Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

CRISPR-mediert reorganisering av Chromatin Loop struktur

Published: September 14, 2018 doi: 10.3791/57457
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 3, 4, 5, 1, 1, 1, 5, 3, 1,2,6
1Department of Dermatology, Program in Epithelial Biology, Stanford University School of Medicine, 2Program in Cancer Biology, Stanford University School of Medicine, 3Canary Center for Cancer Early Detection, Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, 4Department of Biology, Bridgewater State University, 5System Biosciences, 6Veterans Affairs Healthcare System
* These authors contributed equally

Summary

Chromatin looping spiller en viktig rolle i genreguleringen; imidlertid har det vært ingen teknologiske fremskritt som tillate selektiv og reversibel endring av chromatin looper. Her beskriver vi et kraftig system for chromatin loop reorganisering bruker CRISPR-dCas9 (CLOuD9), viste til selektivt og reversibel modulerer genuttrykk på målrettet loci.

Abstract

Nyere studier har tydelig vist at langtrekkende, tredimensjonal chromatin looping interaksjoner spille en betydelig rolle i regulering av genuttrykk, men om løkker er ansvarlig for eller et resultat av endringer i genuttrykk er fortsatt ukjent. Inntil nylig hvordan chromatin looping påvirker regulering av gen-aktivitet og cellulære funksjoner har vært relativt tvetydig, og begrensninger i eksisterende metoder å manipulere disse strukturene forhindret grundig gjennomgang av disse interaksjoner. For å løse denne usikkerheten, vi utviklet en metode for selektiv og reversibel chromatin loop reorganisering bruker CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Dynamikken i CLOuD9 systemet har blitt demonstrert av vellykket lokalisering av CLOuD9 konstruksjoner målrette genomisk loci å modulere lokale chromatin konformasjon. Viktigere, er også muligheten til å reversere indusert kontakten og gjenopprette endogene chromatin konformasjon bekreftet. Av genuttrykk med denne metoden oppretter kapasitet til å regulere cellular genuttrykk og understreker det store potensialet for anvendelser av denne teknologien å skape stabile de novo chromatin looper som påvirker markert gene uttrykk i sammenhenger av kreft og utvikling.

Introduction

Forholdet mellom chromatin folding i kjernen og bestemt organisasjonen i genomet har fått betydelig interesse i de senere årene, som det har vist seg å være tett forbundet med gene expression1,2. Mens nøyaktig forholdet mellom genet aktivitet og modulering av chromatin struktur er fortsatt uklart, det har vært hypotesen at samspillet mellom chromosomal kontakter som følge av dynamisk tredimensjonale chromatin organisasjon tjene en Gene regelverket3. Faktisk har slik effekt blitt godt demonstrert på menneskelige globin gene locus, der locus kontroll regionen (LCR) regulerer aktiviteten til globin gener i en utviklingsmessig bestemt måte ved å lage en chromatin loop mellom de to regioner4. Men i både denne og andre regioner er det uklart om chromatin løkker er en årsak eller konsekvens av endringer i genuttrykk.

Til nå har forble utfordringene i å studere fenomenet uløste. For eksempel involvert andre forsøk på inducing chromatin looper endrer lineær DNA sekvens eller kompliserte prosedyrer krever en overflod av bakgrunnskunnskap på bestemte elementer som lette looping5,6, 7,8. I tillegg, mens tidligere arbeid har foreslått at chromatin looper stasjonen genuttrykk i en bestemt og begrenset sammenheng7,er8, nivået på chromatin som kontinuerlig påvirker transkripsjon globalt usikker. Om virkningen av langtrekkende løkker på genuttrykk interesse har vokst kontinuerlig gjennom årene, vedvarer ubesvarte spørsmål om etablering og beholde chromatin kontakter for å endre genet aktivitet.

Teknologien som vi har konstruert benytter nuclease mangelfull gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) - CRISPR - forbundet protein 9 (dCas9), for å tillate bredt aktuelt målretting av alle genomic loci9. Denne teknologien eliminerer komplekse knyttet til endringer av lineær DNA sekvensen og er tilgjengelig uten betydelige forkunnskaper bestemt looping komponenter. Mest spesielt, er verktøyet universell og bredt aktuelt til chromatin looper i utvikling så vel som en rekke sykdommer som kreft. Kraften i CLOuD9 er demonstrert av reversibel endrer tabellstrukturen looper å effektivt modulerer genuttrykk.

Protocol

1. gRNA Design

  1. Velg et standard gRNA designverktøy for å utforme guiden RNAs10. Bruke komplementære parene av tidligere utviklet CLOuD9 konstruksjoner9 (dvs. minst 1 S. aureus (CSA) og 1 S. pyogenes (CSP) konstruere) for hvert eksperiment.
    1. I det valgte online design verktøyet, bruker du Protospacer tilstøtende motiv (PAM) rekkefølgen "NGG" med en guide lengde på 20 bp for CSP og PAM sekvens "NNGRRT" med en guide lengde på 21 for CSA.
    2. Velg guider basert på spesifisiteten score og design guider på begge tråder for å maksimere sjansene for å få en fungerende guide.
    3. Bestille 2 oligonucleotides per guide fra en oligo produsent: for den frem oligo, legge til "caccg" til 5' slutten av guide sekvensen, og for den omvendte oligo, legge til "aaac" til 5' slutten og "c" til 3 slutt før du bestiller.
  2. Først design 3-5 gRNAs for hvert område av interesse, spredt over en 250-1000 bp region. Vurdere gRNA målretting effektivitet som følger:
    1. Klone identifisert gRNAs i en aktiv Cas9 plasmider (se trinn 3) og transiently transfect i 293T celler (se trinn 4)11.
    2. Vokse celler for 2-3 d i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (penn strep), og deretter høste og ekstra genomisk DNA12.
    3. Forsterke målrettede regioner av polymerasekjedereaksjons (PCR). Kjører produkter på en 1,5% agarose gel og rense riktig band.
    4. Utføre en T7 endonuclease analysen som beskrevet i Guschin, et al. protokollen13,14.
      Merk: Effektiv guider er de fast bestemt på å kutte DNA på målområdet.

2. celle kultur

  1. Vedlikeholde celler i et sunt og aktivt dele tilstand.
    1. For K562s, kultur i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medier med 10% FBS og 1% penn strep.
      1. Vokse K562s i en 25 cm2 canted halsen kolbe for vedlikehold og justere celle tettheten til 400 000 celler per mL hver dag.
      2. Etter K562s har vært transduced med CLOuD9 konstruerer, legge 2 µg/mL puromycin og 100 µg/mL hygromycin til vedlikehold media.
    2. For 293Ts, kultur i Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS og 1% penn strep.
      1. Vokse 293Ts i 10 cm2 plater og dele når confluent.

3. plasmider forberedelse og gRNA innsetting15

Merk: Plasmider kart er tilgjengelig i vedlegg primere benyttet i eksempel eksperimenter er tilgjengelig i supplerende tabell 1.

  1. Mix 5 µg av den lentiviral CRISPR plasmider med 3 µL av BsmBI, 3 µL av alkalisk fosfatase, 6 µL av 10 x Buffer og 0,6 µL av nylagde 100 mM DTT. Bringe det totale volumet til 60 µL med ddH2O og ruge på 37 ° C i 30 min å fordøye og dephosphorylate plasmider.
  2. Gel rense fordøyd plasmider og elute i ddH2O.
  3. Mix 1 µL av parede guider på 100 µM med 1 µL av 10 x T4 Ligation Buffer, 6,5 µL ddH2O og 0,5 µL T4 PNK, nå 10 µL totalt volum. Ruge på 37 ° C i 30 minutter, deretter 95 ° C i 5 minutter, deretter rampe ned 25 ° C på 5 ° C/min.
    Merk: Dette vil anneal par guider.
  4. Fortynne glødet guider (fra trinn 3.3) 1:200 i ddH2O.
  5. Mix 1 µL av fordøyd plasmider fra trinn 3.2 med 0,5 µL av fortynnet ligated guider fra trinn 3.4, 2,5 µL av 2 x Buffer 1 µl av ddH2O og 0,5 µL av Ligase, å gjøre en 5.5 µL totale reaksjon. Inkuber dette ved romtemperatur for 10 min å ligate guider til BsmBI fordøyd plasmider.
  6. Den nylig ligated plasmider fra trinn 3.5 forvandle Stbl3 bakterier og forsterke bruker noen plasmider forberedelse metode.

4. lentivirus produksjon

  1. Antall 750.000 293T celler per brønn for seks brønnslisser plate ved hjelp av en hemocytometer og frø dem i DMEM med 10% FBS og 1% penn strep. Bruk en brønn for hver konstruksjon.
  2. 24 timer etter seeding, endre media til frisk antibiotika uten DMEM med 10% FBS.
  3. I en tube, fortynne 11 µL av lipid-baserte transfection reagensen med 150 µL av OptiMEM medium, per reaksjon11.
  4. I en separat tube, fortynne 2 µg av CLOuD9 lentiviral vektor plasmider fra trinn 3.6, 0,35 µg pMDLg/pRRE, 1 µg av pRSV-Rev og 0,65 µg av pMD2.G med 150 µL av OptiMEM medium, per reaksjon11.
  5. Hver reaksjon, legge til utvannet lentiviral plasmider blandinger utvannet lipid-baserte transfection reagensen på en 1:1 ratio og ruge for 5 min11.
  6. Legge til hele volumet av hver blandet kompleks fra trinn 4.5 i de respektive brønnene antibiotika uten 293T cellene fra trinn 4.2.
  7. 48 timer senere, samle viral produksjon medier av pipettering i en fersk rør og spinn ned på 300 x g i 5 min. Etter sentrifugering, flytte nedbryting slik frisk fjerne gjenværende celle rusk.
  8. Bruke viral produksjon mediet umiddelbart for Albin på målcellene eller fryse-80 ° c for fremtidig bruk.

5. lentivirus signaltransduksjon celler

  1. Legge til 250 µL av hver viral konstruksjon av interesse (består av supplerende CLOuD9 plasmider) i en 15 mL konisk rør som inneholder 80 000 celler for programmet CLOuD9.
  2. Bringe det totale volumet av media i hver konisk til 1 mL med antibiotika-frie medier, og legge til polybrene en siste konsentrasjon av mellom 1-8 µg/mL (maksimal konsentrasjon av polybrene tolerert av cellen utnyttet må bestemmes eksperimentelt).
  3. Spin celler 800 x g i 30 min ved romtemperatur, deretter resuspend av pipettering uten å fjerne viral nedbryting. Flytte hele cellen suspensjon til en celle kultur plate.
  4. 24 timer etter transduction, spin celler ned på 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur.
  5. Sug opp viral nedbryting og resuspend celler i vanlig celle kultur medier.
  6. Legge til puromycin (1 µg/mL for 293T celler) og hygromycin (25 µg/mL for 293T celler) i celle kultur medium å velge for dobbelt transduced celler på dagen. Eksperimentelt Bestem de aktuelle konsentrasjonene av puromycin og hygromycin for en gitt celle før begynnelsen eksperimenter.
  7. Holde celler i utvalget medier for minst 3 d før nedstrøms eksperimenter og vedlikehold i valg-media for varigheten av alle eksperimentene.

6. celle Dimerization og vask ut

  1. Legg til 1 mM Abscisic Acid (ABA) eller et tilsvarende antall dimethyl sulfoxide (DMSO) for kontroller til cellekultur til dimerize CLOuD9 valgt og transduced celler. Bruke ABA innen 6 måneder etter kjøpsdato, holde kaldt og beskytte den mot lys gjennom bruk. 2 mM ABA kan utnyttes hvis nødvendig.
    1. Endre media daglig for å gi frisk ABA (eller DMSO for kontroller) for varigheten av eksperimenter.
      Merk: Ingen grense for lengden på dimerization er ennå observert.
  2. Omvendt dimerization gjennom fjerning av mediene som inneholder ABA og vaske celler med nok fosfat bufret saltvann (PBS) til å dekke overflaten av platen, to ganger. Deretter kultur cellene i ABA-frie medier å opprettholde en un dimerized tilstand.

7. Immunoprecipitation og Co-immunoprecipitations

Merk: Kontroller alle buffere friskt og umiddelbart før bruk.

  1. Etter at dimerization eksperimenter, samle Nedspinning celler, og Sug opp nedbryting.
  2. Krysskobling og Frys ned celler
    1. Gjør en frisk lager av 1% formaldehyd i PBS ved romtemperatur bruker materiale. For hver 2 millioner celler, forsiktig resuspend med 1 mL 1% formaldehyd ved romtemperatur for nøyaktig 10 min, mens rotere.
      Merk: Bruk en minimum mengde 10 mL for crosslinking mindre enn 10 millioner celler.
    2. Slukke crosslinking med tillegg av glysin til en siste konsentrasjon av 0.125 M, etterfulgt av inkubasjonstiden for 5 min i romtemperatur, mens rotere.
    3. Nedspinning celler og vask 1-2 x med iskald PBS. Cellen pellets kan deretter fest frosset i flytende nitrogen og lagret på-80 ° C eller brukes umiddelbart.
      Merk: Varmen vil reversere formaldehyd krysskoblinger. Hvis styrtet, kan celler lagres direkte i-80 ° C uten fest fryse.
  3. Forberede antistoff/perle konjugert
    Merk: Optimalisere betingelser for valgte antistoff (dvs, teste ulike lysis bufferne for cellen lyse og utføre IP) kan være verdt. To vanlige buffere, Farnham lyseringsbuffer og endret RIPA buffer, kan ha en betydelig effekt på IP effektiviteten og sonication effektivitet. Alle buffer komposisjoner kan finnes i Tabell for materiale. I tillegg må du huske at chromatin sonication kan ta flere timer å fullføre.
    1. Resuspend perler av vortexing kort som passer til det valgte antistoffet.
    2. Overføre en passende mengde perler for eksperimentet til en 1,5 mL tube. Som et utgangspunkt, kan du bruke 20 µL av perler for hver 1 µg antistoff. Ikke Legg antistoff ennå.
      Merk: Bruk 10 µg antistoff med 200 µL av perler for 1 mg av totale lysate som utgangspunkt, med mindre det er kjent at antistoffer er mer eller mindre effektiv enn dette skulle tilsi. For lav overflod proteiner må dette forholdet bli justert.
    3. Hvis bruker Farnham lyseringsbuffer, vask 3 x IP fortynning buffer. Hvis bruker RIPA lyseringsbuffer, vaske 3 x i RIPA lyseringsbuffer.
    4. Resuspend perler i et siste volum på samme bufferen fra trinn 7.3.3-versjonen (IP fortynning eller RIPA buffer) som > 1 x og < 5 x opprinnelig mengdene. dvs. 100 µL første perle volum, bruke mellom 100 og 500 µL siste rørets volum.
    5. Legge til antistoff vasket perler på en passende konsentrasjon. For en god HA eller flagg mot IP CLOuD9 konstruksjoner, bruke antistoffer på 1:50 (µg protein: µg protein lysate) og Inkuber mellom 8 + h og overnatting på 4 ° C, mens rotere. Alternativt ruge for 2-4 h ved romtemperatur.
    6. Fjerne nedbryting fra perler og kast.
    7. Vask perler 3 x med vaskebuffer.
    8. Resuspend i en minimal mengde bufferen benyttes for overnatting inkubasjon med antistoffer (IP fortynning eller RIPA buffer). Holde kaldt til kombinert med protein lysate.
  4. Sonicate Chromatin
    1. Først lyse cellene med tillegg av hevelse buffer celle pellets på is 10 min, flicking celler hver par minutter å hindre settling.
      Merk: Vanligvis 500 µL hevelse buffer legges til 25 millioner celler og skalert derfra, men gjør ikke bruk mindre enn 500 µL buffer for < 25 millioner celler.
    2. Dounce manuelt både klokken og mot klokken, 13 x hver.
    3. Så spinn kjerner ned ved 4 ° C i 5 min på 1500 x g. Sug opp nedbryting helt og gjenta for å fjerne gjenværende nedbryting, så veier celle pellet i mg.
    4. Legge til protease hemmer kjerner lyseringsbuffer (Farnham buffer eller RIPA buffer, ovenfor, velge en).
    5. Legge til 10 x antall kjerner lyseringsbuffer pelleted kjerner til resuspend (for eksempel legge til 1 mL av kjerner lyseringsbuffer til 0.100 g pellets). Kort vortex og lyse etter 10 min på is.
      Merk: Vær oppmerksom på størrelsen på sonication røret. Ideelt er ofte < 1 mL, så prøver må deles hvis pellets er svært store.
      1. For Co-IP, sonicate kjerner kort for å solubilize materiale og slukke SDS til et nivå som tillater immunoprecipitation med 2-3 mengder fortynning buffer, deretter fortsette å gå 7.4.6. Legge til flere fortynning buffer for å redusere konsentrasjonen av SDS svært følsomme antistoffer.
        NOTE: Opphøre sonication når lysate fjerner; endres fra en ugjennomsiktig/gjennomskinnelig hvitt til helt gjennomsiktig. Holde prøver så kald som mulig og ikke over sonicate.
      2. For ChIP, grundig sonicate DNA for å få 150-1000 bp DNA fragmenter, så fortsette å gå 7.4.6.
    6. Spinne ut uløselig materiale med maksimal hastighet for 10 min på 4 ° C.
    7. Overføre løselig materiale til en frisk rør.
    8. For Co-IP, måle konsentrasjonen av protein og videre til rullegardinmenyen i trinn 7.5.
    9. Fjerne en 10 µL aliquot av ChIP, fjernet lysate og legge til 40 µL IP elueringsbufferen og 6 µL 5 M NaCl som totalt 56ul. Kok i 15 minutter til 95 ° C, legge 5-10 µL av 3 M NaOAc pH 5 og rydde opp i en PCR rensing kolonne. Måle konsentrasjonen av DNA ved å måle absorbansen på 260 nm og standardisere over prøver. Deretter videre til rullegardinmenyen i trinn 7.5.
      Merk: Ekstra lysate kan snapin frosset ved-80 ° C og brukes senere, men får beste resultater fra friskt lysate. Hvis fryser, ikke fryse/tine lysate mer enn én gang.
  5. Rullegardinmenyen
    1. Overføre en passende mengde protein lysate til en frisk rør. Hvis bruker Farnham lyseringsbuffer, fortynne i 2.1 mengder IP fortynning buffer (over).
    2. Avsatt 100 µL av nedbryting for input kontroll og lagre på 4 ° C før neste dag.
    3. Legge til bead/antistoff konjugert fra trinn 7.3.8 prøver nå.
    4. Rotere samples ved 4 ° C over natten og sikre det er nok volum for flytende bevegelse i 1,5 mL rør.
  6. Vask og Elute
    1. Etter natten rotasjon, lagre nedbryting som ikke-bindende brøken. Deretter perler vaske 3-5 x IP fortynning buffer.
    2. Forberede IP elueringsbufferen i romtemperatur, uten hemmere.
    3. Elute komplekser med 50 µL elueringsbufferen ristet på en vortex ved 67 ° C i 15 min. overføring elueringsrør slik ny og gjenta med en annen 50 µL. kombinere begge for en totalt 100 µL elueringsrør.
      Merk: Hvis det er for mye bakgrunn fra denne elueringsrør prosedyren, varme kan reduseres eller eliminert i risting/inkubasjon. Dette vanligvis reduserer avkastningen av målet protein, men betydelig redusere bakgrunnen.
  7. Omvendt krysskoblinger ved 67 ° C i > 4 h.
    Merk: Dette er ikke strengt nødvendig for co IPs, men kan være nyttig.
    1. For Co-IP, for å sikre full dimerization mellom mål av interesse, kjøre eluates på SDS side gel og sonde med antistoffer mot HA koden eller flagg koden, som indikert, alle på 1:1000. Fortsett til trinn 8.
    2. For ChIP-qPCR, for å sikre riktig lokalisering og målretting av hver CRISPR-dCas9 komponent, ren elueringsrør produktet på en kolonne og elute i 10 µL. utføre sanntid kvantitative polymerasekjedereaksjons (qPCR) av renset DNA. Primere benyttet i presenteres dataene finnes i supplerende tabell 1. Fortsett til trinn 8.

8. RNA utvinning og kvantitative PCR

  1. For å undersøke CLOuD9-indusert endringene i genuttrykk, først isolere og rense totale RNA fra både kontroll cellen pellets og dimerized celle pellets.
  2. Gjør komplementære DNA (cDNA) fra den renset RNA av omvendt transkripsjon17 og utføre qPCR analyser. Primere finnes i supplerende tabell 1.

9. kromosom konformasjon fange analysen

  1. Søk8å observere endringer i frekvensen av genomisk loci kontakter indusert av CLOuD9, utfører kromosom konformasjon fange (3C).
  2. Kvantifisere 3C ligation produkter i to sett med duplikater for hver av tre biologiske gjentak av kvantitative sanntid PCR. Normalisere prøver til 3C signaler fra tubulin locus. Primere finnes i supplerende tabell 1.

Representative Results

CLOuD9 induserer reversibel β-globin promoter-LCR looping. Riktig bruk av CLOuD9 induserer reversibel kontakt av komplementære CSA og CSP CLOuD9 lager gjennom tillegging eller fjerning av ABA til celle kultur medier (figur 1a). CSA og CSP konstruksjoner (figur 1b) er lokalisert til riktig genomisk områder ved å bruke standard CRISPR gRNAs. Vurderer den store dokumentasjonen av menneskelig globin locus samt hyppige chromosomal folding og omorganisering som oppstår det under utvikling, denne regionen ble valgt å demonstrere nytten av CLOuD9 systemet. I tillegg ble K562 celle linjen valgt fordi det har vist konsekvent uttrykke høye nivåer av fetal γ-globin genet, i motsetning til β-globin genet som uttrykkes vanligvis i sunn voksen erythroid avstamning celler. Ved å bruke K562 cellene, kan muligheten for CLOuD9 å endre genuttrykk undersøkes ved å forsøke å gjenopprette uttrykket av β-globin genet i denne cellen linje.

Før induksjon av dimerization, chromatin immunoprecipitation-kvantitative PCR (ChIP-qPCR) ble benyttet for å sikre nøyaktig lokalisering og målretting av hver CLOuD9 komponent (supplerende figur 1). I tillegg bekreftet co-immunoprecipitation (Co-IP) med og uten ABA CSA og CSP dimerization i nærvær av ligand samt Reversibilitet i fravær av ligand (figur 1 c og supplerende figur 2). 24 h etter ABA, større kontakt mellom β-globin og LCR dukket opp målt ved kromosom konformasjon fange (3C) i cellene med begge dimerization deler, men ikke kontrollene som inneholder bare to CSA eller CSP konstruksjoner, dermed validere den spesifisitet av chromatin endringen for målrettede nettsteder (figur 1 c og supplerende tall 3,4). Opprette LCR-β-globin interaksjon helt eliminere ikke endogene LCR-globin kontakten, men i stedet lagt til den opprinnelige kontakten, som tidligere rapportert8. Økninger i β-globin/LCR kontakter ble observert i opptil 72 timer med dimerization, uansett det pressepenger av området i målrettede LCR og β-globin promoter regionen (supplerende tall 5,6). Til slutt, Reversibilitet av systemet ble bekreftet med 3C etter fjerner ABA, som viste en fullstendig fornyelse av endogene konformasjon (figur 1 d og supplerende tall 3-6).

Vi vurderte at suksessen vist i K562 cellene kan være et resultat av globin locus plassering i en region euchromatin (figur 1 d), så en annen celle linje ble benyttet for å utforske denne ideen. CLOuD9 systemet ble brukt HEK 293T celler i områder som er heterochromatic og ikke uttrykke globin gener (figur 1e). Resultatet var lik hva ble observert i K562s; flere β-globin LCR foreninger ble målt med 3C etter 24 timer med ABA (figur 1e og supplerende figur 3), gir bevis for CLOuD9's robust evne til å fungere i ulike mobilnettet miljøer, til tross for den opprinnelige tilstanden for chromatin eller konformasjon.

Ekstra loci ble testet for å sikre bred anvendelse av CLOuD9, inkludert Oct4 arrangøren og en distale 5' enhancer i 293T celler. Tidligere har det vært noen synlig Oct4 uttrykket i denne cellen linje og videre, ingen endogene kontakter beskrevet. Bevis på Oct4 uttrykk i embryonale stamceller som følge av kontakt med den distale 5' enhancer motivert dette eksperimentet, og samme utfallet ble observert på β-globin locus18. Kontakt mellom Oct4 distale enhancer og formidler ble identifisert i CLOuD9 aktivert celler, men ikke kontroll cellene (figur 1f). I tillegg ble det observert at Oct4 selskapet samt distale 5' enhancer samhandling også bedt en 3 enhancer kontakt arrangøren av Oct4. Denne hendelsen er konsekvent med bevis at 3 enhancer samhandler med Oct4 promoter/5 ' distale enhancer komplekse under endogene genet aktivisering10.

CLOuD9 induserer sammenheng konkrete endringer på genet loci. Etter bekrefter at CLOuD9 systemet faktisk induserer chromosomal kontakter på genet loci, søkte vi undersøke looper effekt på genuttrykk. Det er dokumentert at transkripsjon for globin og Oct4 gener er betinget av kontaktene mellom LCR og globin gene loci og mellom den distale 5' enhancer og Oct4 promoter, henholdsvis1,11. Derfor hypotese vi som bruker CLOuD9 systemet kjøre chromatin loop formasjonen i hvert av disse områdene vil resultere i overbevisende genuttrykk.

I begge loci, RT-qPCR vist at ABA indusert chromatin looper kjørte økninger i Oct4 uttrykk i 293T celler og β-globin uttrykk i K562 celler, men ikke i 293Ts (figur 2a). Men tillegg av ABA til celle kultur for så lite som 24 h økt β-globin uttrykk betydelig, uttrykk fortsatte å øke jevnt opptil 72 timer og var reversibel på ABA bleke (figur 2a). Alle K562 unntatt kontrollene fulgte denne trenden, uansett hvor dimerization komponentene ligger i de LCR og β-globin promoter områdene (figur 2a og supplerende tall 7,8). Støtte for disse funnene korresponderte ChIP-qPCR H3K4me3 og RNA Pol-II på β-globin locus i K562s og 293Ts med observert endringer i transkripsjon (figur 2 c-f).

CLOuD9 etablerer stabil chromatin looper. Selv om kortsiktige loop induksjon med CLOuD9 tydelig fulgte forventninger, om langsiktig induksjon av looping hadde differensial effekter forble overholdes. For å undersøke dette, ble celler kultivert i nærvær av ABA 10 dager. Mens både K562s og 293Ts utstilt økt kontakt frekvens mellom β-globin locus og LCR i forhold til kontroller (figur 3a, b og supplerende tall 9,10), var endringer i β-globin uttrykk fremdeles bare observert i K562 celler (Figur 3 c). Interessant, men det ble observert at langsiktige dimerization i K562s, der transkripsjon var sterkt upregulated, var ikke lenger reversibel (figur 3a og supplerende tall 9-11). Men induserte i 293Ts, der ingen endring i transkripsjon ble observert etter langsiktige dimerization, endringer i chromatin kontakter forble reversibel (figur 3b og supplerende figur 9).

Total, bare en liten nedgang i genuttrykk ble observert etter 10 dager av ABA fjerning, som var betydelig høyere enn gene expression nivåer før dimerization (Figur 3 c). I tråd med dette K562 celler, men ikke 293T celler, viste vedvarende endringer i H3K4me3 og RNA Pol-II på β-globin locus av ChIP-qPCR, sammenlignet med kontrollene, selv etter 10 dager av ABA fjerning (figur 3d-f). Dermed indikerer våre resultater at stabiliteten i chromatin loopen innebærer mer bærekraftig genuttrykk.

Figure 1
Figur 1: CLOuD9 induserer reversibel β-globin promoter-LCR løkker. (a) tillegg av abscisic acid (ABA, grønn) gir to utfyllende CLOuD9 konstruksjoner (CLOuD9 S. pyogenes (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), rød og blå, henholdsvis) i nærheten, remodeling chromatin struktur. Fjerning av ABA gjenoppretter endogene chromatin konformasjon. (b) CLOuD9 konstruksjoner kombinerer CRISPR-dCas9 teknologi fra S. aureus og S. pyogenes med reversibel dimerizeable PYL1 og ABI1 domener. (c) tidslinje av CLOuD9 dimerization eksperimenter. (d) 3 C analysen måling β-globin locus hele crosslinking frekvenser i K562 celler etter 24 h behandling med ABA (rød) og påfølgende bleke (blå) viser Reversibilitet av indusert β-globin/LCR kontakter (markert i grått). Oransje pilspisser angi bestemte CLOuD9 konstruere målet områder. EcoRI fragment som inneholder overfølsomhet områder 1-4 av LCR (svart bar) ble brukt som regionen anker. Dens crosslinking ofte andre angitte EcoRI fragmenter (navn på grafen) ble vurdert. Den menneskelige β-globin gener og LCR overfølsomhet nettsteder er avbildet på bunnen av grafen med chromosomal posisjonskoordinatene. Data fra ChIP-seq H3K4me3 og H3K9me3 vise at dette området er euchromatic i K562s. (e) ligner reversible endringer i chromatin-strukturen er sett i HEK 293T celler, til tross for bevis fra H3K4me3 og H3K9me3 ChIP-seq data som globin regionen er heterochromatic i denne cellen. (f) 3 C analysen måle Oct4 locus hele crosslinking frekvenser i 293T i cellene etter 72 h behandling med ABA (rød) viser indusert Oct4/distale enhancer kontakter (markert i grått). Oransje pilspisser angi bestemte CLOuD9 konstruere målet områder. MboI fragment som inneholder Oct4 selskapet (svart bar) ble brukt som regionen anker. Dens crosslinking ofte andre angitte MboI fragmenter (navn på grafen) ble vurdert. Regionene for menneskelig Oct4 er avbildet på bunnen av grafen med chromosomal posisjonskoordinatene. Alle 3C resultatene ble innhentet fra minst tre uavhengige eksperimenter. 3C verdier var normalisert til tubulin. For β-globin, ble samhandling frekvenser mellom anker fragmentet og fragmentet omfatter β/HS fragmentet satt til null. For Oct4, ble samhandling frekvenser mellom anker fragmentet og en negativ kontroll fragment utenfor regionen Oct4 samspill satt til null. Feilfelt viser SD n = 3. Dette tallet er endret fra figur 1 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: CLOuD9 induserer sammenheng konkrete endringer i gene expression og chromatin tilstand. (a) CLOuD9-indusert chromatin løkker på β-globin locus resulterer i reversibel induksjon av β-globin uttrykk i K562s men ikke i 293Ts. betydning gitt i forhold til kontrollen behandlet celler. Tosidige student t-tester * P < 0,05, t = 3.418, df = 5; P < 0.0001, t = 10.42 df = 5; født ikke betydning. Feilfelt viser SD n = 3. (b) induksjon av Oct4 uttrykk ble observert i 293Ts etter CLOuD9-indusert løkker på samme locus. Betydning er gitt i forhold til kontrollen behandlet celler. Tosidige student t-tester * P < 0,05, t = 4.562, df = 2. Feilfelt viser SD (c) skjematisk av ChIP-qPCR primer steder langs β-globin gene kroppen. (d, e) ChIP-qPCR viser reversible endringer i H3K4me3 på β-globin locus i K562s men ikke i 293Ts etter CLOuD9-indusert løkker. Tosidige student t-tester * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Feilfelt viser SD (f) CLOuD9 mediert endringer i β-globin transkripsjon i K562s samsvarer med økningen i RNA Pol-II belegg over helheten av β-globin gene kroppen. Tosidige student t-tester * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Feilfelt viser SD Dette tallet er endret fra figur 2 i Morgan, Stefanie L. et al. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: CLOuD9 etablerer stabil chromatin looper som opprettholde robust genuttrykk etter langsiktige dimerization. (a, b) 3 C analysen viser at i K562s men ikke 293Ts, CLOuD9-indusert chromatin looping blir irreversibel etter 10 dager av ABA behandling, selv når ABA er fjernet for opptil 10 ekstra dager. Alle 3C resultater var oppnådd fra minst tre uavhengige eksperimenter. 3C verdier var normalisert til tubulin, og samhandling frekvenser mellom anker fragmentet og fragmentet omfatter β/HS fragmentet ble satt til null. Feilfelt viser SD n = 3. (c) Loop stabilisering i K562s resulterer i faste uttrykk for β-globin, selv etter 10 dager av ABA bleke. Ingen endringer i β-globin uttrykk er observert i 293Ts. betydning gitt i forhold til kontrollen behandlet celler. Tosidige student t-tester *** P < 0.0001, t = 5.963, df = 5; født ikke betydning (d) ChIP-qPCR viser økninger i H3K4me3 merker over β-globin locus svar på CLOuD9-indusert looping opprettholdes etter 10 dager av ligand bleke i K562s. tosidige student t-tester * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. (e) ingen betydelige endringer i H3K4me3 signaler følgende langsiktige dimerization ble observert av ChIP-qPCR i 293Ts. (f) økt RNA Pol-II belegget av β-globin locus etter langsiktige loop induksjon ble opprettholdt i K562s etter 10 dager av ligand bleke. Tosidige student t-tester * P < 0,05, ** P < 0,001, *** P < 0,0001. Alle feilfelt angi SD Dette tallet er endret fra Figur 3 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende figur 1: CLOuD9 konstruksjoner lokalisere til sine tiltenkte målet regioner. Chromatin immunoprecipitation og kvantitative PCR av CLOuD9 konstruksjoner viser riktig lokaliseringen å deres tiltenkte genomisk loci. Dette tallet er endret fra supplerende figur 1 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 2: CLOuD9 konstruksjoner reversibel førsteamanuensis i respons på ABA behandling. Co-immunoprecipitations demonstrere association of dCas9 proteiner følgende 72 h ABA behandling er reversert følgende påfølgende 72 h ligand bleke. Dette tallet er endret fra supplerende figur 2 i Morgan, Stefanie L. et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 3: kontroll behandling medfører ingen endringer i chromatin kontakter. Behandling med DMSO en kontroll agent, 24 timer medfører ingen endringer i endogene chromatin konformasjon av 3C i enten K562 celler eller HEK 293Ts. 3C verdier var normalisert tubulin og samhandling frekvenser mellom anker fragmentet og fragmentet omfatter β/HS fragmentet ble satt til null. Feilfelt viser SD. n = 3. Dette tallet er endret fra supplerende figur 3 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 4: kontroll CLOuD9 transduced celler viser ingen endringer i chromatin looping. Regissert to CLOuD9 konstruerer enten LCR eller arrangøren av β-globin induserer ingen vesentlige endringer i chromatin-strukturen av 3C etter ABA behandling i forhold til kontrollen behandling. 3C verdier var normalisert til tubulin, og samhandling frekvenser mellom anker fragmentet og fragmentet omfatter β/HS fragmentet ble satt til null. Feilfelt viser SD. n = 3. Dette tallet er endret fra supplerende figur 4 i Morgan, Stefanie L. et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 5: CLOuD9 chromatin looper er reversibel etter 72 timer dimerization. 3C analysen i K562s viser Reversibilitet av CLOuD9 indusert β-globin/LCR kontakter etter 72 timers ABA behandling. 3C verdier var normalisert til tubulin, og samhandling frekvenser mellom anker fragmentet og fragmentet omfatter β/HS fragmentet ble satt til null. Feilfelt viser SD. n = 3. Dette tallet er endret fra supplerende figur 5 i Morgan, Stefanie L. et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 6: CLOuD9 indusert β-globin/LCR looper ikke er påvirket av globin målområde. Regi CSA og CSP konstruerer til alternative regioner i LCR eller β-globin formidler resultatene i lignende reversible endringer i loop induksjon av 3C etter 72 timer ABA behandling. 3C verdier var normalisert til tubulin, og samhandling frekvenser mellom anker fragmentet og fragmentet omfatter β/HS fragmentet ble satt til null. Feilfelt viser SD. n = 3. Dette tallet er endret fra supplerende figur 6 i Morgan, Stefanie L. et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 7: CLOuD9 induserte endringer i genuttrykk opprettholdes uavhengig globin målområde. Regi CSA og CSP bygger til alternative regioner av β-globin selskapet og LCR har ingen innvirkning på induksjon av genuttrykk etter 72 timer med dimerization. Men mens noen innvirkning på styrken av genuttrykk følgende langsiktige (10 dag) dimerization ble observert, var høye nivåer av β-globin i forhold til kontrollen behandlet celler vedvarende følgende påfølgende ligand bleke 10 flere dager. Betydning er gitt i forhold til kontrollen behandlet celler. p < 0,001, t = 10.25, df = 5; p < 0,0001, venstre til høyre t = 8.697, df = 6, t = 40.31, df = 7; født ikke betydning. Alle feilfelt angi SD. Dette tallet er endret fra supplerende figur 7 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 8: kontroll CLOuD9 transduced celler Vis ingen endringer i β-globin uttrykk. Regissert to CLOuD9 konstruerer enten LCR eller arrangøren av β-globin induserer ingen vesentlige endringer i β-globin uttrykk etter ABA behandling i forhold til kontrollen behandling. Betydning er gitt i forhold til kontrollen behandlet celler. født ikke betydning. Dette tallet er endret fra supplerende figur 8 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 9: kontroll langtidsbehandling medfører ingen endringer i chromatin kontakter. Behandling med DMSO en kontroll agent, 10 dager medfører ingen endring i endogene chromatin konformasjon av 3C i enten K562 celler eller HEK 293Ts. 3C verdier var normalisert tubulin og samhandling frekvenser mellom anker fragmentet og fragmentet omfatter β/HS fragmentet ble satt til null. Feilfelt viser SD. n = 3. Dette tallet er endret fra supplerende figur 9 i Morgan, Stefanie L. et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende Figur10: langsiktig CLOuD9 indusert β-globin/LCR looper ikke er påvirket av globin målområde. Regi CSA og CSP konstruerer til alternative regioner i LCR eller β-globin formidler resultatene i tilsvarende vedvarende loop induksjon som demonstrert av 3C etter 10 dager av ABA behandling og 10 dager med påfølgende ligand bleke. 3C verdier var normalisert til tubulin, og samhandling frekvenser mellom anker fragmentet og fragmentet omfatter β/HS fragmentet ble satt til null. Feilfelt viser SD. n = 3. Dette tallet er endret fra supplerende Figur10 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende figur 11: CLOuD9 konstruksjoner irreversibelt knytte svar på ABA langtidsbehandling. Co-immunoprecipitations demonstrere irreversible association for CSA og CSP dCas9 proteiner etter 10 dager av ABA behandling og 10 påfølgende dager ligand bleke. Dette tallet er endret fra supplerende figur 11 i Morgan, Stefanie L. et al. 9. Klikk her for å laste ned dette tallet.

Supplerende tabell 1: liste over primer sekvenser for gRNAs, qRT PCR, 3C og ChIP qPCR. Denne tabellen er endret fra supplerende tabell 1 i Morgan, Stefanie L., et al. 9. Klikk her for å laste ned denne tabellen

Discussion

The Most avgjørende skritt i CLOuD9 chromatin looper er: 1) utforming eller bruker den riktige gRNAs, 2) endre media daglig på CLOuD9-transduced cellene, inkludert ABA eller DMSO 3) opprettholde friskhet av ABA og 4) utfører nøyaktig og nøye vurderinger av chromatin eksteriør.

Grensene for CLOuD9 bor. primært evne til å utforme guider målregion valgfrihet. Guide RNAs utføre den viktige oppgaven å lokalisere dCas9 komponentene til målet DNA områder å være dimerized og effekten av guider er basert på deres spesifikke målområdet. Uten riktig gRNA komponentene indusert CLOuD9 systemet ikke vil kunne danne reversibel looper. Således, ved å utforme flere guider for områder av interesse og spre guider over en region 250-1000 bp, minst en vellykket guide vil være sikret. Guide beliggenheten er også integrert nøyaktige resultater. Det er viktig å unngå guider i transkripsjon faktor bindende områder eller andre kritiske områder for å hindre bakgrunn effekter som opp eller ned regulering av transkripsjon. I tillegg kan nøyaktige plasseringen av den CLOuD9 konstruere litt påvirke transkripsjon av målet genet. Dette understreker viktigheten av å teste flere par av guider for hvert mål område, identifisere mest robuste paret for eksperimentelle formål. Videre, i hvert par Målrett mot regioner, CSA Konstruer bør rettes med gRNAs for S. aureusog CSP Konstruer bør rettes med gRNAs for S. pyogenes for målretting spesifisitet.

For å sikre nøyaktige resultater og riktig dimerization, er det også viktig å opprettholde friskhet av mobilnettet miljøene etter Albin på CLOuD9 konstruksjoner. Daglig media endre og tillegg av fersk dimerizer (eller kontroll) sikrer at de komplementære konstruksjoner vil forbli i nærheten og bevare den endrede chromatin konformasjon. Videre er garanterer ABA er fersk og har vært lagret riktig i henhold til produsentens protokollen (åpnet innen 6 måneder, holdt kaldt, beskyttet fra lys) avgjørende for å oppnå ekte resultater.

Spesielt ble ABA dimerizer for CLOuD9 brukt med ABI og PYL dimerization proteiner, snarere enn mer vanligvis benyttes FRB-og FKBP. Nødvendigheten av en rapalog for FRB/FKBP systemet ville ha begrenset anvendbarhet av CLOuD9, på grunn av giftigheten til kreftceller. Alternative ABI/PYL systemet omgås denne begrensningen, effektivt slik at CLOuD9 skal videre utilizable.

Kollektivt, har vi utviklet CLOuD9, en unik og robust teknologi som tvang men reversibel opprette kontakter mellom langtrekkende mål genomisk loci. Gjennom induserende chromatin looper, viser vi også at CLOuD9 kan brukes til å endre genuttrykk i riktig mobilnettet sammenheng. Tilpasningsevne teknologien tillater ubegrenset studiet av interaksjoner mellom noen to genomisk loci, uten forutgående kunnskap om løkker regioner eller looping mekanismer. I tillegg kan CLOuD9's unike demonstrert Reversibilitet videre undersøkelse av looping mekanismer i sykdom og utvikling. Mens på mål effektene av chromatin gjentakelse har vist klart, er det ennå ikke data tilbyr innsikt i effekten av off-målet løkker og påfølgende innvirkning på på målet løkkene.

Våre data viser bare noen programmer av dette verktøyet, men innebærer store underliggende ideen at chromatin ordningen er indikativ av genuttrykk. Vår teknologi kan brukes til å studere og avsløre nyansene av chromatin strukturen i genet regulering, og dermed bedre generell forståelse av rollen chromatin folding i transkripsjon av gener. En bedre forståelse av nyanser av transcriptional dynamics kan lede fram i forskning og behandling av kreft, arvelige sykdommer og medfødt lidelser, i som tydelig chromatin montering utvilsomt endrer gene expression20, 21,22,23. Senere arbeidet utnytte CLOuD9 teknologien vil belyse ytterligere detaljer om plasseringen og dynamikken i chromatin domener og hvordan de kjører folding å opprettholde stabil genuttrykk både utvikling og sykdom.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo og hele Wang laboratorium for kundestøtte og kritisk lesning av manuskriptet. S.L.M. har vært støttet i dette arbeidet gjennom NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) og National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. støttes av en Career-pris for medisinske forskere fra Burroughs Wellcome fondet, og er en Donald E. og Delia B. Baxter Foundation fakultetet lærd.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640  media Life Technologies 11875-119 For K562 cell culture
DMEM media Life Technologies 11995-065 1X, for 293T cell culture
lentiCRISPR v2 Addgene plasmid #52961 For CLOuD9 plasmid development
pRSV-Rev Addgene plasmid #12253 For lentivirus production
pMD2.G Addgene plasmid #12259 For lentivirus production
pMDLg/pRRE Addgene plasmid #12251 For lentivirus production
Lipofectamine 2000 Thermo Fisher Scientific 11668-019 For lentivirus production
anti-HA antibody Cell Signaling 3724 For immunoprecipitation
anti-Flag antibody Sigma F1804 For immunoprecipitation
DNeasy Blood and Tissue Kit Qiagen 69504 For DNA extraction
TRIzol Life Technologies 15596-018 For RNA extraction
RNeasy Kit Qiagen 74106 For RNA extraction
Superscript VILO Life Technologies 11754-050 For cDNA 
SYBR Green I MasterMix Roche 4707516001 For qPCR analysis
Light Cycler 480II Roche For qPCR analysis
anti-H3K4me3 antibody AbCam ab8580 For ChIP-qPCR
anti-RNA Pol-II antibody Active Motif 61083 For ChIP-qPCR
EDTA free protease inhibitor Roche 11873580001 For protein extraction
4-12% Tris Glycine gel Biorad Any size, For western blot
anti-Rabbit HRP antibody Santa Cruz sc-2030 For western blot
anti-mouse HRP antibody Cell Signaling 7076S For western blot
K562 and H3K293 ChIP-Seq data Encode ENCSR000AKU For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data Encode ENCSR000APE For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data Encode ENCSR000FCJ For ChIP-seq analysis
K562 and H3K293 ChIP-Seq data GEO GSM1479215 For ChIP-seq analysis
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10001D For immunoprecipitation
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Thermo Fisher Scientific 10004D For immunoprecipitation
RNA Clean & Concentrator-5 Zymo Research R1015 For RNA purification
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free Thermo Fisher Scientific 28908 For crosslinking
PX458 Plasmid Addgene 48138 Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 For PCR purification
FastDigest BsmBI Thermo Fisher Scientific FD0454 For cloning guide RNAs
FastAP Thermo Fisher Scientific EF0651 For cloning guide RNAs
10X FastDigest Buffer Thermo Fisher Scientific B64 For cloning guide RNAs
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704 For cloning guide RNAs
10X T4 Ligation Buffer NEB B0202S For cloning guide RNAs
T4 PNK NEB M0201S For cloning guide RNAs
2X Quick Ligase Buffer NEB B2200S For cloning guide RNAs
Quick Ligase NEB M2200S For cloning guide RNAs
Buffers
Farnham lysis buffer 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water
Modified RIPA buffer 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4
IP dilution buffer 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor
Wash buffer 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate
Swelling buffer 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40
Dilution buffer 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl
IP elution buffer 1% SDS, 10% NaHCO3  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krivega, I., Dean, A. Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).
  2. Matharu, N., Ahituv, N. Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease. PLoS Genet. 11, e1005640 (2015).
  3. Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data. Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).
  4. Kim, A., Dean, A. Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription. Mol Cells. 34, 1-5 (2012).
  5. Petrascheck, M., et al. DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo. Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).
  6. Ameres, S. L., et al. Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer. EMBO J. 24, 358-367 (2005).
  7. Deng, W., et al. Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor. Cell. 149, 1233-1244 (2012).
  8. Deng, W., et al. Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping. Cell. 158, 849-860 (2014).
  9. Morgan, S. L., et al. Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping. Nature Communications. 8, 13 July (2017).
  10. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148 (2016).
  11. Lipofectamine 2000 Reagent. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).
  12. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2006).
  13. Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302). , New England BioLabs. (2016).
  14. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).
  15. Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. , 83-87 (2014).
  16. RNeasy Mini Handbook. , QIAGEN. (2012).
  17. SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).
  18. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).
  19. Mokry, M., et al. Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes. Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).
  20. Drier, Y., et al. An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma. Nat Genet. 48, 265-272 (2016).
  21. Ryan, R. J. H., et al. Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma. Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).
  22. Montavon, T., et al. A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits. Cell. 147, 1132-1145 (2011).
  23. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).

Tags

Genetikk problemet 139 Chromatin looper chromatin folding gene uttrykk CRISPR dCas9 genreguleringen reversibel dimerization dynamisk chromosomal omorganisering.
CRISPR-mediert reorganisering av Chromatin Loop struktur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morgan, S. L., Chang, E. Y.,… More

Morgan, S. L., Chang, E. Y., Mariano, N. C., Bermudez, A., Arruda, N. L., Wu, F., Luo, Y., Shankar, G., Huynh, S. K., Huang, C. C., Pitteri, S. J., Wang, K. C. CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure. J. Vis. Exp. (139), e57457, doi:10.3791/57457 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter