinical studies. EMBO Mol. Med. 8, 679-683 (2016).
  23. Rabing Brix Petersen, E., et al. Rhodopsin in plasma from patients with diabetic retinopathy - development and validation of digital ELISA by Single Molecule Array (Simoa) technology. J. Immunol. Methods. 446, 60-69 (2017).
  24. Disanto, G., et al. Serum Neurofilament Light: A Biomarker of Neuronal Damage in Multiple Sclerosis. Ann. Neurol. 81, 857-870 (2017).
  25. Song, L., et al. A digital enzyme-linked immunosorbent assay for ultrasensitive measurement of amyloid- β 1 - 42 peptide in human plasma with utility for studies of Alzheimer's disease therapeutics. Alzheimers. Res. Ther. 8, 1-15 (2016).
  26. Passaes, C., et al. Ultrasensitive HIV-1 p24 Assay Detects Single Infected Cells and Differences in Reservoir Induction by Latency Reversal Agents. J. Virol. 91, e02296 (2017).
  27. Song, L., et al. Direct Detection of Bacterial Genomic DNA at Sub-Femtomolar Concentrations Using Single Molecule Arrays. Anal. Chem. 85, 1932-1939 (2013).
  28. Cohen, L., Hartman, M. R., Amardey-wellington, A., Walt, D. R. Digital direct detection of microRNAs using single molecule arrays. Nucleic Acids Res. 45, e137 (2017).
  29. Meyer, S., et al. AIRE-Deficient Patients Harbor Unique High-Affinity Disease-Ameliorating Autoantibodies. Cell. 166, 582-595 (2016).
  30. Simoa. Homebrew Assay Development Guide. Simoa HD-1 Analyzer & Quanterix SR-X. User-0021 08. Quanterix corporation. (2017).
  31. Rodero, M. P., et al. Detection of interferon alpha protein reveals differential levels and cellular sources in disease. J. Exp. Med. 214, 1547-1555 (2017).
  32. Pleil, J., Angrish, M., Madden, M. Immunochemistry for high-throughput screening of human exhaled breath condensate (EBC) media implementation of automated Quanterix SIMOA instrumentation. J. Breath Res. 9, 047108 (2015).
  33. Schiess, R., Wollscheid, B., Aebersold, R. Targeted Proteomic Strategy for Clinical Biomarker Discovery. Mol. Oncol. 3, 33-44 (2009).
  34. Wilson, D. H., et al. The Simoa HD-1 Analyzer: A Novel Fully Automated Digital Immunoassay Analyzer with Single-Molecule Sensitivity and Multiplexing. J. Lab. Autom. 21, 533-547 (2016).
  35. Rivnak, A. J., et al. A fully-automated, six-plex single molecule immunoassay for measuring cytokines in blood. J. Immunol. Methods. 424, 20-27 (2015).
  36. Anderson, N. L., Anderson, N. G. The Human Plasma Proteome. History, character, and diagnostic prospects. Mol. Cell. proteomics. 1, 845-867 (2002).
  37. Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls. Proteomics Clin. Appl. 9, 406-422 (2015).
التنمية والتحقق من جزيء واحد أولتراسينسيتيفي الصفيف الرقمي المرتبط بالانزيم مقايسة الممتز للبشرية انترفيرون-α
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).More

Llibre, A., Bondet, V., Rodero, M. P., Hunt, D., Crow, Y. J., Duffy, D. Development and Validation of an Ultrasensitive Single Molecule Array Digital Enzyme-linked Immunosorbent Assay for Human Interferon-α. J. Vis. Exp. (136), e57421, doi:10.3791/57421 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter