Summary
Rekombinant retroviral integrase ve DNA reaksiyonlar viral DNA uçları taklit eden bir intasome bilinen bir enzimatik etkin kompleks oluşabilir. Intasomes biyokimyasal, yapısal ve Kinetik çalışmalar için kullanılır. Bu protokolü nasıl bir araya getiren ve prototip köpüklü virüs intasomes arındırmak ayrıntılı.
Abstract
A özelliği ve gerekli adım retrovirüsü yaşam döngüsünün tanimlar viral genom entegrasyon ana bilgisayar genom. Tüm Retrovirüsler kovalent ana bilgisayara strand transfer olarak bilinen DNA viral birleştirilmesi tromboksan integrase (IN) enzim kodlamak. Entegrasyon modellenmiş vitro rekombinant retroviral inç ile olmak ve viral genom uçları taklit eden DNA reaksiyonlar olabilir. Daha yakından vivo içindeentegrasyon oluşur Tümleştirme tepki özetlemek için kompleksleri rekombinant inç ve sentetik reaksiyonlar diyaliz azaltılmış tuz konsantrasyonu arabellekte tarafından monte edilir. Entegrasyonu karmaşık, bir intasome olarak adlandırılan boyut dışlama Kromatografi tarafından saf. Prototip köpüklü virüs (PFV), söz konusu olduğunda intasome inç bir tetramer ve iki DNA reaksiyonlar ve kolayca monomeric inç ve ücretsiz oligomer DNA ayrılır. PFV intasomes entegrasyon verimliliği daha iyi dinamiklerini anlamak için deneysel koşullar çeşitli ve mekanik retroviral entegrasyon altında denetlesinler.
Introduction
Ana bilgisayar genom viral genom entegrasyonu döngüsündeki tüm Retrovirüsler1zorunlu bir adımdır. Viral enzim integrase (IN) viral DNA genom DNA ağırlamaktan her iki ucuna kovalent katılmadan tromboksan. Hücresel bir enfeksiyon sırasında Tümleştirme aracılık eder öncesi entegrasyonu karmaşık bir parçasıdır. Rekombinant inç viral DNA uçları taklit çift iplikçikli DNA reaksiyonlar ile complexed da bir hedef DNA vitro2entegrasyon gerçekleştirebilirsiniz. Bir ortak Tümleştirme tahlil vitro supercoiled plazmid DNA hedef kullanır. Her iki viral DNA reaksiyonlar (vDNA) için plazmid bütünleştirilmesi doğrusal bir üründe sonuçları ve uyumlu entegrasyon (şekil 2A) olarak adlandırılır. Entegrasyon tahlil vitro da tek bir vDNA kovalent rahat bir daire içinde sonuçlanan hedef plazmid katıldı ile ürün verim. Bu yarı-site Tümleştirme ürün tahlil içinde in vitrobir eşya gibi görünüyor.
Rekombinant inç ve vDNA entegrasyonu vitrogerçekleştirebilir, ama monomeric inç ilgili görselleştirme karanlık onlar Tümleştirme kompleksleri yapısını veya çalışması dinamikleri ile ideal Kimyasalları değil. Arıtılmış Tümleştirme kompleksleri veya "intasomes," dinamik tek molekül analiz veya yapısal çalışmalar için gereklidir. PFV inç ve vDNAs diyaliz tarafından bir daha düşük tuz konsantrasyonu3,4' e bir nispeten yüksek tuz konsantrasyonu arabelleğinden monte. Diyaliz, bir çökelti sırasında formları. Bu çökelti diyaliz kaldırılır ve tuz konsantrasyonu artar. Yüksek tuz konsantrasyonu acele içeren PFV intasomes solubilizes. İntasomes o zaman boyutu dışlama Kromatografi (sn) tarafından saf. Rekombinant prototip köpüklü virüs (PFV) inç 225 µM5konsantrasyonlarda çözümde bir monomer olarak bulunmaya gösterilmiştir. SN ayırma etkili bir tetramer PFV inç ve iki vDNAs içeren PFV intasomes (225.5 kDa), monomeric PFV (44,4 kDa) ve ücretsiz vDNA (24.0 kDa) ayırır. PFV intasomes dondurulmuş olabilirler ve en az altı ay-80 ˚C, Muhafazası için Tümleştirme etkinliğini korumak.
Rekombinant PFV intasomes de amino asit oyuncu değişikliği veya kesilme mutasyonlar veya fluorophores veya biotin4,6ile etiketli vDNAs içerecek şekilde değiştirilmiş. Saf PFV intasomes kolayca supercoiled plazmid hedef DNA vitroentegrasyonu gerçekleştirmek. Toplu biyokimyasal Tümleştirme deneyleri ile intasomes etkilerini mutasyonların inhibitörleri veya diğer maddeleri, kimyevî test. Biotinylated intasomes nükleik asit veya proteinler ile ilgi soruşturma için kullanılabilir. PFV intasomes iki vDNA ucu veya intasome arama hedef görselleştirmek için toplam iç yansıma Floresans katılmadan arasında geçen zamanı ölçmek için manyetik cımbız tarafından tek molekül mikroskobu analiz için izin ortam sıcaklığında işlevsel olduğundan DNA6. Ayrıca, PFV intasomes ilk yapısal olarak olacak önemli ölçüde etkileyen retroviral entegrasyon3alan ile karakterize edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. tavlama, vDNA
- Birleştirme 1 X on tampon (10 X 10 hisse senedi: 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µM Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM hisse senedi) ve 10 µM Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM hisse senedi) son hacmi 1.5 mL ' . Aliquot 25 µL altmış 0,2 mL Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpler içine.
Not: fluorophores veya Etiketler sonunda 5'-Oligo 2 veya bir iç amino-T 5'-sonundan itibaren Oligo 1 temel 13 olarak reaksiyonlar uygulamaya bağlı olarak değiştirilebilir. Değiştirilmiş reaksiyonlar tarafından yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) tavlama önce saf. Biz 5' uç Cy3 veya Cy5 fluorophore Oligo 2 / etiketleme intasome montaj verimliliği 10 kat azaltır bulduk. İç fluorophore etiketleme derleme etkinliğini azaltmaz. - Bir thermocycler kullanarak aşağıdaki saatlerde ve sıcaklıklar ile TAV: 1 döngüsü 94.0 ˚C 3 dk, 99 döngüsü sırasında (94.0 ˚C 1 dk, 93.6 ˚C 1dk) devir başına 0.8 ˚C tarafından her iki sıcaklık azalan (14,8 ˚C 1 dk, 14.4 ˚C son döngüdür 1 dk) ve mağaza 4.0 ˚C.
- Tüm altmış tüpler tavlama reaksiyonlardan birleştirin. İki 0.5 mL 3 kDa molekül ağırlığı kesme (MWCO) ultracentrifugal filtre konsantrasyon cihazları için 500 µL yükleyin. Tavlanmış vDNA tarafından Santrifüjü 14.000 x g (RT) oda sıcaklığında 10 dakika için de bir microcentrifuge içinde konsantre ol.
Not: Retentate birim ~ 50 µL her konsantrasyon biriminde olması gerekir. - Aracılığıyla akış atmak. Kalan tavlanmış vDNA 250 µL her filtre birimine çalışan ekleyin. Spin yineleyin ve aracılığıyla akış atın. TE arabellek (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) Exchange'e 450 µL TE ile üç kez yıkayarak tampon.
- Filtre ünitesi ve 1000 x g RT. 2 min için spin ters çevir Her filtre ünitesi için son retentate ses ~ 50 µL. birleştirin retentates ve 1,5 mL vidalı kapak tüp aktarmak olmalıdır.
- VDNA 260 nm ultraviyole (UV) Absorbans ölçmek. Son molar DNA toplama hesaplamak için bu değeri kullanın. Bu vDNA yok olma katsayısı (ε260) 622,803 cm-1 M-1 ve Moleküler ağırlığı-20 ˚C 23,972 da dükkanda.
2. Intasome derleme
- Mümkünse, intasome derleme küçük bir odada bir değişken termostat ile gerçekleştirin. Termostat yaklaşık 18-22 ˚C için ayarlayın.
Not: deneyim, intasome Meclis 4 ˚C de verimli değildir. - Bir 2 L ölçek bir heyecan plaka üzerinde bir heyecan çizgiyle diyaliz arabelleği (20 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 200 mM NaCl, 2 mM dithiothreitol (DTT), 25 µM ZnCl2) 1 L hazırlayın. Arabellek en az 6 h 18-22 ˚C Oda equilibrate.
- İntasomes bir araya getirmek için 50 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 500 mM NaCl, 120 µM PFV inç ve 50 µM vDNA 150 µL toplam hacmi içinde birleştirir.
Not: PFV inç nükleaz etkinlik7,8kirletici ücretsiz olmalıdır. PFV inç konsantrasyonu ise 200 µL için son hacim artırmak mümkün o zaman da 120 µM inç 150 µL birimindeki karşılamak için sulandırmak. Bu adımın kritik faktörler inç molar oranını vDNA (2.4:1) için korumak için ve Kromatografi sırasında görselleştirmek için yeterli kompleksi için vardır. - ~ 10 cm uzun bir parçası 10 mm 6-8 kDa MWCO diyaliz boru ve klipleri Çift Kişilik distile su (GKD2O) veya en yüksek saflık su ile temizleyin. Tüp bir ucunu küçük.
Not: Diyaliz boru laboratuvar uzaydan gelen herhangi bir olası kontaminasyonu önlemek için itina ile ele alınmalıdır. - Diyaliz boru durulama arabellek (50 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 500 mM NaCl) 15 mL olun. Üç kez 1-2 mL durulama arabelleği ile diyaliz boru içine durulayın. Durulama arabelleğin bir pipet ve ince jeli ipucu yükleme mümkün olduğunca çoğunu olmaktan çıkarın.
- Gerekirse, bir temiz jilet veya neşter ince jel yükleme bahşiş hortumunun sonuna ulaşmak böylece diyaliz boru kesmek için kullanın.
- İntasome derleme bir pipet ve ince bir jeli ipucu yükleme diyaliz boru 2.3 adımından aktarın. Açık uçlu boru içinde tanıtılan hava miktarını en aza indirerek diyaliz hortumunun küçük. Boru diyaliz arabellek içine yerleştirin.
- Diyaliz tüp döner ama bir girdap içinde değil böylece nazik karıştırma ile bir gecede (16-20 h). Diyaliz boru batık ve mobil olduğundan emin olun. Yaklaşık bir saat sonra görünür bir çökelti tüp içinde gözlemlemek.
Not: Cy3 veya vDNA fluorescently etiketli Cy5 ile çökelti daha açıktır. Bu son etiketli ve dahili olarak etiketli floresan vDNA için geçerlidir.
3. Intasome Solubilization
- İki hazırlamak geniş delik pipet ipuçları 2-4 mm 200 µL bahşiş sonundan itibaren yeni bir jilet ya da neşter bıçak temiz bir yüzey üzerinde kaldırarak.
Not: İpuçları adım 3.3 ve 3.5 kullanılacaktır. - Diyaliz boru diyaliz arabelleğinden kaldırın. Seyreltme klibi yakınındaki hortumunun sonuna kalabilir diyaliz arabelleği ile intasome örneğinin önlemek için bir micropipette bir küçük pipet ucu ile herhangi bir aşırı diyaliz arabellek kaldırmak için kullanın. Küçük resmi diyaliz hortumunun bir ucundan kaldır.
- Kullanım geniş bir adım çökelti diyaliz boru 1,5 mL tüp buz içinde de dahil olmak üzere örnek aktarmak için 3.1 pipet ucu delik. Not kurtarılan malzemenin toplam hacmi; Toplam genellikle ~ 140 µL birimdir.
- 200 mM NaCl ile çökelti örneğidir; son konsantrasyonu 320 mm NaCl tuzu bir hisse senedi 5 M NaCl çözüm uygun hacmi ekleyerek artırmak. Örneğin, 150 µL örneği için 3,9 µL 5 M ekleyin NaCl ve 1.1 µL GKD2O 155 µL. Transfer buz kovası ile son bir birim için örnek bir 4 ˚C soğuk odaya.
- Kullanım geniş bir adım resuspend ve pipetting tarafından çökelti solubilize 3.1 pipet ucu delik. Her 20 dakikada en az 1 h. çökelti çoğunu çözüm gitmeli gözlemlemek için yineleyin.
Not: çökelti zaman puan arasında artık belirgin bir şekilde azalır belli olduğunda çökelti resuspend için Pipetting durdurulabilir. VDNA değil etiketlenir veya dahili olarak etiketlenir, çökelti görsel inceleme üzerine dayalı ~ 90 oranında azalır. VDNA etiketli Cy5 son söz konusu olduğunda, çökelti sadece ~ 20 oranında azalır; vDNA etiketli fluorophore ucuyla çökelti çoğunu solubilize değil. Etkili çözündürüldükten çökelti değişkendir ve ampirik olarak kararlı olmalıdır.
4. Intasome arıtma
- 250 mL boyutu dışlama Kromatografi (sn) arabellek (20 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 320 mM NaCl, % 10 gliserol) çalıştıran hazırlayın. Steril filtre 0.2 µm ile tampon filtre ünitesi ve 4 ˚C saklayın.
Not: Tüm arıtma adımlar 4 ˚C soğuk odada gerçekleştirilir. - Bir çapraz bağlı özel sn sütun equilibrate (çapı = 10 mm; uzunluğu 300 mm =; yatak birim 24 mL =; örnek hacmi = 25-500 µL; maksimum basınç = 1,5 MPa; dışlama sınırı = 4 x 107 Da; moleküler ağırlık ayıran Mat tablo 5 ve 5000 kDa arasında görmek erials) sn 0.4 mL/dk akış hızında çalışan arabelleği ile.
Not: etkin bir şekilde Superose 12 10/300 GL veya Superose 6 artırmak gibi 44 kDa 300 kDa ayırmak mümkün olup olmadığını bu arıtma farklı boyut dışlama sütunlar için adapte. Superose 12 10/300 GL daha düşük çözünürlük, zirveleri daha fazla çakışma için lider vardır. Tersine, Superose 6 artış daha yüksek çözünürlüğe sahip ve daha iyi renk ayrımı sunmaktadır. - 14.000 x g 4 ˚C kalan herhangi bir çökelti cips, 10 min için de bir microfuge intasome örnekte santrifüj kapasitesi. Dikkatli bir şekilde süpernatant çıkarın. Süpernatant 200 µL enjeksiyon döngü (~ 200 μL tutabilir boru) yükleyin. Örnek sn sütun için geçerlidir.
Not: Daha küçük yük birimler sn tarafından daha fazla çözünürlük sağlar. - 25 sn çalıştıran tampon ve 270 µL. 95 kesirler toplamak mL ile elute sn Kromatografik üç A280/A260 tepeler (şekil 1) görüntüler gözlemlemek.
Not: İlk toplama (~9.0 - 11,5 mL elüsyon), ardından PFV tetramer intasome tepe (~12.0 - 14.75 mL elüsyon) ve PFV inç monomer ücretsiz vDNA tepe (~15.0 - 18,0 mL) ile olmalıdır.
5. entegrasyon Strand Transfer tahlil, kesir seçimi ve depolama
- Her intasome tepe kesir ve 50 2 µL birleştirmek ng 3 kb supercoiled plazmid DNA (hisse senedi toplama olduğunu 50 ng/µL) 15 µL son tepki hacmine tepki arabelleği (10 mM Bis-tris propan, pH 7.5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT). 5 min için 37 ˚C, kuluçkaya.
- Eklenen hiçbir PFV intasome ile bir negatif kontrol içerir. Reaksiyon (20 mg/mL stok çözelti) 0,75 µL İndinavir K ile ve 0,75 µL SDS durdurmak (% 10 hisse senedi çözüm). -20 ˚C daha sonraki analizler için gerektiği gibi 1 h. mağaza örnekleri için 55 ˚C, kuluçkaya.
Not: Bu tahlil Tümleştirme faaliyet nitel bir değerlendirme olduğunu. Her kesir intasome molar konsantrasyon bu tahlil önce belirlenir değildir. Entegrasyon strand transfer tahlil dahil kesirler saklanabilir kadar entegrasyon (gece depolama da dahil olmak üzere) buzda etkinliğini doğruladı ve seçili kesirler bölünmemeli. Burada pMP2, bir pUC19 türev9kullanırız. Biz de başarıyla 5.4 kb plazmid pcDNA 3.1 kullandık. İçin çözülmüş olabilir herhangi bir plazmid daire, doğrusal, rahat ve supercoiled formları tümleştirme için bir hedef olarak kullanılabilir. - 120 mL % 1 kilo başına 1 X TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) önbellekle 0,1 μg/mL arasında etidyum bromür (EtBr, 10 mg/mL stok solüsyon)10birim (w/v) özel jel hazırlayın. Özel çözüm eritmek ve 15 cm x 10 cm jel döküm tepsiye dökün. 15-iyi tarak 5 mm genişliğinde, 0,75 mm kalın kuyu ile ekleyin.
Not: 1.5 mm kalınlığında wells için karşılaştırıldığında daha iyi grup çözünürlük daha dar kuyu verim. - Ortam sıcaklığında katılaşmaya jel izin. 1 X TAE ile 0,1 μg/mL EtBr jel bırakın.
- 3 µL % 50 gliserol her Tümleştirme tepki adım 5.2 ekleyin. Jel tüm reaksiyon birime yükleyin. 10 kb DNA boyutu işaretleyici (150 ng/µL hisse senedi toplama) örnekleri her iki tarafında kulvar için 1 µL yük; başka bir deyişle, DNA boyutu marker örnek şerit yan.
- Dış bir şeritte 6 µL Orange G boya (%0.25 portakal G, % 30 gliserol) yükleyin. Jel sabit voltaj, 10 V/cm (100 V), ortam sıcaklığında veya 1 h için Orange G boya açık jel sonuna ulaşana kadar çalıştırın.
- Hemen özel jel EtBr (532 nm uyarma, 610 nm emisyon filtre) tespit etmek için ayarla floresan bir tarayıcı ile resim. VDNAs etiketli fluorophore kullandıysanız, aynı zamanda uygun fluorophore ayarları ile görüntü.
Not: Örneğin, Cy5 tespit etmek için DNA, 633 nm uyarma ve 670 nm emisyon filtreleri kullanarak görüntü etiketli. Uyumlu entegrasyon ürünleri (CI, doğrusal DNA) ~ 3 kb boyutu sadık çalıştırmalısınız, unreacted supercoiled plazmid (SC) daha hızlı (~ 2 kb) çalıştırmalısınız ve yarı-site entegrasyon ürünleri (HSI, rahat daire DNA) yavaş (~3.5 kb) çalıştırmalısınız. Unreacted vDNA ~ 40, gerçek boyutu çalıştırmak gerekir kan basıncı. - Her yol, görüntüleme yazılım7bantlarında ölçmek. DNA kesir CI, HSI veya SC her şeritte hesaplamak; vDNA bu hesaba dahil değil.
Not: Entegrasyon verimliliği veya doğrusal bir ürün, dönüştürülmüş SC kısmını uyumlu entegrasyon ürünleri (CI) piksel hacmi üç grup (HSI + CI + SC) toplam piksel Hacmen bölerek hesaplanmıştır. İntasomes etiketli fluorophore iseniz, HSI ve CI ürünleri de floresan tarafından quantitated. - En uyumlu entegrasyon etkinliğine sahip kesirler seçin.
Not: deneyim, tetrameric PFV intasomes tanımlanan protein en yüksek ile en yüksek uyumlu entegrasyon etkinlik denk geliyor. Her birinin bu kesirler A280 ölçmek ve son intasome konsantrasyonu hesaplayın. PFV inç vahşi türünde iki vDNAs burada anlatılan bir tetramer ε280 908,339 cm-1M-1 ve molekül ağırlığı 225.5 kDa. Konsantrasyonları aynı model olarak sn Kromatografik tepe ve strand transfer tahlil takip etmelidir. - 5 µL aliquots her kesir dağıtmak ve erken sıvı azot içinde dondurmak. Aliquots,-80 ˚C saklayın. Depolama birimi için seçilen kesirler genellikle 200-600 nM arasında bulunmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PFV intasomes rekombinant inç vDNA toplanır. Derleme sonra intasomes (şekil 1) SEC tarafından saf. Entegrasyon etkinliği her kesir bir supercoiled DNA hedef ve özel Jel Elektroforez ile (Şekil 2) denetlesinler. Bu jel EtBr (ve fluorophore, fluorophore etiketli vDNA kullanılırsa) algılamak için ayarla floresan tarayıcıyla görüntüsü. Görüntü analiz yazılımı kullanarak, grup piksel birimleri entegrasyon verimliliği (şekil 3) hesaplamak için kullanılabilir. Kesirler en yüksek entegrasyon verimliliği ile daha sonra kullanmak üzere donmuş ek bulunmaktadır. Donmuş kesirler Tümleştirme etkinlik (şekil 4), monte intasomes uzun süreli depolama için izin korur. Herhangi bir etiket molekül ve konumunu vDNA içinde intasome montaj verimliliği (şekil 5) etkileyebilir.
Şekil 1: Boyut dışlama Kromatografik. Bir PFV intasome derleme bir özel sn sütunla ayrılmış. Bu sütun toplamak (1), PFV intasome PFV inç ve iki vDNA (2) ve monomeric PFV inç ve vDNA (3) bir tetramer oluşan ayırma için verir. Bu örnek vDNA 650 nm uyarma tarafından algılanan iç Cy5 fluorophore etiket dahil. Y ekseni optik dansitesi (OD) milli Absorbans birimleri (mAU) gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: sn kesirler Tümleştirme tahlil. (A)şeması Tümleştirme strand transfer tepki. Sol, karikatür, bir tetramer (mavi daireler) ve iki vDNA (kalın siyah çizgiler) ve hedef plazmid (ince siyah çizgiler) gibi bir PFV intasome. Hedef plazmid supercoils (SC) çizilmiş değil. Merkezi, karikatür bir yarı-site Tümleştirme (HSI) ürünün ne zaman bir vDNA kovalent hedef plazmid katıldı. Katılan tepki bir nick tanıtır ve supercoils rahatlatır. Tamam, karikatür bir uyumlu entegrasyon (CI) ürünün nerede hedef DNA iki vDNAs katılmıştır. Bu tümleştirme ürünü bir doğrusal DNA vDNAs ucunda ile sonuçlanır. (B) Supercoiled plazmid DNA her sn kesir #49-55 eklendi. Kuluçka, entegrasyon tepkiler deproteinated edildi ve EtBr içeren % 1'özel Jel Elektroforez tarafından ayrılmış. Negatif kontrol plazmid DNA hiç protein (T) ile yapıldı. DNA boyutu işaretlerine kb cinsinden gösterilir. Supercoiled plazmid (SC), uyumlu entegrasyon ürünleri (CI), yarı-site entegrasyon ürünleri (HSI) ve vDNA belirtilir. (C) özel jel Cy5 varlığı için tarandı. Sadece vDNA, CI ve HSI görünür ürünlerdir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Tümleştirme testin Nefelometri. Şekil 2 özel jel inceden inceye gözden geçirmek ve(a)EtBr ve (B) Cy5 varlığı için sayılabilir. (A)EtBr hesaplama için HSI, CI ve SC grup piksel birimleri jel analiz yazılımı kullanarak elde edilmiştir. Entegrasyon verimliliği uyumlu entegrasyon ürünleri (CI) piksel birimi tüm üç grup (HSI + CI + SC) toplam piksel Hacmen bölünmesi ile hesaplanır. Örneğin, kanal EtBr piksel değerleri için kesir #49 bantları vardır: 110565.2 SC, 25152.56 CI ve 6313.04 HSI. Toplam DNA piksel değeri kesir #49 için bu değerleri, 142030.8 toplamıdır. Entegrasyon verimliliği toplam DNA değerine göre 0.18 eşit 142030.8 bölünmüş 25152.56 CI piksel hacmi olduğunu. (B) Cy5 CI grup piksel birimleri rasgele birimleri grafiği çizilecek. Kesirler tepe Tümleştirme aktivite ile ayrı ayrı bölünmemeli ve donmuş. Bu örnekte, kesirler #50-53 seçildi. Aliquots sıvı azot ile dondurulmuş ve-80 ˚C ileride kullanmak için depolanan ek vardır.
Şekil 4: intasome faaliyete donma etkisi. Bir saniye kesir yarısı flash-80 ˚C 1 h için depolandığı ve sonra yavaş yavaş çözdürülen buza sıvı azot ile dondurulmuş. İlk yarısında dondurulmuş ve çözülmüş sn kesir yarısı kalan buz soğuk bir odada tutuldu. Intasomes (-) olmadan faaliyet için test edildi ve (+) ile donma/çözülme. Entegrasyon verimliliği yukarıda açıklandığı gibi ölçüldü. (A)EtBr özel jel Tümleştirme reaksiyon ürünleri lekeli. Supercoiled plazmid (SC), uyumlu entegrasyon ürünleri (CI), yarı-site entegrasyon ürünleri (HSI) ve unreacted vDNA gösterilir. DNA boyutu işaretlerine kb cinsinden gösterilir. (B) Nefelometri Tümleştirme verimlilik EtBr görüntü. Hesaplamalar şekil 3 göstergede açıklanmıştır. Dondurma ve çözme takip entegrasyonu aktivite kaybı olmaksızın vardır. Ortalama entegrasyon verimliliği 2 intasome hazırlıklar ile 5 bağımsız deneyler için gösterilir. Hata çubukları standart sapma gösterir. Eşleştirilmiş t-Testi analizleri vermiştir iki-ölçütlü P 0.011, = donma/çözülme Tümleştirme etkinlik biraz gelişmiş olduğunu düşündüren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: molekül ve pozisyon etkileri intasome derleme etiket. PFV intasome derlemeler etiketsiz (kırmızı), Oligo Oligo 1 Cy5 ile (siyah), dahili olarak etiketli 2 üzerinde Cy5 (mavi), ile etiketli son veya bitiş Oligo 2 üzerinde biotin (turuncu) ile etiketli olduğunu vDNAs dahil. Tüm derlemelere olan bir özel sn sütun ayrı kaldık. Y ekseni OD mAU içinde gösterir. Chromatograms en az 2 bağımsız derlemeler her intasome türünün temsilcisi vardır. Sonunda etiketleme 10 kat PFV intasomes Cy5 ile verimini azaltır ve biotin 1.8-fold. Sonunda Cy5 ve biotin birleştirmeler yüksek tuz resolubilization (Adım 3.5) sonra kalan, malzeme boyutu dışlama sütun üzerinde belirgin kaybına kaynaklanan belirgin bir şekilde daha fazla çökelti vardır. Cy5 fluorophore ile vDNA iç etiketlerine göre intasomes eşit bir verim etiketlenmemiş vDNA yol açar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retroviral Ins entegrasyonu gerçekleştirmek için ve viral ömrünün devam viral genomik DNA ile karmaşık bir multimeric oluştururlar. Monomer intasome başına sayısı tetramers, octamers ya da muhtemelen daha yüksek sipariş multimers11,12,13,14olabilir. PFV intasomes3. bir tetramer rekombinant viral genomik DNA taklit çift iplikçikli DNA reaksiyonlar ile biter vardır Bu intasomes yapısal ve dinamik çalışmalar3,5,13,14' te kullanılmıştır.
PFV intasomes Meclisi için daha düşük bir tuz konsantrasyonu bir nispeten yüksek tuz konsantrasyonu arabelleğinden diyaliz sırasında oluşur. Bu PFV intasomes içeren bir çökelti oluşumuna neden olur. İntasomes tuz konsantrasyonu artırarak çözündürüldükten. PFV inç 225 µM5konsantrasyonlarda monomeric olmak için gösterilmiştir. O zaman--dan monomeric içinde izole ve vDNA sn tarafından ücretsiz kompleksleri vardır Gliserol sn arabellek6' dahil etmek için PFV intasomes arıtma değiştirdiniz. Gliserol ek etkinlik (şekil 4) kaybı olmadan gelecekteki kullanım için dondurulmuş olması PFV intasomes sağlar.
Bu iletişim kuralı birkaç temel özellikleri şunlardır. Protein saflaştırma genellikle düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilir rağmen ampirik olarak PFV intasome montaj 4 ˚C verimsiz olduğunu bulduk. Bunun yerine, derleme diyaliz 18-22 ˚C aralığında olmalıdır. Rekombinant bakteriyel nükleaz7,8kirletici ücretsizdir PFV inç kullanmak önemlidir. Son olarak, vDNA inç sayısına oranı derleme önemli bir faktördür. Protein konsantrasyon başlangıç burada önerilen daha düşükse, vDNA toplama orantılı olarak azalmıştır gerekir. O PFV intasomes daha düşük konsantrasyonlarda montajını mümkün olmakla birlikte, kompleksleri yeterli konsantrasyon sn ayırma sırasında algılama için olsa gerek.
Bu yöntem PFV intasomes etiketli veya etiketsiz vDNA ile kullanılabilir. Biz vDNA verimli bir şekilde fluorophore veya biotin6ile etiketli bulduk. Diğer küçük molekül etiketleri de mümkün olabilir. Cy5 fluorophore söz konusu olduğunda, biz vDNA etiketli bu amaçla 10 kat azaltılmış en yüksek konsantrasyon ile monte intasomes verimini azaltır bulabilirsiniz. Ancak, dahili olarak vDNA etiketli Cy5 etiketlenmemiş vDNA eşdeğer bir verim vardır. Bu derleme yöntem de nokta mutasyonlar veya kesilme mutasyonlar PFV inç4ile kullanılabilir. PFV inç inhibe klinik inç tarafından transfer inhibitörü (OYNARDIM) ilaçlar HIV-1 inç hedefleme strand, bu PFV intasomes INSTIs3mekanizması çalışmaya kullanmak mümkündür. Buna ek olarak, HIV-1 inç ATLATAMAZ dayanıklı bazı mutasyonlar PFV inç, çalışmalar Mühendislik PFV intasomes ile ilaç direnci sağlayan korunmuş kalıntılarında oluşacak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser NIH AI099854 ve AI126742 için anahtar tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 - 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
