Summary
이 프로토콜 생리 및 다른 생물학 학문을 위한 유용한 풍부한 stomatal 가드 셀 준비의 방법을 설명 합니다.
Abstract
가드 셀의 연구의 식물의 전반적인 기능에이 세포 유형은 특정 기부금의 지식에 근본적 이다. 그러나, 그것은 종종 어려운 분리 하 고 도전을 제공 따라서 종종 그들을 공부.
이 연구는 stomatal 가드 세포 농축 방법을 설정합니다. 프로토콜 가드 세포를 분리 하 고 세포에서 단백질을 추출에 스카치 테이프를 사용 합니다. 이 방법은 무결성과 가드 셀의 수익률 격리 중 향상과 세포 신호 프로세스와 어떻게 그들이 stomatal 운동 고기 연관의 연구에 대 한 신뢰할 수 있는 샘플을 제공 합니다. 이 방법에서는, 식물 잎 테이프의 두 부분 사이 분할 되었고 abaxial 쪽 제거를 떨어져 벗 겨. 이 프로토콜은 가드 셀을 애기 잎 조직에 적용 되었다. Fluorescein diacetate 생존 능력을 결정 하는 (FDA)와 abscisic 산 (ABA) stomata 운동 ABA에 대 한 응답에서을 평가 하는 세포 치료 했다. 결론적으로,이 프로토콜 증명 농축된 stomatal 가드 셀을 준비 하 고 단백질을 분리 하는 데 유용 합니다. 세포와 단백질의 품질 얻을 여기 생리 및 다른 생물학 연구.
Introduction
Stomata 전반적인 생리학과 식물의 적합성에 중요 한 역할을 한다. 이 작은 식물 특정 구조 가드 셀으로 알려진 두 전문된 상피 세포에 의해 형성 되 고 잎의 abaxial 표면에 가장 풍부 하 게 발견 된다. Stomata가 식물 및 분위기,으로 물 증발을 통해 손실 컨트롤 사이 가스의 교환에 대 한 필요 합니다. 가드 셀 (예를 들어, 빛, 습도, 병원 체 접촉, 이산화탄소 수준) 다른 외부의 통합을 통해 stomata 조리개 조절 및 내부 (예., 내 생 호르몬) 자극1,2. 지난 20 년 동안에이 세포 유형은 식물에서 프로세스 신호 공부 셀 모델 시스템 되고있다. 이러한 셀 리프; 총 셀의 작은 분수를 만들 따라서, 그들의 독특한 휴대 조사, 생 화 학적 및 분자 속성 단일 셀 방식으로, 그것은 다른 리프 셀 종류에서 그들을 격리 하는 데 필요한. 과거, 가드 셀 연구는 자주 참여 하고있다 가드 셀 protoplasts (GCP)3,,45의 준비. 이 일반적으로 많은 양의 세포 벽 타락 효소 및 또는 혼합을 통해 기계적 장애를 사용 해야 합니다 그리고 작은 수익률 시간 일반적으로 자주 GCP 샘플을 준비 하는 데 많은 시간이 소요 비용과 시간이 많이 소요 될 입증. 더 중요 한 것은, 가드 셀 stomata 조리개를 조절 하는 완전 한 쌍으로, 행동 하기 때문에 GCP 사용 하 여 가드 셀 신호를 공부 하 고 인공 시스템으로 볼 수 있습니다.
여기, 우리는 그대로 가드 셀 풍성 하 게 하 고 자극에 생리 적인 응답을 유지 stomata를 준비 하는 방법을 개발 했습니다. 이 메서드는 mesophyll 셀 protoplasts6,7를 분리 하는 데 사용 된 방법에 의해 영감을 했다. 우리의 방법에 stomata 투명 스카치 테이프를 먼저 mesophyll 세포의 대부분을 분리 포장과 가드 셀을 포함 하는 abaxial 계층에서 잎의 adaxial 레이어에 연결을 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 이 잎의 각 측에 테이프의 조각을 추가 하 고 그들을 떨어져 필 링을 하면 됩니다. Abaxial 계층에서 셀 광원 stomata 오프닝 버퍼에서 복구할 수 있습니다. 후 나머지 포장도 세포의 세포 벽 타락 효소, 테이프에 가드 셀을 풍성 하 게 뒤에 남겨두고 소량을 사용 하 여 제거 됩니다.
이 간단한 방법에서는, stomatal 가드 셀 실용적이 고 반응 수 신속 하 게 그리고 효율적으로 준비, 농축된 stomatal 가드 세포를 최소의 비용으로 50 껍질에서 1 시간 이내에 복용. 여기에 메서드 protoplasts 준비는 이전 방법 보다는 식물 세포에 더 적은 손상을 부과 했다. 또한, 재료는이 방법은 수율 바람직한 단백질 금액에서 수집. 가장 중요 한 것은, 잎 혼합 대상이 되지 않습니다, 긴 소화 시간과 가드 셀 그대로 유지 하기 때문에 연구의 결과 더 밀접 하 게 가드 셀의 자연적인 생물학의 관련이 있을 것입니다. 이 방법으로 분자 수준에서 변경 stomatal 움직임 실시간에서 상관 수 있다. 따라서,이 준비 메서드를 사용 하 여 연구에서 얻은 지식을 가드 셀 신호에 대 한 보다 포괄적인 이해에 대 한 중요 한 것입니다.
우리 모델; 식물 애기 thaliana 사용 그러나이 프로토콜을 소화 시간에 작은 수정 stomatal 가드 셀 브라 시카 napus 등 다른 식물 종에의 농축에 적용할 수 있습니다. 개념의 증거로 서 우리는이 방법을 통해 농축 stomatal 가드 세포는 가능한 fluorescein diacetate (FDA) 분석 결과 각각 식물 호르몬 abscisic 산 (ABA)를 이용 하 여 연구에 의해 표시 된 것 처럼 자극에 반응 증명 하고있다. 또한, 우리는 높은-품질 단백질이 가드 셀에서 고립 될 수 있다 증명 하고있다. 여기, 우리는이 과정의 상세한 프로토콜을 설명합니다.
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Protocol
1. 성장 하는 식물
- Potting 혼합물에 씨를 출 아 할. 식물 성장 성장 챔버에 140 µmol 광자 m−2의 − 1 의 광도와 22 ° C 및 16 h 8 h 조명의 photoperiod 어두운 18 ° C에서 2 주 동안.
- 4"직경 남 비는 토양을 포함으로 개별적으로 비슷한 크기의 묘를 이식 하 고 성장 단계 1.1에서에서 설명 하는 추가 동일한 조건에서 3 주.
참고: 습 한 토양을 유지 하는 일주일에 두 번 수돗물 식물 물.
2입니다. 풍부한 Stomata의 준비
- 메스와 개별 5 주 된 A. thaliana 식물의 잎을 제거 합니다.
- 원피스 abaxial (아래) 쪽으로 준수와 준수는 잎의 adaxial (위) 쪽으로 다른 조각 각 잎 투명 스카치 테이프의 두 가지를 연결 합니다. 5 잎에 테이프를 두고 s.
- 부드러운 껍질 떨어져 포장과 가드 세포 mesophyll 세포를 가진 adaxial 측 abaxial 측을 분리 각 손에 집게 손가락 및 엄지를 사용 하는 테이프의 두 가지.
- 장소 여 stomata의 60 mL에 나뭇잎의 abaxial 측면에서 껍질 40 m m × 12 m m 크기 페 트리 (50 m m KCl, 10mm MES-코, pH 6.2 1 m 코 조정) 버퍼링은 수집 된 요리.
- 모든 샘플 껍질 수집 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다.
- 1.1 단계에 명시 된 빛 조건에서 성장 챔버에 껍질을 포함 하는 배양 접시를 놓습니다. Stomata를 완전히 여 2 h에 대 한 빛 아래 껍질을 남겨 주세요.
- 장소는 150 m m x 20 m m 소화 효소 혼합물 (0.7% cellulase R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0.1% (w/v) polyvinylpyrrolidone-40, 및 0.25% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 55% 기본 솔루션 (0.55 M sorbitol, 0.5 m m에서에서 세포 벽의 50 mL를 포함 하는 배양 접시에 껍질 CaCl2, 0.5 m m MgCl2, 0.5 m m 의약품, 10 µ M KH2포4, 5 mM 4 morpholineethanesulfonic 산 (MES) pH 5.7에서 1 m 코 조정).
- 20 분 50 rpm에서 배양 접시에 상호 통에 껍질을 흔들어.
- 껍질에서에서 제거 효소 솔루션 핀셋으로 후 20 분 물 50 mL를 포함 하는 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 껍질을 전송 합니다.
- 15 대 한 껍질을 씻어 전송 피 펫을 사용 하 여, 모든 잔여 효소 솔루션을 제거 하는 물 10 mL로 두 번 s.
- 핀셋을 사용 하 여 단계 2.4에서에서 사용 되는 버퍼를 열고 신선한 stomata의 50 mL와 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 껍질을 배치. 1 h 단계 복구 stomata 있도록 1.1에서에서 명시 된 조명 조건에 대 한 품 어.
3. Abscisic 산 (ABA) 치료 및 Stomata 움직임 분석 결과
- 150 m m x 20 m m 크기 페 트리 접시에 15 분 stomatal 개통 버퍼의 50 mL 또는 stomatal 개통 버퍼의 적절 한 치료 시간이 10 µ M ABA의 최종 농도 50 mL 30 ° C에서 풍부한 stomata 껍질을 품 어.
- 5, 15, 30 분 동안 50 rpm에서 통에 껍질을 놓습니다. 각 시간 간격 후 핀셋으로 껍질을 제거 하 고 단계 3.3 이미징 단계를 따릅니다.
- 가벼운 현미경으로 ABA 치료 후 stomata ABA 치료 전과 다양 한 시간 점에서 이미지를 받아.
- 껍질을가지고 고 유리 현미경 슬라이드 위에 놓습니다.
- 슬라이드를 현미경 스테이지에 놓고 무대를 조정 하는 껍질의 이미지를 시각화할 수 있습니다.
- 벌금을 조정 하 고 가드 셀의 깨끗 한 이미지를 현미경에 집중 코스.
- 40 X 확대에서 여러 stomata의 여러 이미지를 가져가 라.
- 60 stomatal apertures ImageJ8를 사용 하 여 측정 합니다.
- 표준 오류 및 p-값 < 0.05 60 stomatal 조리개 측정의 의미를 계산 합니다.
4. 단백질 추출 및 SDS 페이지 분리
- 15 대 한 껍질을 갈아 냉장된 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 껍질을 충당 하기 위해 충분 한 액체 질소에 s.
- 50 껍질 당 포화 트리 스 페 놀 (pH 8.8)의 3 개 mL를 추가 및 3 mL 단백질 추출 버퍼 (자당 0.9 M, 0.1 M Tris HCl, 0.01 M EDTA, 0.4 %2-Mercaptoethanol, 1mm 프로 테아 제와 인산 가수분해 효소 억제 물의 10 µ L) 박격포를 피 펫을 다음 5 addi의 껍질을 갈아 증기 두건에서 tional 분입니다.
- 추출은 피 펫을 사용 하 여 전송 하 고는 오크에 금속 핀셋을 사용 하 여 껍질 원심 관 50 rpm에서 1 h 4 ° c.에 대 한 통에 선동
- 오크 릿지 원심 분리기 튜브에서 껍질을 제거 하 고 원심 10 분 동안 5000 x g에서 추출. 다음 전송 최고 페 놀 단계는 피 펫을 사용 하 여 새로운 깨끗 한 마이크로 원심 튜브.
- 침전은 페 놀 100% 메탄올에 얼음 처럼 차가운 0.1 M 염화 아세테이트의 5 볼륨을 추가 하 여 단백질을 추출. 짧게 소용돌이 하룻밤-20 ° c.에 품 어
- 20 분 동안 4 ° C에서 20000 x g에서 centrifuge, 천천히는 튜브 붓는 여는 상쾌한 가만히 따르다 고 튜브에 단백질 펠 릿을 유지 합니다.
- 메탄올에 0.1 M 염화 아세테이트로 두 번 단백질 펠 릿을 세척 그리고 두 번 80% 아세톤과 함께 한 번 100% 찬 아세톤.
참고: 세척 단백질의 튜브에 지정 된 시 약의 10 mL를 추가 하 여 수행 됩니다. 5 분, 10 분 동안 4 ° C에서 15000 x g에서 원심 분리 뒤 50 rpm에서 통에 교 반 하십시오. 그런 다음 튜브만 단백질 펠 릿을 유지 시 약을 붓는 다. - 펠 릿을 100% 찬 아세톤의 1 mL을 추가 하 고 다시 천천히 위아래로 pipetting으로 일시 중단.
- 2 mL 마이크로 원심 관에 피 펫을 통해 단백질 정지를 전송 후 5 분 동안 4 ° C에서 20000 x g에서 원심.
- 튜브에서 decanting 하 여 아세톤을 제거 하 고 10 분 동안 증기 두건에서 펠 릿 건조.
- 마이크로 원심 튜브 해산 버퍼 (8 M 요소, 0.5 %SDS, pH 8.5에서 30 mM Tris HCl)의 200 µ L에서에서 단백질 분해와 20000 x g 20 분 및 수집 새로운 튜브에 상쾌한 15 ° c에서 30 분 원심 분리기에 대 한 소용돌이.
- 다음 단백질 정량화 프로토콜9단백질 농도 계량.
- 단백질 분리에 대 한 단백질 견본을 사용 하 여 젤 전기 이동 법 프로토콜10다음으로.
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Representative Results
대표 이미지 전에 애기 가드 셀의 전후 mesophyll와 표 피 세포의 소화 그림 1에 표시 됩니다. 효소 활동 및 세포 막의 무결성 (그림 1B 및 1 D)를 측정 하는 FDA를 사용 하 여 mesophyll와 표 피 세포의 제거 전후 가드 세포 생존 능력을 관찰할 수 있습니다. 그림 2 는 stomatal 운동의 애기 ABA 치료에 대 한 응답에서을 보여 줍니다. Stomatal 조리개 ABA 치료의 30 분 후 50% 이상 감소합니다. 그림 2A stomata 운동의 시간 코스입니다. 다양 한 시간 점에서 사진 가벼운 현미경으로 찍은 사진. Stomatal 조리개 ImageJ로 측정 되었다 고 결과 80 조리개 측정 ± 표준 오류에 60에서 평균으로 제시 했다. 각 시간 점에서 stomata 조리개의 대표 이미지는 그림 2B에 표시 됩니다. 단백질 검출, 분리 및 관계 되는 풍부는 SDS 페이지 (그림 3)에 의해 관찰 된다. 4 생물 복제 단백질 추출이이 방법에서의 재현성을 강조 하기 위해 포함 되어 있습니다.
그림 1 . Fluorescein diacetate 생존 얼룩 가드 셀의 mesophyll와 표 피 세포의 제거 전후. 밝은 분야에서 (소화)는 (A) 껍질 (B) 껍질 (소화) FDA와 스테인드. (C) 껍질 (소화) 아래 밝은 필드 (D) 껍질 (소화)와 FDA와 스테인드. 모든 그림은 40 X 확대 촬영 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 응답으로 ABA stomatal 운동의 애기. 표 피 제거, 사전 2 h의 오프닝 버퍼 (50 m m KCl, 10mm MES-코, pH 6.2)와 빛 아래 incubated 하 고 다음 물과 5, 10 µ M ABA 치료를 incubated 상피 세포와 완전히 확장 된 잎에서 벗 겨 했다 10 및 30 분 (A) Stomatal 움직임의 시간 과정입니다. (B) 각 시간에서 stomata의 대표 이미지 포인트. 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 ± SE를 수단으로 표시 됩니다. 분산 분석 (ANOVA) 평균 차이 분석 preformed 했다. 다른 문자는 p에서 크게 다른 평균 값을 나타냅니다 < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 페 놀 기반 단백질 추출 방법을 사용 하 여 풍부한 가드 세포에서 단백질의 SDS 페이지 분리. 같은 양의 (40 µ g) 단백질 12.5 %polyacrylamide 젤을 사용 하 여 해결 되었고 CBB와 시각. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
가드 셀 모델 시스템 식물에서 신호 전달 메커니즘 연구 이며 연구에 사용 하는 샘플의 준비는 생물학 질문에 가장 적합 한 보장 하는 것이 중요 하다. 식물 연구 지역 사회 내에서 가드 셀에 증가 관심에도 불구 하 고 보편적인 메서드는 stomatal 운동 및 생리학 있도록 stomatal 가드 셀을 준비 하는 방법에 대 한 공부 분자 변화 뿐만 아니라 시스템입니다. 그들을 도전 많은 부분에서 그들의 작은 크기, 낮은 풍요와 그것을 더 많거나 적은 전체 잎에서 그들을 제거 어렵게 만들 수 있는 독특한 구조를 지정할 수 있습니다.
이 프로토콜 개발된 테이프-껍질 메서드를 사용 하 여 그들을 분리 하는 이러한 장애물을 극복 하는 방법에 대 한 방법의 제공 한다. 이 프로토콜에 표시 하는 방법 그대로 stomatal 가드 세포, 생리 적으로 자극에 응답 상태를 유지 하기 위한 방법을 제공 합니다. 이 샘플의 준비는 탠덤 질량 태그 (TMT) 또는 대 한 Isobaric 태그를 이용 하 여 양적 proteomic 연구 등 깊이 있는 proteomic 연구에 대 한 시작 물자로 역할을 수 있는 가드 세포 단백질의 추출 가능 하 게 상대 및 절대 정량 (iTRAQ)11,12. 또한,이 방법은 수 약간 수정 되며 작은 분자 대사 산물 가드 셀에서 발견 등의 연구를 가능 하 게 하도록 최적화. 여기 실험 활용 phytohormone ABA 애기, stomatal 운동 위한 elicitor 다른 치료를 적절 하 게 사용할 수 있습니다. 이 메서드는 또한 다른 식물 종에.
실험 설계와이 프로토콜에 사용 되는 재료의 특성, 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 필 링 떨어져 잎 (단계 2.2)의 abaxial 및 adaxial 측면, 하는 동안 그것은 주저 없이 하 고는 abaxial 레이어 균일 제거 후 테이프의 두 조각에 동등한 부드러운 압력을 적용 하 여 이루어집니다 중요 하다. 그것은 다른 최적의 소화 시간을 있을 수 있습니다 그들은 연구에서 식물 종에 대 한 개별 필 링 기술과 소화 시간을 최적화 해야 합니다. 효소 소화 (단계 2.8-2.10), 하는 동안 껍질 밀접 하 게 감시와 있어야 3-5 분 마다 확인 합니다. 약간의 차이 껍질의 층에 더 빨리 또는 더 느리게 소화 시간 귀 착될 것 이다 때문에 이것이 중요 합니다. ABA 또는 다른 자극 (3.1 단계)와 껍질을 치료 하면 껍질 해야 될 동등 하 게 간격, 부동 하 고 그들은 결코 중복 되도록 부드럽게 흔들어. 껍질 함께 붙어 얻을 또는 중복 솔루션과 접촉의 부족으로 인해 다른 결과 얻을 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언.
Acknowledgments
우리는 다니엘 첸에서 디지털 영상 제작 팀의 벅 홀 고등학교 동영상 편집에 감사 합니다. Stomatal 가드 셀 proteomics, metabolomics 첸 실험실에서에이 연구는 미국 국립 과학 재단 (0818051, 1158000 및 1412547)에서 교부 금에 의해 지원 되었습니다. Wenwen 홍콩 중국 장학금 위원회에 의해 지원 됩니다. 박사 Qiuying Pang 중국 장학금 위원회 국가 자연 과학 재단의 중국 (31570396)에 의해 지원 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
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