Summary
Este protocolo describe un método de preparación enriquecida de las células de guardia estomáticos que es útil para estudios fisiológicos y otros biológicos.
Abstract
El estudio de las células del protector es esencial para el conocimiento de las contribuciones específicas de este tipo de células a la función general de las plantas. Sin embargo, a menudo es difícil aislar y así estudiarlos a menudo proporciona un desafío.
Este estudio establece un método de enriquecimiento de célula estomática de guardia. El protocolo utiliza cinta adhesiva para aislar células de guardia y extracto de proteínas de las células. Este método mejora la integridad y el rendimiento de protector de la célula durante el aislamiento y ofrece una muestra fiable para el estudio de procesos de señalización celular y cómo correlacionan con fenotipos movimiento estomático. En este método, las hojas de la planta fueron repartidas entre dos porciones de la cinta y peladas aparte para quitar el lado abaxial. Este protocolo se aplicó en tejido foliar de Arabidopsis para aislar células del protector. Las células fueron tratadas con fluoresceína diacetato (FDA) para determinar la viabilidad y el ácido abscísico (ABA) para evaluar el movimiento de los estomas en respuesta a ABA. En conclusión, este protocolo resulta útil para la preparación enriquecida de las células de guardia estomáticos y aislamiento de proteínas. La calidad de las células y las proteínas aquí obtenidos permiten fisiológico y otros estudios biológicos.
Introduction
Estomas juegan un papel importante en la fisiología general y la aptitud de plantas. Estas estructuras específicas de la pequeña planta están formadas por dos células epidérmicas especializadas conocidas como células de guardia y se encuentran más abundantemente en la superficie abaxial de las hojas. Estomas son necesarios para el intercambio de gases entre la planta y la atmósfera, así como el control de la pérdida de agua por transpiración. Protector de las células regulan la abertura de estomas a través de la integración de diferentes externo (por ejemplo, luz, humedad, contacto del patógeno, los niveles de dióxido de carbono) e internas (ej., las hormonas endógenas) estímulos1,2. En los últimos 20 años, este tipo de célula se ha convertido en un sistema modelo para estudiar la célula señalización de procesos en plantas. Estas células constituyen una pequeña fracción de las células totales en una hoja; por lo tanto, para investigar su celular único, propiedades bioquímicas y moleculares en forma unicelular, es necesario aislarlos de otros tipos de células de la hoja. En el pasado, protector celular estudios han implicado a menudo la preparación de guardia celular protoplastos (GCP)3,4,5. Esto normalmente requiere el uso de grandes cantidades de enzimas degradantes de la pared celular y o disrupción mecánica mediante mezcla y ha demostrado ser costosa y desperdiciadora de tiempo que generalmente toma muchas horas para preparar una muestra GCP, a menudo veces con poco rendimiento. Más importante aún, porque guarda células actúan como pares completados para regular la abertura de estomas, el uso de BPC puede verse como un sistema artificial para estudiar la señalización de las células del protector.
Aquí, hemos desarrollado un método para preparar los estomas en la que las células intactas de guardia se enriquecen y mantener respuestas fisiológicas a los estímulos. Este método fue inspirado por un método que se utilizó para aislar células de mesófilo protoplastos6,7. En nuestro método, los estomas se preparan con clara cinta Scotch primero separar la mayoría de las células del mesófilo acoplado a la capa adaxial de la hoja de la capa abaxial con el pavimento y las células de guardia. Esto se hace por poner un trozo de cinta a cada lado de la hoja y pelarlos aparte. Las células de la capa abaxial pueden recuperar bajo la luz en un búfer de apertura de estomas. Más tarde se eliminan las células restantes del pavimento con una pequeña cantidad de pared celular, degradación de las enzimas, dejando atrás el protector de la célula que se enriquecen en la cinta.
En este sencillo método, estomáticos protector células viables y sensible puede rápidamente y eficientemente Prepárate, toma menos de una hora para obtener células de guardia estomáticos enriquecidas de 50 cáscaras con un coste mínimo de. El método aquí impone menos daño a las células de la planta que los métodos anteriores donde se preparan los protoplastos. Además, los materiales recogieron de esta cantidad de proteína accesible método rendimiento. Lo más importante, porque la hoja no se somete a fusión o tiempos de digestión larga y protector de las células permanecen intactas, los resultados de estudios más de cerca será relevantes a la biología natural protector de la célula. Con este método, movimientos estomáticos pueden correlacionarse en tiempo real con cambios a nivel molecular. Así, el conocimiento obtenido de los estudios utilizando este método de preparación sería importante para una comprensión más completa de señalización celular de guardia.
Se utilizó la planta thaliana de Arabidopsis como modelo; sin embargo, este protocolo puede aplicarse para el enriquecimiento de células estomáticos de guardia en otras especies de plantas como Brassica napus con pequeñas modificaciones en el tiempo de digestión. Como una prueba de concepto, hemos demostrado que las células de guardia estomáticos enriquecidas a través de este método son viables y en respuesta a estímulos como se muestra por la fluoresceína diacetato (FDA) análisis y estudios de utilización del hormona de la planta el ácido abscísico (ABA), respectivamente. Además, hemos demostrado que las proteínas de alta calidad pueden ser aisladas de estas células del protector. Aquí, describimos un protocolo detallado de este proceso.
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Protocol
1. cultivo de plantas
- Germinar las semillas en macetas la mezcla. Crecen las plantas en una cámara de crecimiento con una intensidad de luz de 140 μmol fotones m−2 s −1 y un fotoperíodo de luz de 8 h a 22 ° C y 16 h oscuro a 18 ° C durante 2 semanas.
- Trasplante de plántulas de tamaños similares individualmente macetas de 4" de diámetro que contiene el suelo y crecer para 3 semanas en las mismas condiciones adicionales describen en el paso 1.1.
Nota: Regar plantas con agua del grifo dos veces a la semana para mantener el suelo húmedo.
2. preparación de estomas enriquecidos
- Quitar las hojas de las plantas de a. thaliana 5 - antiguas de semana individuales con un bisturí.
- Fije cada hoja a dos trozos de cinta Scotch transparente, con una sola pieza adhiriéndose a la abaxial (envés) y la otra pieza adhiriéndose al lado adaxial (superior) de la hoja. Deja la cinta en la hoja 5 s.
- Suave piel aparte los dos pedazos de cintas con el dedo índice y el pulgar en cada mano para separar el lado abaxial con pavimento y protector de las células y el lado adaxial con las células del mesófilo.
- Lugar la corteza desde el lado abaxial de las hojas en 60 mL de apertura de estomas tampón (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, ajustado a pH 6,2 con 1 M de KOH) en tamaño 40 × 12 mm Petri platos como son recolectados.
- Repita los pasos anteriores hasta que se recogen todos los peelings de muestra.
- Coloque los platos Petri que contienen las cáscaras en la cámara de crecimiento bajo condiciones de luz en el paso 1.1. Dejar las cáscaras a la luz por 2 h abrir completamente los estomas.
- Lugar pela en 150 mm x 20 mm placa de Petri que contenga 50 mL de digerir la mezcla de enzimas (celulasa 0,7% R-10, 0.025% macerozyme R-10, 0.1% (p/v) polivinilpirrolidona-40 y albúmina de suero bovino 0.25% (p/v) en solución básica 55% (0,55 M sorbitol, 0,5 mM de la pared celular CaCl2, 0,5 mM MgCl2, el ácido ascórbico 0.5 mM, 10 μm KH2PO4, 5 mM 4-morpholineethanesulfonic ácido (MES) a pH 5.7 ajustar con 1 M de KOH).
- Sacuda las cáscaras en un agitador recíproco en una placa Petri a 50 rpm por 20 min.
- Quitar cáscaras de solución enzimática con pinzas después de 20 minutos las cáscaras de transferencia a un plato de Petri de 150 x 20 mm tamaño 50 ml de agua.
- Usando una pipeta, enjuague cáscaras por 15 s dos veces con 10 mL de agua para eliminar cualquier solución enzimática residual.
- Utilice unas pinzas para colocar las cáscaras en un plato de Petri de 150 x 20 mm tamaño con 50 mL de estomas frescos apertura buffer como se utiliza en el paso 2.4. Incubar durante 1 h en condiciones de luz en paso 1.1 para permitir que los estomas recuperar.
3. el ácido abscísico (ABA) tratamiento y análisis de movimiento de estomas
- En un plato de Petri de 150 x 20 mm tamaño. Incubar las cáscaras estomas enriquecido a 30° C durante 15 minutos en 50 mL de la solución de la apertura estomática o en 50 mL de la solución de la apertura estomática con una concentración final de 10 μm ABA para el tiempo de tratamiento apropiado.
- Coloque cáscaras en un agitador a 50 rpm para 5, 15 y 30 min. Después de cada intervalo de tiempo un Quite con las pinzas y siga los pasos de la imagen en el paso 3.3.
- Tomar imágenes de estomas antes del tratamiento de la ABA y en los distintos puntos de tiempo después del tratamiento de ABA con un microscopio de luz.
- Tome una cáscara y colocarlo en un portaobjetos de vidrio.
- Colocar el portaobjetos en la platina del microscopio y ajustar la etapa que se puede visualizar la imagen de la piel.
- Ajuste de la multa y curso de enfoque en el microscopio para obtener una imagen clara de las células del protector.
- Tomar varias imágenes de estomas múltiples en 40 aumentos.
- Medir 60 aberturas stomatal con ImageJ8.
- Calcular el error estándar y la significación en un valor de p < 0,05 de las 60 medidas de la abertura estomática.
4. proteína extracción y separación de SDS-Page
- Moler las cáscaras de 15 s en suficiente nitrógeno líquido para cubrir las cáscaras con un frío mortero y una maja.
- Por 50 cáscaras, añadir 3 mL de fenol saturado de Tris (pH 8.8) y tampón de extracción de proteína de 3 mL (0.9 M sacarosa, 0.1 M Tris-HCl, EDTA de 0.01 M, 0.4% 2-Mercaptoetanol, 10 μl de inhibidor de proteasa y fosfatasa 1 mM) con una pipeta para el mortero y luego moler las cáscaras de 5 addi minutos adicionales en una campana de humos.
- El extracto utilizando una pipeta de transferencia y las cáscaras con unas pinzas metálicas para un Oakridge tubo de centrífuga y agitan en un agitador a 50 rpm por 1 h a 4 ° C.
- Quitar las cáscaras del tubo de centrífuga de Oakridge y centrifugue el extracto a 5.000 x g por 10 min. A continuación traslado de la fase fenólica superior a un tubo nuevo de microcentrífuga limpio utilizando una pipeta.
- Precipitado el fenol extrae las proteínas mediante la adición de 5 volúmenes de acetato de amonio de 0.1 M helada en metanol al 100%. Brevemente Vortex e incubar durante la noche a-20 ° C.
- Centrifugue a 20.000 x g a 4 ° C por 20 min, decantar el sobrenadante, vertiendo lentamente el tubo y retener el precipitado de la proteína en el tubo.
- Lavar el precipitado de proteínas dos veces con acetato de amonio de 0.1 M en metanol y luego dos veces con acetona al 80% y una vez con acetona fría al 100%.
Nota: Se hacen lavados añadiendo 10 mL de reactivo especificada al tubo de proteína. Agitar en un agitador a 50 rpm por 5 min, seguido de centrifugación a 15.000 x g a 4 ° C durante 10 minutos. Luego verter el reactivo del tubo de retención sólo el precipitado de proteína. - Añadir 1 mL de acetona fría 100% a la pastilla y resuspender transfiriendo lentamente hacia arriba y hacia abajo.
- Suspensión de proteína de transferencia a través de la pipeta a un tubo de microcentrífuga de 2 mL y centrifugar a 20.000 x g a 4 ° C durante 5 minutos.
- Eliminar la acetona por decantación del tubo y secar el pellet en campana durante 10 minutos.
- Disolver la proteína en un tubo de microcentrífuga con 200 μL de buffer de disolución (8 M urea, 0.5% SDS, 30 mM Tris-HCl a pH 8,5) y agitar durante 30 minutos la centrifugadora a 20.000 x g a 15 ° C por 20 min y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo.
- Cuantificar la concentración de proteína siguiendo el protocolo de cuantificación de proteínas9.
- Utilizar muestras de proteína para separación de proteínas por electroforesis del gel siguiendo el protocolo10.
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Representative Results
Una imagen representativa de Arabidopsis protector de las células antes y después de la digestión del mesófilo y las células epidérmicas se muestra en la figura 1. Viabilidad de las células del protector antes y después del retiro del mesófilo y las células epidérmicas puede observarse con la FDA para medir la actividad enzimática y la integridad de la membrana de la célula (figura 1B y 1D). La figura 2 ilustra el movimiento estomático de Arabidopsis en respuesta al tratamiento ABA. Apertura estomática disminuye más del 50% después de 30 minutos de tratamiento con ABA. Figura 2A es un curso de tiempo de movimiento de los estomas. En varios puntos del tiempo, las fotos fueron tomadas con un microscopio de luz. Apertura estomática se midió con ImageJ y los resultados fueron presentados como el promedio de 60 a 80 errores de apertura medidas ± estándar. En la figura 2Bse muestra una imagen representativa de la abertura de estomas en cada momento. Detección de la proteína, la separación y la abundancia relativa se observan por SDS-PAGE (figura 3). Cuatro réplicas biológicas se incluyen para acentuar la reproducibilidad de la extracción de la proteína por este método.
Figura 1 . Fluoresceína diacetato viabilidad tinción de las células del protector antes y después del retiro del mesófilo y las células epidérmicas. (A) cáscaras (sin digerir) en campo brillante. (B) cáscaras (sin digerir) y se tiñen con la FDA. (C) los peelings (digeridos) bajo brillante campo pela (D) (digerido) y teñidos con FDA. Todas las fotos fueron tomadas en 40 aumentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Movimiento estomático de Arabidopsis en respuesta a ABA. Epidermis fueron pelados de hojas totalmente ampliadas, con células epidérmicas quitado, previamente incubados con luz con el tampón de apertura (50 mM KCl, 10 mM MES-KOH, pH 6.2) por 2 h y luego se incubaron con agua o con tratamiento de ABA de 10 μm para 5, 10 y 30 minutos (A) Curso del tiempo del movimiento estomático. El punto (B) imagen representativa de estomas en cada momento. Los datos se muestran como medios ± SE de tres experimentos independientes. Análisis de varianza (ANOVA) fue preformado para analizar las diferencias de medias. Letras diferentes indican valores promedio significativamente diferentes a p < 0.05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Separación de SDS-PAGE de las proteínas de las células de guardia enriquecidas usando método de la extracción de fenol proteína. Cantidades iguales (40 μg) de proteínas fueron resueltos utilizando gel de poliacrilamida al 12,5% y visualizaron con CBB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Protector de las células son un sistema modelo para estudiar los mecanismos de transducción de señal en las plantas y es importante asegurar que la preparación de las muestras utilizadas en el estudio es el más apropiado para responder a cuestiones biológicas. A pesar del creciente interés en las células de guardia dentro de la comunidad de investigación de la planta, no hay ningún método universal de cómo preparar células estomáticos de protector que permita el movimiento estomático y la fisiología así como los cambios moleculares que se estudiarán en una sistema. El reto para aislarlos puede atribuirse en gran parte a su pequeño tamaño, baja abundancia y estructura única, que puede hacer más o menos difícil de quitar de las hojas enteras.
Este protocolo proporciona un método sobre cómo superar estos obstáculos, aislándolos mediante un método desarrollado de cáscara de la cinta. El método presentado en este protocolo proporciona una manera para aislar estomáticos protector de las células intactas, que permanecen fisiológicamente responde a los estímulos. La preparación de estas muestras es posible la extracción de proteínas de la célula de guardia que podría servir como material de partida para estudios proteómicos profundidad, tales como estudios de proteómica cuantitativa utilizando etiquetas de masa tándem (TMT) y o isobárico para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ)11,12. Además, este método puede ser ligeramente modificado y optimizado para hacer posible el estudio de moléculas pequeñas, como metabolitos que se encuentran en las células del protector. Aquí el experimento utilizó la fitohormona ABA como un elicitor movimiento estomático en Arabidopsis, sin embargo otros tratamientos se pueden utilizar por consiguiente. Este método también es adaptable a otras especies de plantas.
Debido al diseño experimental y la naturaleza de los materiales utilizados en el presente Protocolo, hay algunos pasos críticos. Mientras pela aparte las caras abaxial y adaxial de la hoja (paso 2.2), es importante que se haga sin vacilación y aplicando presión suave igual a ambas piezas de la cinta para que la capa abaxial es uniforme, después se retira. Es importante optimizar el tiempo de digestión y técnica de peeling individual para las especies de plantas en el estudio ya que pueden tener tiempos diferentes digestión óptima. Durante la digestión de la enzima (pasos 2.8-2.10), las cáscaras deben ser vistas de cerca y comprobar cada 3-5 minutos. Esto es importante debido a ligeras diferencias en las capas de la corteza se traducirá en tiempos de digestión más rápida o más lenta. Al tratar las cáscaras con ABA u otros estímulos (paso 3.1), peelings deben ser equidistantes, flotante y sacude suavemente para que no se solapen. Cáscaras que atranca juntos o se superponen pueden producir resultados diferentes debido a la falta de contacto con la solución.
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Disclosures
No hay conflicto de interés declarado.
Acknowledgments
Agradecemos a Daniel Chen de la Digital Video producción equipo de Buchholz High School secundaria para la asistencia en la edición de vídeo. Esta investigación sobre las células estomáticos de guardia, la proteómica y la metabolómica en el laboratorio de Chen ha sido apoyada por becas de la Fundación Nacional de ciencia (0818051, 1158000 y 1412547). Wenwen Kong es apoyado por el Consejo de becas de China. Dr. Qiuying Pang es apoyado por el Consejo de becas de China y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (31570396).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless Steel Surgical Scalpel | Feather | NC9999403 | |
| Scotch Tape (3M) | ULINE | S-9781 | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | BR455701 | |
| Cellulase (Onozuka R-10) | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-3 | |
| Macerozyme R-10 | Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. | 21560003-4 | |
| DM6000B Microscope | Leica Microsystems | ||
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher Scientific | PI78443 | |
| Oak Ridge High-Speed PPCO Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3119-0030 | |
| EZQ Protein Quantitation Kit | Thermo Fisher Scientific | R33200 | |
| Fluorescein Diacetate (FDA) | Thermo Fisher Scientific | F1303 | |
| Abscisic Acid | Sigma-Aldrich | A4906 | |
| Metro Mix 500 | BWI Companies | TX-500 | |
| Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 161-0737 | |
| Bio-Safe Comassie (G-250) | Bio-Rad | 161-0786 | |
| Microcentrifuge Tube (2mL) | USA Scientific, Inc. | 1620-2700 | |
| ImageJ software | National Institute of Health | ||
| Tweezers | Sigma-Aldrich | F4017-1EA | |
| 12% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel | Bio-Rad | 456-1043 | |
| Microscope slides | Fisherbrand | 12-550-A3 |
References
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