Summary
Rekombinant retroviral integrase og DNA oligomerer efterligne viral DNA ender kan danne en enzymatisk aktive kompleks kendt som en intasome. Intasomes kan anvendes til biokemiske, strukturelle og kinetiske studier. Denne protokol detaljer om, hvordan at samle og rense prototype skummende virus intasomes.
Abstract
A definere funktion og nødvendigt skridt af retrovirus livscyklus er integrationen af det virale genom i vært genom. Alle retrovira indkode et integrase (IN) enzym, der katalyserer den kovalente sammenføjning af viral til vært DNA, der er kendt som strand overførsel. Integration kan være modelleret i vitro med rekombinant retroviral IN og DNA oligomerer efterligne enderne af det virale genom. For at sammenfatte tættere integration reaktion, der opstår i vivo, integration er komplekser samlet fra rekombinante IN og syntetiske oligomerer ved dialyse i en reduceret saltkoncentration buffer. At integrere komplekse, kaldes en intasome, kan blive renset ved størrelse udstødelse kromatografi. I tilfælde af prototype skummende virus (PFV), intasome er en tetramer af IN og to DNA oligomerer og er let adskilt fra monomere IN og gratis oligomer DNA. Integration effektiviteten af PFV intasomes kan analyseres under en række forsøgsbetingelser til bedre at forstå dynamikken og mekanik af retroviral integration.
Introduction
Integration af det virale genom i vært genom er et obligatorisk trin i livscyklussen for alle retrovira1. Viral enzym integrase (IN) katalyserer den kovalente sammenføjning af hver ende af det virale DNA genom til værten DNA. Under en cellulær infektion, er i en del af en pre integration kompleks, der medierer integration. Rekombinant i kompleksbundet med dobbelt strandede DNA oligomerer efterligne de virale DNA ender kan også udføre integration i en target DNA in vitro-2. En fælles integration assay i vitro udnytter en supercoiled plasmid som mål-DNA. Integration af både virale DNA oligomerer (vDNA) til plasmidet resulterer i en lineær produkt og kaldes samordnet integration (figur 2A). Integration assay in vitro- kan der også fremstilles produkter med kun én vDNA kovalent tilsluttet target plasmid resulterer i en afslappet cirkel. Denne halv-site integration produkt ser ud til at være en artefakt af assay in vitro.
Rekombinant i og vDNA kan udføre integration i vitro, men de er ikke ideel reagenser til undersøgelse af dynamikken eller struktur af integration komplekser når monomere IN ville skjule relevante visualisering. Renset integration komplekser, eller "intasomes," er påkrævet for dynamisk enkelt molekyle analyse eller strukturelle studier. PFV i og vDNAs kan samles ved dialyse fra en relativt høj saltkoncentration buffer til en lavere saltkoncentration3,4. Under dialyse, en bundfaldet former. Denne opløsning er fjernet fra dialyse og salt koncentrationen er øget. Den højere salt koncentration solubilizes bundfald indeholdende PFV intasomes. Intasomes er derefter renset ved størrelse udstødelse kromatografi (sek). Rekombinant prototype skummende virus (PFV) IN har vist sig at eksistere som en monomer i løsning ved koncentrationer op til 225 µM5. SEK fraktionering adskiller effektivt PFV intasomes (225.5 kDa), som omfatter en tetramer af PFV i og to vDNAs, fra monomere PFV i (44,4 kDa) og gratis vDNA (24.0 kDa). PFV intasomes kan fryses og bevare integration aktivitet i mindst seks måneder efter opbevaring på-80 ˚C.
Rekombinante PFV intasomes kan også ændres for at medtage i aminosyre udskiftninger eller trunkering mutationer eller vDNAs mærket med fluorophores eller biotin4,6. De renset PFV intasomes udføre let integration i en mål-supercoiled plasmid DNA i vitro. Bulk biokemiske integration assays med intasomes kan afprøve virkningerne af i mutationer i hæmmere eller andre kemiske tilsætningsstoffer. Biotinylated intasomes kan bruges til at probe affinitet med nukleinsyrer eller proteiner. PFV intasomes er funktionelle ved omgivende temperatur giver mulighed for enkelt molekyle mikroskopi analyse af magnetiske pincet til at måle tid mellem sammenføjning af to vDNA ender eller total interne reflection fluorescens at visualisere intasome søgning på mål DNA6. Desuden var PFV intasomes først til at være strukturelt karakteriseret væsentligt påvirker inden for retroviral integration3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udglødning af vDNA
- Kombiner 1 X 10 Buffer (10 X 10 lager: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 µM Oligo 1 (5' ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3', 100 µM stock) og 10 µM Oligo 2 (5' CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3', 100 µM lager) i en afsluttende bind af 1,5 mL . Alikvot 25 µL til Tres 0,2 mL polymerase kædereaktion (PCR) rør.
Bemærk: Afhængigt af programmet, oligomerer kan ændres med fluorophores eller tags ved 5'-enden af Oligo 2 eller som en indre amino-T på base 13 fra 5'-enden af Oligo 1. Modificerede oligomerer bør renses af high-performance væskekromatografi (HPLC) før udglødning. Vi har fundet, at 5'-enden Cy3 eller Cy5 fluorophore mærkning af Oligo 2 reducerer intasome forsamling effektivitet 10-fold. Interne fluorophore mærkning mindsker ikke forsamling effektivitet. - Bind, ved hjælp af en thermocycler med følgende tider og temperaturer: 1 cyklus på 94.0 ˚C 3 min, 99 cyklusser på (94.0 ˚C 1 min, 93.6 ˚C 1 min) faldende begge temperaturer af 0,8 ˚C pr. cyklus (den sidste cyklus er 14,8 ˚C 1 min, 14.4 ˚C 1 min) , og opbevar ved 4.0 ˚C.
- Kombiner de udgloedning reaktioner fra alle tres rør. Belastning 500 µL til to 0,5 mL 3 kDa molekylvægt cutoff (MWCO) ultracentrifugal filter koncentration enheder. Koncentrere den udglødet vDNA ved centrifugering i en microcentrifuge på 14.000 x g i 10 min. ved stuetemperatur (RT).
Bemærk: Retentatet volumen skal være ~ 50 µL i hver koncentration enhed. - Kassér flow gennem. Tilføje 250 µL af den resterende udglødet vDNA til hvert filterenhed. Gentag spin og kassér flow gennem. Buffer exchange i TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) ved at vaske tre gange med 450 µL TE.
- Invertere filterenhed og spin på 1.000 x g i 2 min på RT. Den endelige retentatet volumen for hver filterenhed bør ~ 50 µL. Kombiner retentates og overførsel til en 1,5 mL skruelåg tube.
- Absorbansen 260-nm ultraviolet (UV) af vDNA. Brug denne værdi til at beregne den endelige kindtand DNA koncentration. Extinction koefficient (ε260) af denne vDNA er 622,803 cm-1 M-1 og dens molekylvægt er 23,972 Da. opbevares ved-20 ˚C.
2. Intasome forsamling
- Hvis det er muligt, udføre intasome forsamlingen i et lille værelse med en variabel termostat. Justere termostat til ca 18-22 ˚C.
Bemærk: Vores erfaring, intasome samling på 4 ˚C er ineffektive. - Forberede 1 L af dialyse buffer (20 mM Bis-tris propan, pH 7,5, 200 mM NaCl, 2 mM dithiothreitol (DTT), 25 µM ZnCl2) i et 2 L bægerglas med en røre bar på en røre pladen. Reagensglasset buffer i 18-22 ˚C plads til mindst 6 h.
- For at samle intasomes, kombinere 50 mM Bis-tris propan, pH 7,5, 500 mM NaCl, 120 µM PFV IN og 50 µM vDNA i en samlet maengde paa 150 µL.
Bemærk: Den PFV i bør være fri for kontaminerende nukleasen aktivitet7,8. Hvis koncentrationen af PFV i er alt for fortyndet til at rumme 120 µM IN i 150 µL volumen, så er det muligt at øge den endelige mængden til 200 µL. De kritiske faktorer for dette trin er at bevare den molære forhold mellem IN til vDNA (2.4:1) og har nok komplekst at visualisere under kromatografi. - Rense en ~ 10-cm lang stykke af 10 mm 6-8 kDa MWCO dialyse slanger og klip med dobbelt destilleret vand (ddH2O), eller den højeste renhed vand til rådighed. Klip ene ende af slangen.
Bemærk: Dialyse slanger skal håndteres med forsigtighed for at forhindre eventuel kontaminering fra lab rum. - Gøre 15 mL af dialyse slanger skyl buffer (50 mM Bis-tris propan, pH 7,5, 500 mM NaCl). Skylle indersiden af dialyse slangen tre gange med 1-2 mL skyl buffer. Fjern så meget af skyl buffer som muligt med en pipette og thin gel ladning tip.
- Hvis det er nødvendigt, bruge en ren barberblad eller skalpel til at skære dialyse slanger, således at en tynd gel ladning tip kan nå enden af slangen.
- Overføre intasome forsamlingen fra trin 2.3 til dialyse slangen med en pipette, og en tynd gel ladning tip. Klip den åbne ende af dialyse slangen, minimere mængden af luft indføres i slangen. Sted slanger til dialyse buffer.
- Dialyze overnatning (16-20 h) med blid omrøring så at slangen roterer, men er ikke i en vortex. Sikre, at dialyse slangen er neddykket og mobil. Efter ca. en time, observere en synlig bundfaldet inde i slangen.
Bemærk: Med Cy3 eller Cy5 fluorescently mærket vDNA, bundfaldet er mere indlysende. Dette gælder for både end mærket og internt mærket fluorescerende vDNA.
3. Intasome oploesning
- Forbered to brede bar pipette tips ved at fjerne 2-4 mm fra enden af en 200 µL spids med en ny razor eller skalpel klinge på en ren overflade.
Bemærk: Tips vil blive brugt i trin 3.3 og 3.5. - Fjerne dialyse slangen fra dialyse buffer. For at forhindre udvanding af intasome prøven med dialyse buffer, der forbliver i slutningen af slanger i nærheden af klippet, skal du bruge en mikropipette med en lille pipette tip til at fjerne eventuelle overskydende dialyse buffer. Fjerne klippet fra den ene ende af dialyse slangen.
- Brug en bred bore pipette tip fra trin 3.1 til at overføre prøven herunder bundfaldet inde i dialyse slangen til en 1,5 mL tube på is. Bemærk den samlede mængde af det nyttiggjorte materiale; det samlede volumen er typisk ~ 140 µL.
- Eksemplet med bundfaldet er på 200 mM NaCl; øge salt til en endelig koncentration på 320 mM NaCl ved at tilføje den passende mængde af en stamopløsning 5 M NaCl. For eksempel for en stikprøve af 150 µL, tilføje 3,9 µL 5 M NaCl og 1,1 µL ddH2O for en endelige mængden af 155 µL. overførsel-isspand med sample i et kølerum, der 4 ˚C.
- Brug en bred bore pipette tip fra trin 3.1 resuspend og solubilize bundfaldet af pipettering. Gentag hvert 20 min for mindst 1 h. observere, at de fleste af bundfaldet skal gå i løsning.
Bemærk: Pipettering for at resuspend bundfaldet kan stoppes, når det er klart, at bundfaldet ikke længere mærkbart reduceret mellem tidspunkter. Når vDNA ikke er mærket eller hedder internt, reduceret bundfaldet af ~ 90% baseret på visuel inspektion. Ved Cy5 slutningen mærket vDNA, er bundfaldet reduceret med kun ~ 20%; de fleste af bundfaldet med fluorophore ende mærket vDNA vil ikke solubilize. Mængden af bundfald, der er effektivt solubilized er variabel og bør bestemmes empirisk.
4. Intasome rensning
- Forberede 250 mL størrelse udstødelse kromatografi (SEC) kører buffer (20 mM Bis-tris propan, pH 7,5, 320 mM NaCl, 10% glycerol). Sterile filter buffer med en 0,2 µm filtrering enhed og opbevar ved 4 ˚C.
Bemærk: Alle rensning trin er udført i et koldt rum, 4 ˚C. - Reagensglasset en krydsbundet Agarosen sek kolonne (diameter = 10 mm længde = 300 mm; seng volumen = 24 mL; sample volumen = 25-500 µL; maksimalt pres = 1,5 MPa; udstødelse limit = 4 x 107 Da; adskiller molekylvægte, inden for mellem 5 og 5.000 kDa, se af Bordskåner erials) med SEC kører buffer med en væskehastighed på 0,4 mL/min.
Bemærk: Denne rensning kan tilpasses til forskellige størrelse udstødelse kolonner, hvis de er i stand til effektivt at adskille 300 kDa fra 44 kDa, såsom Superose 12 10/300 GL eller Superose 6 øge. Superose 12 10/300 GL har lavere opløsning, hvilket fører til flere overlappende toppe. Omvendt, Superose 6 øge har højere opløsning og tilbyder bedre adskillelse. - Der centrifugeres intasome prøven i en mikrofuge ved 14.000 x g i 10 min. ved 4 ˚C til at pille enhver resterende bundfald. Fjern forsigtigt supernatanten. Indlæse supernatanten til en 200 µL injektion løkke (slanger, der kan holde ~ 200 μl). Anvende prøven til kolonnen sek.
Bemærk: Mindre belastning mængder giver mulighed for større opløsning af sek. - Elueres med 25 mL sek kører buffer og indsamle 95 brøkdele af 270 µL. observere, at SEC kromatogrammet viser tre A280/A260 toppe (figur 1).
Bemærk: Først skal være en samlet (~9.0 - 11,5 mL eluering), efterfulgt af PFV tetramer intasome peak (~12.0 - 14,75 mL eluering) og PFV i monomer med gratis vDNA peak (~15.0 - 18,0 mL).
5. integration Strand overførsel Assay, brøkdel udvælgelse og opbevaring
- Kombiner 2 µL af hver intasome peak fraktion og 50 ng 3 kb supercoiled plasmid DNA (stock koncentration er 50 ng/µL) i reaktion buffer (10 mM Bis-tris propan, pH 7,5, 110 mM NaCl, 5 mM MgSO4, 4 µM ZnCl2, 10 mM DTT) i en endelig reaktion volumen af 15 µL. Der inkuberes ved 37 ˚C i 5 min.
- Omfatte en negativ kontrol med ingen tilsat PFV intasome. Stop reaktion med 0,75 µL proteinase K (20 mg/mL stamopløsning) og 0,75 µL SDS (10% stamopløsning). Der inkuberes ved 55 ˚C til 1 h. butik prøver efter behov på-20 ˚C til senere analyser.
Bemærk: Denne analyse er en kvalitativ vurdering af integration aktivitet. Intasome molære koncentration af hver fraktion bestemmes ikke forud for denne analyse. Brøker inkluderet i integration strand overførsel assay kan opbevares på is (herunder overnight opbevaring) indtil integration aktivitet er bekræftet og udvalgte fraktioner er aliquoted. Her bruger vi pMP2, en pUC19 afledte9. Vi har også med succes brugt 5.4 kb plasmidet pcDNA 3.1. Et plasmid, der kan løses til afslappet cirkel, lineær, og supercoiled former kan bruges som et mål for integration. - Forberede 120 mL 1% vægt pr. volumen (w/v) agarosegel i 1 X TAE buffer (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) med 0,1 μg/mL ethidium bromid (EtBr, 10 mg/mL stamopløsning)10. Smelte Agarosen løsning og hæld det i en 15 cm x 10 cm gel støbning bakke. Indsæt en 15-godt kam med 5 mm bred, 0,75 mm tyk brønde.
Bemærk: Smallere brønde give bedre band opløsning i forhold til 1,5 mm tyk brønde. - Tillad gel til at størkne ved omgivelsestemperatur. Fordyb gel i 1 X TAE med 0,1 μg/mL EtBr.
- Tilføje 3 µL 50% glycerol til hver integration reaktion fra trin 5.2. Indlæse hele reaktion volumen til gel. Indlæse 1 µL af 10 kb DNA størrelse markør (150 ng/µL stock koncentration) til baner på enten side af prøverne; med andre ord bør DNA størrelse markør flanke prøve baner.
- I en ydre lane, indlæse 6 µL Orange G farvestof (0,25% Orange G, 30% glycerol). Kør gelen i konstant spænding, 10 V/cm (100 V) ved stuetemperatur i 1 time, eller indtil Orange G farvestof foran når enden af gelen.
- Straks billede agarosegel med en fluorescerende scanner indstillet til at registrere EtBr (532 nm excitation, 610 nm emission filter). Hvis fluorophore mærket vDNAs blev anvendt, også billede med passende fluorophore indstillinger.
Bemærk: For eksempel til at opdage Cy5 mærket DNA, billedet ved hjælp af 633 nm excitation og 670 nm emission filtre. Samordnet integration produkter (CI, lineære DNA) skal køre rigtigt størrelse på ~ 3 kb, ureageret supercoiled plasmid (SC) skal køre hurtigere (~ 2 kb) og halv-site integration produkter (HSI, afslappet cirkel DNA) skal køre langsommere (~3.5 kb). Ureageret vDNA bør køre tro mod størrelse på ~ 40 bp. - Kvantificere bands i hver lane med imaging software7. Beregne brøkdel af DNA i hver lane, der er CI, HSI eller SC; vDNA er ikke inkluderet i denne beregning.
Bemærk: Integration effektivitet, eller en brøkdel af SC konverteret til en lineær produkt blev beregnet ved at dividere pixel volumen på samordnet integration produkter (CI) den samlede pixel volumen af tre bands (HSI + CI + SC). Hvis intasomes er fluorophore mærket, kan HSI og CI-produkter også være quantitated af fluorescens. - Vælg fraktioner, der har den mest samordnet integration aktivitet.
Bemærk: Vores erfaring, peak samordnet integration aktivitet falder sammen med protein peak identificeret som tetramert PFV intasomes. Måle A280 af hver af disse fraktioner og beregne den endelige intasome koncentration. Ε280 for en tetramer af vildtype PFV IN med to vDNAs beskrevet her er 908,339 cm-1M-1 og Molekylær vægt er 225.5 kDa. Koncentrationerne bør følge samme mønster som SEC kromatogrammet peak og i strand overførsel assay. - Distribuere hver fraktion i 5 µL delprøver og snap fryse i flydende kvælstof. Gemme alikvoter ved-80 ˚C. Brøker valgt til opbevaring er typisk mellem 200-600 nM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PFV intasomes er samlet fra rekombinante IN og vDNA. Efter samling, er intasomes renset af SEC (figur 1). Integration aktivitet af hver fraktion er analyseret med en supercoiled DNA mål og Agarosen gelelektroforese (figur 2). Denne gel er afbildet med en fluorescerende scanner indstillet til at registrere EtBr (og fluorophore, hvis fluorophore-mærket vDNA bruges). Brug billede analyse software, kan band pixel diskenheder bruges til at beregne integration effektivitet (figur 3). Brøker med den højeste integration effektivitet er snap nedfryses til senere brug. Frosne fraktioner bevarer integration aktivitet (figur 4), giver mulighed for lang sigt opbevaring af samlet intasomes. Nogen etiket molekyle og dens stilling inden for vDNA kan påvirke intasome forsamling effektivitet (figur 5).
Figur 1: størrelse udstødelse kromatogram. En PFV intasome forsamling var adskilt med en Agarosen sek kolonne. Denne kolonne giver mulighed for adskillelse af samlet (1), PFV intasome bestående af en tetramer af PFV i og to vDNA (2), og monomere PFV IN og vDNA (3). I dette eksempel følger vDNA med en indre Cy5 fluorophore etiket opdaget af 650 nm excitation. Y-aksen betegner optisk densitet (OD) i milli-absorbans enheder (mAU). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Integration assay af SEC fraktioner. (A) skematisk af integration strand overførsel reaktion. Venstre, tegneserie af en PFV intasome herunder en tetramer af i (blå cirkler) og to vDNA (tyk sort linje) og en target plasmid (tynde sorte streger). Supercoils (SC) af target plasmid er ikke trukket. Center, tegneserie af en halv-site integration (HSI) produktet når en vDNA har været kovalent tilsluttet target plasmid. Den forbinder reaktion introducerer en nick og afslapper supercoils. Højre, tegneserie af en samordnet integration (CI) produkt hvor to vDNAs har været forbundet med target-DNA. Denne integration produkt resulterer i en lineær DNA med vDNAs i enderne. (B) Supercoiled plasmid DNA blev føjet til hvert sekund brøkdel #49-55. Efter inkubationen integration reaktioner var deproteinated og adskilt af 1% Agarosen gelelektroforese indeholdende EtBr. Negativ kontrol var plasmid DNA med ingen protein (T). DNA-markører, størrelse er vist i kb. Supercoiled plasmid (SC), samordnet integration produkter (CI), halv-site integration produkter (HSI) og vDNA er angivet. (C) Agarosen gel blev scannet for tilstedeværelsen af Cy5. Kun vDNA, CI og HSI produkter er synlige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: kvantitering af integration assay. Agarosegel fra figur 2 blev scannet og kvantificeres for tilstedeværelse af både (A) EtBr og (B) Cy5. (A) For EtBr beregning, HSI, CI og SC band pixel diskenheder blev indhentet ved hjælp af gel analyse software. Integration effektivitet blev beregnet ved at dividere pixel volumen på samordnet integration produkter (CI) den samlede pixel volumen af alle tre bands (HSI + CI + SC). For eksempel pixelværdier i EtBr kanal for bands af brøkdel #49: 110565.2 SC, 25152.56 CI, og 6313.04 HSI. Den samlede DNA pixelværdi for brøkdel #49 er summen af disse værdier, 142030.8. Integration effektivitet er CI pixel volumen af 25152.56 divideret med den samlede DNA værdi 142030.8 equaling 0,18. (B) Cy5 CI band pixel diskenheder gengivelsesegenskaberne som arbitrære enheder. Brøker med peak integration aktivitet er individuelt aliquoted og frosne. I dette eksempel blev fraktioner #50-53 valgt. Delprøver er snap frosne med flydende kvælstof og gemt på-80 ˚C til fremtidig brug.
Figur 4: effekt af indefrysning på intasome aktivitet. Halvdelen af ét sekund brøkdel var flash frosset med flydende kvælstof, gemt på-80 ˚C for 1 time, og derefter langsomt optøet på is. De resterende halvdelen af SEC brøkdel blev holdt på is i et kølerum, mens den første halvdel var frosset og optøet. Intasomes blev testet for aktivitet uden (-) og med (+) fryse/optøning. Integration effektivitet blev målt som beskrevet ovenfor. (A) EtBr farves agarosegel af integration reaktionsprodukter. Supercoiled plasmid (SC), samordnet integration produkter (CI), halv-site integration produkter (HSI) og ureageret vDNA er angivet. DNA-markører, størrelse er vist i kb. (B) kvantitering af integration effektivitet fra EtBr billedet. Beregninger er beskrevet i figur 3 legenden. Der er intet tab af integration aktivitet efter nedfrysning og optøning. Den gennemsnitlige integration effektivitet er vist for 5 uafhængige forsøg med 2 intasome præparater. Fejllinjer angiver standardafvigelsen. Parret t-test analyser givet en to-sidede P = 0.011, hvilket tyder på at fryse/tø kan have lidt forbedret integration aktivitet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Label molekyle og holdning virkninger intasome forsamling. PFV intasome forsamlinger inkluderet vDNAs, der var uden etiket (rød), end mærket på Oligo 2 med Cy5 (blå), internt mærket på Oligo 1 med Cy5 (sort), eller end mærket på Oligo 2 med biotin (orange). Alle forsamlinger var adskilt med en kolonne med Agarosen sek. Y-aksen betegner OD i mAU. Kromatogrammer er repræsentative for mindst 2 uafhængige enheder af hver type, intasome. Ende mærkning reducerer udbyttet af PFV intasomes med Cy5 10-fold og biotin 1.8-fold. Slutningen Cy5 og biotin assemblies har mærkbart mere bundfaldet tilbage efter høje salt resolubilization (trin 3.5), hvilket resulterer i tilsyneladende tab af materiale på kolonnen størrelse udstødelse. Interne mærkning af vDNA med Cy5 fluorophore fører til en lige udbytte af intasomes som ikke-navngivet vDNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retroviral INs danne en multimeriske kompleks med viral genomisk DNA til at udføre integration og fortsætte den virale livscyklus. Antal i monomerer pr. intasome kan være tetramers, octamers eller eventuelt højere orden multimerer11,12,13,14. PFV intasomes er en tetramer af rekombinant med dobbelt-strenget DNA oligomerer, der efterligner viral genomisk DNA slutter3. Disse intasomes har været anvendt i undersøgelser af strukturelle og dynamiske3,5,13,14.
Samling af PFV intasomes opstår under dialyse fra en relativt høj saltkoncentration buffer til en lavere saltkoncentration. Dette resulterer i dannelse af et bundfald, som omfatter PFV intasomes. Intasomes er oploeses ved at øge den saltkoncentration. PFV i har vist sig at være monomere i koncentrationer op til 225 µM5. Komplekser er så isoleret fra monomere i og gratis vDNA af sek. Vi har ændret rensning af PFV intasomes til at omfatte glycerol i SEK buffer6. Tilsætning af glycerol tillader PFV intasomes at være frosset til fremtidig brug uden tab af aktivitet (figur 4).
Der er flere vigtige elementer i denne protokol. Selv om protein oprensning udføres ofte ved lave temperaturer, har vi fundet empirisk, PFV intasome forsamling er ineffektive på 4 ˚C. I stedet bør forsamling dialyse forekomme i vifte af 18-22 ˚C. Det er også vigtigt at anvende rekombinante PFV IN, der er fri for kontaminerende bakteriel nukleasen7,8. Endelig er forholdet mellem IN til vDNA en nøglefaktor for forsamlingen. Hvis starter i proteinkoncentration er lavere end anbefalet her, skal vDNA koncentration nedskrives forholdsmæssigt. Mens det er muligt at samle PFV intasomes ved lavere koncentrationer, skal komplekser på en høj nok koncentration til registrering under sek adskillelse.
Denne metode kan bruges til PFV intasomes med uden etiket eller mærket vDNA. Vi har fundet, at vDNA kan være effektivt mærket med en fluorophore eller biotin6. Andre små molekyle etiketter kan også være muligt. I tilfælde af Cy5 fluorophore finde vi herpå mærket vDNA reducerer udbyttet af samlet intasomes med den højeste koncentration reduceret 10-fold. Men internt Cy5 mærket vDNA har et tilsvarende udbytte til ikke-navngivet vDNA. Denne forsamling metode kan også bruges med punktmutationer eller trunkering mutationer af PFV i4. Da PFV i hæmmes af klinisk relevante IN strand overførsel inhibitor (INSTI) narkotika målretning HIV-1 i, det er muligt at bruge disse PFV intasomes for at studere mekanismen af INSTIs3. Derudover forekomme nogle INSTI resistente mutationer af HIV-1 i på bevarede rester i PFV IN, giver mulighed for undersøgelser af resistens med manipuleret PFV intasomes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH AI099854 og AI126742 til nøglen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 - 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
