Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Split-BioID — Proteom analyse af kontekst-specifik proteinkomplekser i deres Native cellulære miljø

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57479
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Cluster of excellence CellNetworks, Heidelberg University, 2Heidelberg University Biochemistry Center (BZH)

Summary

Vi leverer en trinvis protokol for split-BioID, en protein fragmenter-komplementering analyse baseret på den nærhed-mærkning teknik BioID. Aktiveret på samspillet mellem to givne proteiner, tillader det proteomics analysen af kontekst-afhængige proteinkomplekser i deres native cellulære miljø. Metoden er enkel, omkostningseffektiv og kræver kun almindeligt laboratorieudstyr.

Abstract

For at supplere eksisterende affinitet rensning (AP) tilgange til identifikation af protein-protein interaktioner (PPI), har indført enzymer, der giver mulighed for nærhed-afhængige mærkning af proteiner i levende celler. En sådan enzym, BirA * (bruges i BioID tilgang), medierer biotinylation af proteiner inden for en rækkevidde af ca 10 nm. Derfor, når smeltet til en protein af interesse og udtrykt i celler, det giver, mærkning af proksimale proteiner i deres oprindelige miljø. I modsætning til AP, der bygger på rensning af samlet proteinkomplekser, registrerer BioID proteiner, der er markeret i celler, uanset om de stadig interagere med protein af interesse, når de er isoleret. Da det biotinylates proksimale proteiner, man kan desuden kapitalisere på det ekstraordinære affinitet af streptavidin for biotin meget effektivt isolere dem. Mens BioID præsterer bedre end AP til at identificere forbigående eller svage interaktioner, giver begge AP og BioID masse massespektrometri tilgange et overblik over alle mulige interaktioner en given protein kan have. De giver imidlertid ikke oplysninger om som led i hver identificerede PPI. Faktisk, de fleste proteiner er typisk en del af flere komplekser, svarende til forskellige modning trin eller forskellige funktionelle enheder. For at løse denne fælles begrænsning af begge metoder, har vi udviklet en protein-fragmenter komplementering analysen baseret på BirA * enzymet. I denne analyse, kan to inaktive fragmenter af BirA * Saml til en aktiv enzym når bragt i umiddelbar nærhed af to interagerende proteiner som de er smeltet. Resulterende split-BioID analysen giver således mulighed for mærkning af proteiner, der samles omkring et par af interagerende proteiner. Såfremt disse to interagere kun i en given kontekst, split-BioID derefter giver mulighed for analyse af specifikke kontekst-afhængige funktionelle enheder i deres native cellulære miljø. Her, leverer vi en trinvis protokol for at teste og anvende split-BioID til et par af interagerende proteiner.

Introduction

Som de fleste cellulære funktioner udføres af proteiner, der dynamisk samler makromolekylære komplekser, er identificering af protein-protein interaktioner (PPI) en større bestræbelse i biomedicinsk forskning. Faktisk PPI er ofte dereguleret i sygdom og repræsenterer potentielle mål for therapeutics1. Mest udbredte metode til identifikation af PPI er affinitet rensning (AP) tilgang, hvor, efter celle lysis, et protein af interesse er specielt renset på en matrix og tilknyttede proteiner er efterfølgende identificeret ved massespektrometri (MS). Mens AP-MS er en kraftfuld tilgang, udfører det typisk ikke godt på tungtopløselige proteinkomplekser, meget forbigående interaktioner eller PPI, der kræver en intakt subcellulært struktur. Derudover kan fortolkning af data blive kompliceret af den dynamiske natur af PPI netværk, som en enkelt protein er ofte en del af flere forskellige proteinkomplekser.

Nærhed-mærkning teknikker såsom BioID2 eller APEX23,4 blev for nylig udviklet for at løse nogle af begrænsningerne af AP-MS tilgange. I BioID katalyserer enzym BirA * (svarende til en G115R variant af vildtype E. coli enzym) dannelsen af labile biotinyl-AMP (bio-AMP) som kan reagere med primære aminer. I modsætning til det enzym, vildtype, der bevarer bio-AMP i sin aktive center, frigiver BirA * bio-AMP giver sin diffusion til det omkringliggende miljø. Derfor, når smeltet til en protein af interesse og udtrykt i celler, proksimale proteiner kan være biotinylated inden for en anslået række 10 nm5. Disse markeret proksimale proteiner er derefter isoleret af streptavidin pulldown og identificeret af MS. I modsætning til AP-MS kræver BioID udtryk for en fusion protein. Det kan derfor kun anvendes på proteiner hvis funktion ikke hæmmes af tagging. Desuden hastigheden af mærkning er langsom, typisk 6 – 24 h2,6, hvilket gør opdagelse af kortvarig proteiner udfordrende. Endnu, i forhold til AP-MS, BioID-MS giver adskillige vigtige fordele: første, dens fanger interaktioner i deres native cellulære miljø; andet, mærket proteiner i stedet for samlet komplekser er isoleret efter celle lysis; for det tredje streptavidin pulldowns giver mulighed for ved hjælp af denaturering buffere og barske vask betingelser. Metoden er derfor mere følsomme til at påvise forbigående eller svage interaktioner7 eller samspil, der opstår på en bestemt og skrap hen til isolere subcellulært struktur8.

Men de fleste proteiner er normalt en del af større komplekser, som kan omskabe ifølge cellular køindikatorer eller til den funktion, der skal udføres. Derfor, en enkelt protein er typisk en del af flere komplekser, svarende til forskellige funktionelle enheder, der omfatter særskilt og/eller overlappende PPI. Begge tilgange giver et overblik over alle foreninger en given protein kan have, men de undlader at løse som led i individuelle PPI. For at øge opløsningen af sidstnævnte, har vi designet en protein-fragmenter komplementering analyse (PCA) i hvilke to inaktive fragmenter af BirA * (NBirA *, der indeholder den katalytiske domæne, og CBirA * der kan ses som re-aktivering domæne) kan Saml ind i en aktiv enzym når bragt i umiddelbar nærhed af to interagere proteiner9. Den resulterende split-BioID analysen fokuserer nærhed-afhængige biotinylation på proteiner, der samles omkring et par af interagerende proteiner og herigennem tillader identifikation af kontekst afhængige protein forsamlinger. Vi har for nylig vist fremragende opløsning magt split-BioID ved at løse to særskilte proteinkomplekser involveret i miRNA-medieret genhæmning vej9.

Helt, i et enkelt og simpelt assay, split-BioID giver mulighed for at opdage og specifikt tildeler PPI for definerede funktionelle enheder, hvor en given protein er involveret, forudsat at en supplerende interagerende protein af det tilsvarende protein kompleks er kendt.

Protocol

Bemærk: En oversigt over metoden, der er vist på figur 1.

1. planlægning af kloning strategien

  1. Vælg to derfor interagerende proteiner til at blive testet.
    Bemærk: Hver af de to proteiner vil være smeltet til en split-BioID fragment: enten NBirA * eller CBirA *. Som en negativ kontrol, CBirA * fusion proteiner vil blive testet med NBirA * smeltet til den grønne fluorescerende proteiner (NBirA *-normal god landbrugspraksis). Som en ekstra kontrol, kan NBirA * fusioner testes alene, uden beslægtet CBirA * fusion eller i kombination med en CBirA * smeltet til en ikke-forretningsmæssigt forbundne protein. Det er tilrådeligt ikke at bruge CBirA *-normal god landbrugspraksis som en negativ kontrol som det blev vist til konsekvent føre til større baggrund kombineret til enhver NBirA * fusion protein9. Årsagen til denne iagttagelse kan være udtryk niveau af CBirA *-normal god landbrugspraksis, meget højere end nogen andre CBirA * fusion proteiner, vi har brugt hidtil, der kan føre til betydelige reassociation med NBirA * fragment.
  2. Når to proteiner er valgt, skal du kontrollere litteratur for at finde om begge er allerede blevet med held mærket i funktionelle studier (for eksempel som en normal god landbrugspraksis-mærkede fusion protein).
    1. Hvis sådanne undersøgelser findes, Bemærk placeringen af tag (på N - eller C-terminalen) og bruge den samme orientering tagge proteiner af interesse med split-BioID fragmenter.
    2. Hvis ingen sådan undersøgelse findes, plan konstruktioner kodning for både proteiner markeret på N - og C-terminus og planlægge en analyse for at teste funktionaliteten af fusion proteiner (f.eks. en redning eksperiment i en cellelinje forarmet WT protein).
      Bemærk: Når du parrer to fusion proteiner ved hjælp af plasmider beskrevet i figur 2 , der indkode lang, fleksibel linkers, orientering af fusion proteiner (BirA * fragmenter, sammenvoksede opstrøms eller nedstrøms for proteiner af interesse) generelt betyder ikke noget . Faktisk bruger FRB og FKBP som model proteiner, det var vist, at alle fire mulige gentagelser (begge fragmenter på N-termini, begge på C-termini, en på N-terminus og den anden C-terminus, og vice versa) give sammenlignelige biotinylation9.
  3. Design primere til at forstærke ORFs af de to proteiner af interesse for kloning til split-BioID plasmider. Være opmærksomme på, at oversættelsen rammer er det samme som BirA * fragmenter. Hvis bruger plasmider beskrevet i figur 2, skal du bruge restriktionsenzymer PmeI og PacI for at konstruere CBirA * fusionen, og enzymer ClaI og MLU til NBirA * fusion.
    Bemærk: Plasmider afbildet i figur 2 bære en bi-directional tet-responderende element flankeret af F3/FRT rekombination websteder. Dette giver mulighed for de regulerede Co udtryk på nogenlunde samme niveau af både fusion proteiner fra de samme plasmid10, og muligheden for at konstruere hurtigt stabil cellelinjer ved rekombination-medieret kassette exchange (RMCE). I disse plasmider har NBirA * en myc-tag mens CBirA * har en FLAG-tag. ORFs kan naturligvis også blive klonet på individuelle plasmider med konstitutiv initiativtagere.
    Kritiske trin: Når test to interagerende proteiner, anbefales det at sammenligne NBirA * smeltet til protein 1 kombineret med CBirA * smeltet til protein 2, og NBirA * smeltet til protein 2 kombineret med CBirA * smeltet til protein 1. Faktisk er det ofte observeret, at en iteration virker bedre end den anden.

2. kloning ORFs af gener af interesse i Split-BioID Plasmid

Bemærk: I dette eksempel, to proteiner, der kan mærkes på N-terminus er overvejet. Fire betingelser bliver testet og sammenlignet med ikke-transfekteret celler (tabel 1).

  1. Bruge Polymerasekædereaktionen (PCR) til at forstærke ORFs af de to proteiner skal testes med passende primere. Design primere, der indfører ClaI og MLU begrænsning websteder for NBirA * fusion proteiner, og PacI og PmeI for CBirA * fusion proteiner.
    Bemærk: PCR kan udføres med enhver kommerciel, fortrinsvis korrekturlæsning, DNA polymerase. Følg standardprotokollen fra håndbogen og tilpasse det til smeltepunktet af primere og længden af ORF skal forstærkes ifølge retningslinjerne for producenten.
  2. Subclone den første ORF
    1. Fordøje både plasmid (omkring 2 μg) og PCR-forstærket ORF1 (til at være smeltet til NBirA *) med ClaI og MLU. Udføre fordøjelsen reaktioner ved hjælp af 1 μL af hver enzym, blandet med den passende mængde DNA og reaktion buffer i en samlet maengde paa 20 μL i 1,5 mL rør i 1 timer ved 37 ° C.
    2. Køre begge fordøjelsen prøver på en 1% Agarosen-TAE DNA gel. Punktafgifter bands svarer fordøjede plasmid og ORF1 med en ren skalpel og overførsel til 1,5 mL rør.
    3. Rense begge bands, ved hjælp af en standard DNA udvinding kit.
    4. Ligate fordøjet plasmid og ORF1 ved hjælp af standard reagenser.
      1. Hvis du bruger ligatur kit angivet i Tabel af materialer, ligate 100 ng DNA, som indeholder tre til fem gang kindtand overskydende indsætte over plasmid i en samlet maengde paa 4,5 μL. Tilsæt 5 μl af 2 x T4 ligase buffer og 0,5 μl af T4 DNA ligase fra ligatur kit. Udføre ligatur reaktion i en 1,5 mL tube i 10 min. ved stuetemperatur (RT).
    5. Omdanne standard DH-5α E. coli kompetente celler (tilberedt efter Inoues metode11).
      1. Mix 3 μL ligatur reaktion med 50 μL af kompetente celler i en 1,5 mL tube på is og Inkuber i 30 min. overførsel celler til en varme blokere sæt til 42 ° C i 30-45 s og derefter inkuberes tilbage på isen for 2 min. tilføje 250 μL pre varmede (37 ° C) lysogeny bouillon (LB) medium og pladen 100 μL af celler på en pre varmede (37 ° C) ampicillin-holdige LB-agar plade. Inkuber celler natten over ved 37 ° C.
    6. Den næste dag, vælge fire til seks kolonier og inkuberes ved 37 ° C, 180 rpm, overnatning i 3 mL af LB medium indeholdende 100 μg⋅mL-1 ampicillin i en 15 mL tube.
    7. Isolere plasmider fra de plukkede kolonier ved hjælp af en standard DNA MiniPrep kit.
    8. Kontrollere rigtigheden af plasmider ved Sanger sekventering ved hjælp af kassette 2 omvendt primer (tabel 2).
  3. Når et plasmid som indeholder den første ORF er blevet identificeret, subclone den anden ORF i at plasmid følge de samme trin som skridt 2.2 men ved hjælp af PmeI og PacI enzymerne.
  4. Sekvens de resulterende plasmider ved hjælp af kassette 1 omvendt primer (tabel 2).

3. afprøvning af Fusion proteiner

Bemærk: Nedenstående instruktioner er dobbelt inducerbar udtryk plasmider (figur 2) og HeLa-11ht celler, en subclonal HeLa-CCL2-cellelinie, stabilt udtrykker omvendt tetracyklin-kontrollerede transkription aktivere rtTA-M2 og indeholde en locus for RMCE12. Vækstmedium for disse celler er Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) som indeholder 10% tetracyklin-free fetal bovint serum (FBS). Når du bruger en anden celletype, vil nøjagtige seeding betingelser og vækstmediet skal tilpasses.

  1. Forbigående Transfektion
    1. Frø celler i en koncentration på 1 x 105 celler i 2 mL pr. brønd af en seks-godt plade dagen før Transfektion og inkuberes celler natten over ved 37 ° C, 5% CO2 i en celle kultur inkubator.
    2. På dagen for Transfektion, fjerne medium af hver brønd og erstatte med 2 mL frisk medium.
    3. Forberede de fire Transfektion reaktioner efter tabel 1. For hver brønd til transfect, skal du tilføje 6 µg for polyethylenimine til 3 µg af plasmid DNA i en 1,5 mL sterilt rør og fyld til 500 µL med DMEM medium uden serum.
    4. Inkuber hver Transfektion mix i mindst 5 min. ved stuetemperatur før du tilføjer drop kloge til hver brønd. Inkuber celler natten over ved 37 ° C, 5% CO2.
  2. Induktion og nærhed-mærkning
    1. Dagen efter Transfektion, fjerne medium og erstatte med medium suppleret med biotin på 50 µM til at stimulere biotinylation og doxycyclin på 200 ng⋅mL−1 at fremkalde udtryk for fusion proteiner. Inkuber celler i mindst 20 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
      1. For at gøre en stamopløsning af biotin, opløse biotin på 50 mg⋅mL-1 (svarer til ca. 200 mM) i 2 M ammoniumhydroxid. Når det er helt opløst, fortyndes den til 50 mM, 500 mM Hepes, pH 7,4, så pH indstilles til 7.4 med HCl. delprøve og gemme de resulterende 1.000 x stamopløsning ved-20 ° C. Opløse doxycyclin på 10 mg⋅mL-1 i 70% ethanol og opbevares i et skruelåg microtube ved-20 ° C i mørke.
  3. Celle lysate forberedelse
    1. Vaske cellerne en gang med 1 mL kold (4 ° C) fosfatbufferet saltopløsning (PBS).
    2. Til hver brønd, tilføje 100 µL af lysisbuffer (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT og proteasehæmmere).
    3. Høste cellerne med celle scrapper og overførsel til 1,5 mL rør.
    4. Der centrifugeres prøver ved 14.000 x g i 10 min. ved 4 ° C for at fjerne celle debris.
    5. Overføre analysere til frisk rør og Anbring på is.
    6. Bestemme protein beløb med en Bradford assay.
  4. SDS-polyacrylamid gelelektroforese (side) og Western blotting
    1. Forberede en SDS-polyacrylamid gel.
    2. For hver markeret lysate, forberede en side prøve 30 µg (minimum 15 µg) protein i alt 30 µL af SDS-loading bufferen. Derefter indlæse lige store mængder af hver prøve (20 µL/brønd) på SDS-polyacrylamid gel og gå videre til elektroforese.
    3. Efter elektroforese, skal du overføre de fraktionerede proteiner til en lav fluorescens PVDF skamplet membran ved hjælp af en standardprotokol.
      Bemærk: Til at analysere protein biotinylation, en 10 min overførsel tid med programmet "høj MW" af et hurtigt overføre semi-tør Western blotting enhed normalt fungerer godt.
    4. Efter overførslen, blokere membran i 5% tør mælk i PBS for 30 min på RT.
    5. Inkuber membran for 30-60 min. ved RT med fluorescerende streptavidin konjugat fortyndet 1:15,000 i PBS, som indeholder 2% BSA og 0,1% Tween-20.
    6. Vask membranen tre gange, hver i 10 min, med PBS, som indeholder 0,1% Tween-20, og derefter en gang mere med PBS.
    7. Skan membran på et fluorescens scanner imaging system.
      Bemærk: en typisk vestlige skamplet er vist på figur 3. Ovennævnte procedure beskriver et fluorescerende-baseret detektion, men en luminescence-baseret detektion ved hjælp af HRP-kombineret streptavidin virker lige så godt.

4. Split-BioID for Proteomics undersøgelser

Kritiske Bemærk: For den endelige massespektrometrisk analyse, alle følgende trin der skal udføres i keratin-fri betingelser, skal alle materialer og reagenser være som keratin-fri som muligt.

  1. Forbigående Transfektion
    1. Dagen før Transfektion, frø tre 10 cm plader for hver betingelse i en koncentration på 8 x 105 celler i 10 mL per plade, og der inkuberes celler natten over ved 37 ° C, 5% CO2 i en celle kultur inkubator.
    2. Den næste dag, forberede en master Transfektion blanding for hver Transfektion betingelse: for tre plader pr. betingelse, 36 µg for polyethylenimine og 18 µg af plasmid DNA opløst i 900 µL serum-gratis DMEM. Inkuber hver master mix i mindst 5 min. på RT.
    3. I mellemtiden, erstatte medium af hver tallerken med frisk medium, og derefter tilsættes 300 µL af Transfektion blandinger drop klogt at hver plade.
    4. Inkuber celler natten over ved 37 ° C, 5% CO2.
  2. Induktion og nærhed-mærkning
    1. Dagen efter Transfektion, overføre cellerne til 15 cm retter. For hvert fad, fjerne medium, cellerne vaskes med 7 mL PBS, der tilsættes 1,5 mL trypsin-EDTA-opløsning og inkuberes i 5 min på RT. tilføje 3,5 mL af vækstmediet resuspend cellerne og overføre cellesuspension til en 15 cm parabol fyldt med 20 mL af vækstmediet suppleret med biotin på 50 µM til at stimulere biotinylation og doxycyclin på 200 ng⋅mL1 (endelige koncentrationer) til at fremkalde udtryk for fusion proteiner.
    2. Inkuber celler i mindst 20 timer ved 37 ° C, 5% CO2.
  3. Høst og opbevaring af celler
    1. Cellerne vaskes to gange med PBS, derefter tilsættes 1,5 mL PBS til hver plade og høste cellerne med en scrapper.
    2. Overføre de høstede celler svarende til én tilstand til en 15 mL tube og høste dem ved centrifugering ved 1.200 x g, 5 min, 4 ° C.
    3. Fjerne analysere og snap fryse pellets i flydende kvælstof, så butikken ved 80 ° C indtil videre forarbejdning.
      Bemærk: Alternativt celler kan også være adskilt af trypsinization, høstet i vækstmediet, overført til en 15 mL tube og vaskes tre gange med PBS før frysning.
  4. Forberedelse af cellelysater
    1. Resuspend celle pellets i 1 mL lysisbuffer (50 mM Tris pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,4% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 x komplet protease hæmmer) på RT. Pass cellerne 10 – 20 gange (fem til ti strøg) gennem en 25 G kanyle.
    2. Der sonikeres prøverne med en sonification enhed.
      Bemærk: Med sonification enhed angivet i Tabellen af materialer, kan følgende program kan bruges: fire cyklusser ved høj intensitet, 30 s pr cyklus i en kold (4 ° C) vandbad. Enhver anden sonification enhed er egnet men parametre skal muligvis justeres i overensstemmelse hermed.
    3. Tilføje Triton X-100 til den gendannede sonicated lysate at nå frem til en endelig koncentration på 2% (typisk, Tilsæt 100 μL af 20% Triton X-100 til 900 μl sonicated celle lysate), og derefter 2,3 mL 50 mM Tris, pH = 7.4 per 1 mL af lysate til at justere NaCl-koncentration til 150 mM før b inding til streptavidin-kombineret perler.
      Kritiske Bemærk: Højere salt koncentration resultere ofte i langt mindre effektiv binding til perlerne.
    4. Distribuere den justerede lysates i 1,5 mL rør (ca. 1,1 mL i tre reagensglas) og centrifugeres dem på 16.000 x g, 10 min, 4 ° C.
    5. Overføre analysere (ca. 3,2 mL) til en 15 mL tube, og holde 50 – 100 μL som INPUT materiale.
    6. Måler koncentrationen af hver prøve med en Bradford assay og bruge svarer til 3 til 3,5 mg proteinindhold til streptavidin rullegardinmenuen.
  5. Streptavidin pulldown
    Bemærk: En oversigt over proceduren pulldown er vist på figur 4. Det er næsten identisk med den originale protokol udgivet af Roux og kolleger2. Første gang rullegardinmenuen udføres, prøver af flow gennem og vask 1-4 kan afsættes til Western blot analyse at sikre proceduren arbejdede ordentligt (figur 5).
    1. For hver betingelse, skal du overføre 200 μl af streptavidin-kombineret magnetiske perler suspension til en 1,5 mL tube. Sted rør på et magnetisk rack, vente, indtil perlerne holde sig til siden af rørene (ca. 1 min) og fjerne opbevaring bufferen.
    2. Vaske perlerne ved forsigtigt blanding med 1 mL af ækvilibrering buffer (50 mM Tris pH 7-4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100 og 1 mM DTT).
    3. Udsende de afbalancerede perler i lige store beløb i det nødvendige antal rør (som regel når startende med 3 – 3,5 mg protein indhold, lysates fra hver betingelse kan sendes i to til fire 1,5 mL rør) og sted tilbage på den magnetiske rack.
    4. Fjerne ækvilibrering buffer og resuspend hvert sæt af perler med lige store mængder af den tilsvarende cellelysater fra trin 4.4.7. Der inkuberes natten over ved 4 ° C på en roterende hjul.
    5. Den næste dag, placere 1,5 mL rør på et magnetisk rack, vent indtil perlerne holde sig til siden af rør og overføre analysere til en 15 mL tube mærket som Flow gennem.
      Bemærk: fra nu af alle trin er udført ved stuetemperatur medmindre andet er angivet.
    6. Resuspend perlerne i hver tube med 200 μl af wash buffer 1 (2% SDS i vand), og kombinere hvert sæt af resuspenderede perler svarende til én tilstand i 1,5 mL rør.
    7. Vaske perlerne to gange for 8 min på en rotationshjulet med 1 mL af wash buffer 1.
    8. Vaske perlerne to gange for 8 min på en rotationshjulet med 1 mL af vaskebuffer 2 (50 mM HEPES pH 7,4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100 og 0,1% Na-deoxycholate).
    9. Vaske perlerne to gange for 8 min på en rotationshjulet med 1 mL af vaskebuffer 3 (10 mM Tris pH 8, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, og 0,5% Na-deoxycholate).
    10. Vaske perlerne to gange for 8 min på en rotationshjulet med 1 mL af vaskebuffer 4 (50 mM Tris pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,1% NP-40).
    11. For at sikre vaskebuffer er helt fjernet efter sidst vask skridt, fjerne de fleste af supernatanten, og derefter dreje ned prøverne. Læg dem tilbage på den magnetiske rack, vent indtil perlerne holde sig til siden af rør og derefter fjerne den resterende buffer.
    12. Tilsæt 30 μL af eluering buffer (10 mM Tris pH 7,4, 2% SDS, 5% β-mercaptoethanol og 2 mM Biotin) til perlerne. Inkuber ved 98 ° C i 15 min og derefter straks fjerne perler på en magnetisk rack.
    13. Overføre den eluted prøve til en frisk rør og opbevares ved-20 ° C indtil videre forarbejdning.
  6. SDS-PAGE og Western blotting
    Bemærk: Før massespektrometri analyse, det anbefales at vurdere biotinylation og pulldown succes af SDS-PAGE og Western blot. Hvis ingen biotinylation mønster er observeret, man kan overveje at enten dox eller biotin blev ikke føjet til medium eller at den ene af de to stamopløsninger er kompromitteret.
    1. For hvert input prøve, forberede en side prøve ved at blande lige store mængder af protein prøve med den passende mængde af 3 x SDS-loading bufferen i alt 28 μL. Forberede side prøver ved at blande 5 µL af hver prøve, eluering med 2,5 µL af 3 x SDS-loading bufferen.
    2. Indlæse prøver (25 µL/brønd for input, 7 µL/brønd til eluering prøver) på en SDS-polyacrylamid gel. Fortsæt til elektroforese og Western blotting som beskrevet i afsnit 3.4.
    3. Hvis udfører rullegardinmenuen for første gang, forberede side prøver for hvert trin i rullegardinmenuen (Input, flow gennem vask 1 – 4: eluering) ved at blande 20 µL af hver prøve (Input, flow gennem vask 1 – 4) med 10 µL af 3 x SDS-loading bufferen eller 5 µL (eluering) med 2,5 µL af 3 x S DS-loading bufferen og fortsætte som i trin 4.6.4 (figur 5).
  7. SDS-PAGE for MS analyse
    Bemærk: Hvis du vil minimere potentielle keratin forurening, præfabrikerede geler og kommercielle prøve lastning buffer kan anvendes.
    1. Tilføje 6,25 μL af 4 x prøvebuffer til 18,75 μL af hver eluering prøve og køre prøverne på en 4-20% præfabrikerede SDS-gel, indtil de vandrer 2-3 cm ind i gelen.
    2. Pletten gel med kolloid Coomassie strålende blå G250 farvning13 i en 15 cm petriskål.
    3. Brug en ren skalpel punktafgifter i hele baner for hver prøve, undtagen streptavidin band (kører på ca. 17 kDa, figur 6), og overføre de skåret bands til 1,5 mL rør.
    4. Send disse prøver til en proteomics facilitet for yderligere analyse.
      Bemærk: Typiske MS resultater kan ses i reference 9 (figur 3 og figur 7og supplerende tabeller). De hele datasæt er tilgængelige på stolthed repository (stammesamlingsnummer PXD005005).

Representative Results

For at illustrere, hvordan denne metode virker, de åbne læserammer (ORFs) af proteinerne, Ago2, blev TNRC6C og Dicer (alle involveret i den miRNA-medieret genhæmning pathway) klonet i split-BioID plasmider. Ago2 er kendt for at interagere med TNRC6C inden for en miRNA-induceret silencing complex (miRISC), undertrykker oversættelse og stimulere henfald af target mRNAs14. Forudgående at samle miRISC, Ago2 interagerer med Dicer, det enzym, der producerer modne miRNAs, inden for et kompleks, hvor det kan få fyldt med en miRNA15. Dermed blev split-BioID anvendt til enten Ago2/Dicer par eller Ago2/TNRC6C par. For hvert par af testede proteiner blev Ago2 enten sammenvokset til NBirA * eller CBirA * ved hjælp af vores split-BioID plasmider (figur 2), og Dicer og TNRC6C til den tilsvarende beslægtet BirA * fragment. Derudover hvert protein var sammenvokset til CBirA * og parret med en NBirA *-normal god landbrugspraksis fusion som en negativ kontrol. Dette resulterer i at teste fire iterationer for hvert par af testede protein (tabel 1).

For at teste, om split-BioID aktiveres ved interaktion af par af testede proteiner, fulgte vi den ordning, der er afbildet på figur 1. Plasmider var forbigående transfekteret i en tet-systemet kompatibelt HeLa cellelinie. Udtryk for fusion proteiner blev induceret med doxycyclin (dox) og biotinylation var stimuleret ved at tilføje overskydende biotin til vækstmediet. Efter en 20 h inkubationstiden med dox og biotin, blev celler mængden og analyseret af Western blotting af konjugeret streptavidin til påvisning af biotinylated proteiner. I pattedyrceller, to store bands er typisk opdaget af den konjugerede streptavidin i den untransfected prøve (figur 3, stjerner) og svarer til endogent biotinylated proteiner (sandsynligvis mitokondrie carboxylases). Disse to bands er til stede i alle prøver og bekvemt kan bruges som intern lastning kontrolelementer, påvisning af en husholdning protein til at styre lastning af lig protein beløb er således overflødigt. Typisk for en BioID/split-BioID eksperiment, ekstra store bands, der kan observeres er fusion proteiner, der fik selv-biotinylated. Selvom ingen andre biotinylated protein ses, angiver opdage biotinylation af fusion proteiner på dette tidspunkt allerede, at de to testede proteiner interagerede i cellerne. Eksperimentet afbildet på figur 3, er det klart, at det at have en NBirA *-Ago2 fusion protein parret med CBirA * alternativ til TNRC6C eller Dicer er mere effektiv end de modsatte kombinationer i hvilke CBirA *-Ago2 er parret til NBirA * fusioner af to andre proteiner (figur 3, øverste panel, sammenligne intensiteten af baner 2-3 til baner 6-7). Derudover aktivering var bestemt som ingen af CBirA * fusioner kunne aktivere NBirA *-normal god landbrugspraksis kontrol fusion protein til mærkbare niveauer (figur 3, Sammenlign baner 1, 4-5 til lane 8, der svarer til untransfected celler). Da i vores plasmider, NBirA * har en myc-tag og CBirA * har et FLAG tag (figur 2), kan udtrykket niveauer hver fusion protein analyseres med antistoffer mod disse to tags (figur 3, nederste panel).

Når interaktion-induceret biotinylation er observeret, eksperimentet kan skaleres, og biotinylated proteiner isoleret på streptavidin-kombineret perler som angivet i punkt 4 i protokol (figur 4). Når du udfører isoleret første gang, kan alle trin i rensning analyseres ved Western blotting (figur 5). Typisk binding til perlerne bør være næsten kvantitative og stort set ingen lækage gennem bør overholdes i vasker. Forudgående behandling af prøver til massespektrometri, anbefaler vi kører en vestlige skamplet for at sikre induceret-biotinylation fungeret som forventet og at fusion proteiner blev udtrykt. Udtryk for fusion proteiner mangler enten på grund af dårlig Transfektion effektivitet eller defekt dox induktion. Hvis fusion proteiner blev udtrykt, men ingen biotinylation er observeret check hvis overskydende biotin (50 μM) faktisk blev tilføjet til medium og at den bestand biotin er stadig aktiv. Når det eluted materiale er analyseret på en Coomassie farvede protein gel (figur 6), typisk, den stærkeste band skal overholdes kører på ca. 17 kDa og svarer til monomere streptavidin. Bånd svarende til endogen biotinylated proteiner og fusion proteiner kan også observeres. Vi typisk punktafgifter inden for prøven lane ovenfor streptavidin bandet op til lastning godt (figur 6). Skåret bandet kan gemmes i en 1,5 mL tube og sendt til en massespektrometri facilitet. Alternativt, bundne proteiner kan også være trypsin fordøjes på de streptavidin-kombineret perler og fordøjet peptider elueret danne kolonnen. Vi rutinemæssigt bruger MaxQuant software16 (bruger det meste standardparametre og tilføje lysin biotinylation som et muligt posttranslationel modifikation, se reference 9 for flere detaljer og typiske MS resultater) at analysere de rå data, MS og de Perseus suite17 for de efterfølgende statistiske analyser, begge er gratis software. Prøverne er typisk kører i tre biologiske replikater. Bruger etiket-fri kvantificering, kan specielt beriget proteiner identificeres over kontrol betingelser. Hvis du vil filtrere for endogent biotinylated proteiner, og proteiner, der er ikke specielt mærket af BirA * enzymet, overveje vi kun proteiner, der er betydeligt beriget over hits fra seks datasæt genereret med seks uafhængige proteiner. Derudover vi kun overveje hits, der er beriget over en split-BioID datasæt, hvor NBirA * fusion proteinerne er blevet erstattet af NBirA *-normal god landbrugspraksis. Andre data analyse strategier er blevet foreslået, navnlig ved hjælp af stabile isotop mærkning med aminosyrer i cellekultur (SILAC) for kvantitative proteomics18. Derudover er forskellige strategier blevet beskrevet for den direkte isolation af biotinylated peptider ved hjælp af en streptavidin variant med svækket affinitet til biotin18, særlige eluering betingelser ved hjælp af organiske opløsningsmidler19 eller biotin-specifikke antistoffer20,21. Mens ikke nødvendigvis fører til opdagelsen af flere proteiner, identifikation af biotinylation steder tilføje mere tillid med hensyn til den særlige karakter af hits og er nyttige når adressering topologien for en interaktion.

Figure 1
Figur 1: oversigt over proceduren split-BioID. Protein 1 interagerer med protein 2 som en del af komplekse A eller protein 3 som en del af komplekse B. Hvis du vil specifikt sonde sammensætning af komplekse A, kan split-BioID anvendes til proteiner 1 og 2. Fotografi af den massespektrometer er under en Creative Commons Attribution-Share Alike 3,0 Unported license og blev hentet fra https://commons.wikimedia.org med filnavnet på ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: udtryk kassetter af split-BioID plasmider. Vi leverer fire plasmider at teste alle kombinationer af NBirA * og CBirA * fusion proteiner. Plasmider og komplet maps er tilgængelig på addgene.org under de angivne tal. Plasmider har en tet-responderende element (7 x Millie) og skal bruges i en cellelinje, som er kompatibel med tet udtryk system. Bemærk også, at i alle plasmider ORFs af FKBP og FRB er sammenvokset til NBirA * og CBirA * fragmenter henholdsvis. Disse to proteiner interagere kun under overværelse af rapamycin og dermed plasmider kan bruges til hurtigt at teste systemet i tilstedeværelsen eller fraværet af denne kemiske9. Den angivne begrænsning steder er unikke. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Fig. 3: typisk Western blot for en split-BioID eksperiment. Øverste panel: påvisning af biotinylated proteiner med fluorescently mærket streptavidin. Nederste panel: påvisning af fusion proteiner med anti-Myc og anti-FLAG antistoffer. To par af proteiner blev testet: Ago2/TNRC6C og Ago2/Dicer. I baner 2 & 3, blev Ago2 vedlagt CBirA * fragment. I baner 6 & 7, blev Ago2 vedlagt NBirA * fragment. Ingen betydelig signal blev observeret, når nogen af de tre proteiner blev kombineret med NBirA *-normal god landbrugspraksis (baner 1, 4-5). Stjernerne angiver bands svarende til endogent biotinylated proteiner, der kan tjene som interne lastning kontrolelementer. Dette tal er tilpasset fra figur 5B af Schopp et al. 9 under en Creative Commons Attribution 4.0 International licens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: oversigt over proceduren streptavidin pulldown. Store skridt til isolering af biotinylated proteiner til massespektrometri analyse er afbildet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: typisk Western blot for en streptavidin pulldown eksperiment. Lige mængder af hver anført prøve blev indlæst på en SDS-polyacrylamid gel. Efter Western blotting, biotinylated proteiner blev opdaget med HRP-kombineret streptavidin. Bånd svarende til NBirA *-TNRC6C og CBirA-Ago2 er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: typisk Coomassie farvede protein gel for massespektrometri analyse. Den eluted prøve fra streptavidin-kombineret perler blev læsset på en færdigstøbte protein gel og køre indtil prøven vandrer 2-3 cm. Den store band set på ca. 17 kDa er streptavidin. Området direkte over at band er skåret ud og sendes til et massespektrometri facilitet. Bånd svarende til NBirA *-TNRC6C og CBirA-Ago2 er angivet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Transfektion prøve Betingelse testet
1 NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2
2 CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2
3 NBirA *-normal god landbrugspraksis / CBirA *-protein1
4 NBirA *-normal god landbrugspraksis / CBirA *-protein2
5 ingen Transfektion

Tabel 1: Testet typisk betingelser, når du anvender split-BioID på to proteiner.

Sekventering primer sekvens
Kassette 1 omvendt primer (CBirA * fusion) TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC
Kassette 2 omvendt primer (NBirA * fusion) GTGGTTTGTCCAAACTCATC

Tabel 2: Sekventering primere for split-BioID plasmider.

Discussion

Den skitserede fremgangsmåde beskriver, hvordan du klone gener af interesse i split-BioID plasmider, hvordan man tester for interaktion-induceret biotinylation og hvordan du kan isolere biotinylated proteiner til massespektrometri analyse. Vi beskriver her en metode baseret på forbigående Transfektion. Mens udtryk for fusion proteiner kan indstilles af mængden af dox tilsættes til mediet, kan forbigående Transfektion føre til uensartede protein udtryk med nogle celler, der groft overexpress fusion proteiner i forhold til den endogene modparter. Dette kan føre til forvridninger af det tilsvarende interactomes og PPI, der ikke giver et retvisende billede af interaktioner, der involverer de endogene proteiner. Det er således generelt tilrådeligt at konstruere stabil cellelinjer, når split-BioID er blevet etableret med den forbigående system. Plasmider er forenelige med Flp-medierede rekombination system og placere begge gener af interesse reguleres af den samme tet-responderende element. Hvis det er nødvendigt, og når det bruges med kompatible pattedyrceller, tillader de nem oprettelsen af stabile inducerbar cellelinjer. For eksempel, bruge vi linjen HeLa-EM2-11, der udtrykker rtTA tetracyclin-aktiveret transkription aktivere og en unik markedssegment genomisk locus hvorfra tetracyklin-medieret genekspression kan være stramt reguleret12. Brug denne cellelinje og Flp-medierede rekombination, kan stabil cellelinjer, der indeholder kun én kopi af transgenet fås i to-tre uger. Alternativt kunne man også bruge nuværende genom redigering teknikker for at indføre BirA * fragmenter i de indfødte genomiske loci af gener af interesse.

Som i enhver assay, der bygger på kodning en protein, skal man overveje, hvis de resulterende fusion proteiner er funktionelle. Tilgængelige data i som proteiner af interesse blev markeret (for eksempel med normal god landbrugspraksis for billeddiagnostiske undersøgelser) og funktionelt testet er nyttige til at beslutte, hvis BirA * fragmenter bør være klonet opstrøms eller nedstrøms gener af interesse. Hvis ikke sådanne oplysninger foreligger, man bør teste N-terminalt eller C-terminalt markeret proteiner i en funktionel analyse. For eksempel, kan aktiviteten af fusion proteiner testes i en cellelinje, hvori den endogene protein har været bankede-out og forhold til vildtype. Hvis proteiner af interesse tåle både N - og C-terminale tags, skal begge testes. Faktisk, i BioID eksperimenter, orientering af fusion protein kan påvirke effektiviteten af mærkning22. Derudover har vi bemærkede, at når anvende split-BioID til et par af proteiner, hvilket af de to proteiner er føjet til enten den NBirA * eller CBirA * fragment også indflydelse effektivitet mærkning9. I split-BioID plasmider, de 16 aminosyre lang glycin/Serin rige linkers kobling proteiner af interesse at BirA * fragmenter blev taget fra en anden PCA23 og arbejdet for os i alle interagerende proteiner vi har testet indtil videre. Dog bør man overveje at nogle protein par kan fungere bedre med kortere eller længere linkers. Afsluttende note, blev en anden analyse beskrevet af Bollen gruppe24. I denne analyse, er BirA * delt på et andet websted (E140/Q141) end vores (E256/G257). Vi har testet både split-BioID varianter side-by-side og fandt, at E256/G257, beskrevet i denne protokol, fører til stærkere genaktivering når koblet til to interagerende proteiner9.

En generel ulempe ved denne metode er den langsomme hastighed af mærkning. Typisk er 6 til 24 h inkubationstiden med biotin nødvendig for at opnå mærkbare biotinylation6, udelukker brug af denne teknik til at studere dynamisk remodellering af proteinkomplekser. Mens dette assay delvist løser denne advarsel som det aktiveres kun, når to proteiner interagere, langsom hastighed mærkning udelukke dets brug for at studere svar meget dynamiske processer eller analysere kortlivede proteiner. Manipuleret peroxidase APEX2 er kendt for at fremme effektiv mærkning af proksimale proteiner inden for 1 min3. En PCA baseret på APEX2 kan således tage begrænsninger af langsomme mærkning BioID-afledte assays. En proof-of-principle undersøgelse beskrives sådan en split-APEX2 assay25. Selv om en homodimerizing protein var med held biotinylated, er om analysen kan også bruges til at mærke og identificere proteiner, der samles omkring et par af interagerende proteiner imidlertid påvises. For ganske nylig blev styret udviklingen brugt til at oprette TurboID og miniTurbo, to varianter af BirA * med øget aktivitet, der giver mulighed for meget kortere mærkning tidsvinduer, ned til 10 min26. Tilpasse split-BioID til disse nye varianter vil yderligere udvide brugen af denne teknik til et bredere felt af programmer.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af det tyske Forskningsråd (DFG) gennem initiativet tysk topkvalitet (CellNetworks DFG-EXC 81) og et delvis finansiering af fælles forskningscenter SFB638.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (glacial) VWR 20104.298 To make TAE buffer
Agarose Sigma A9539 Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction
Ammonia solution 25% NH3 Bernd Kraft 6012 To dissolve biotin
Ampicillin Sigma A9518 To select transformed bacteria
Bioruptor plus sonification device Diagenode B01020001 Other sonification devices are also ok
Biotin Sigma B4639 To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation
Bovine serum albumin fraction V Carl Roth 8076 Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays
Bradford Ultra reagent Expedeon BFU05L Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents
Cell scrappers TPP 99002 Any other model is also fine
ClaI New England Biolabs R0197 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
DMEM medium Sigma D6046 If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium
DNA miniprep kit Sigma PLN350 Any other kit is also fine
Doxycycline Applichem A2951 Dox is light sensitive
DTT Applichem A2948 Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh
DyLight 680-conjugated streptavidin Thermo scientific 21848 to use with a LiCor Western blot scanning device
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65002 The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)
EDTA Applichem A5097 Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder
Ethanol Sigma 32205 Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Any other kit is also fine
HCl 37% Merck 1.00317.1000 To adjust pH of biotin stock solution
HEPES Carl Roth 6763 Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm Millipore IPFL00010 This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device
LiCl Grüssing GmbH 12083 Make a 5M stock solution
Odyssey CLx imaging system LI-COR N/A To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody
Linear polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-2 Any other transfection reagent is also fine
Milk powder Carl Roth T145 To block Western blot membranes
MluI-HF New England Biolabs R3198 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
Na-deoxycholate Sigma 30970 Make a 10% (w/v) stock solution
NaCl Sigma 31434 Make a 5M stock solution
NP-40 (Nonidet P40 substitute) Sigma 74385 Make a 20% (v/v) stock solution
PacI New England Biolabs R0547 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Phosphate buffer saline (PBS) Sigma 806552 To wash cells before scrapping
PmeI New England Biolabs R0560 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001 Added to the lysis buffer to prevent protein degradation
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP Addgene 90003 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90004 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP Addgene 90008 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90009 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
Q5 High-Fidelity PCR kit New England Biolabs E0555S To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.
Quick ligation kit New England Biolabs M2200S To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.
RunBlue 4-20% SDS precast gels Expedeon BCG42012 To use when running samples for MS analysis
RunBlue LDS Sample Buffer Expedeon NXB31010 Running buffer for the RunBlue precast gels
SDS Sigma 5030 Comes as a 20% stock solution
tet-free serum Biowest S181T we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins
Trans-Blot Turbo Transfer system Bio-Rad 1704150 High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine
Tris Carl Roth 4855 Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)
Triton X-100 Applichem A4975 Make a 20% (v/v) stock solution
Tween-20 Carl Roth 9127 Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge. Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).
  2. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  3. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  4. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).
  6. Kim, D. I., et al. An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling. Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).
  7. Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes. J Proteomics. 118, 81-94 (2015).
  8. Morriswood, B., et al. Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation. Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).
  9. Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, (2017).
  10. Béthune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells. EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).
  11. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  12. Weidenfeld, I., et al. Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci. Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).
  13. Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
  14. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).
  15. MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex. P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).
  16. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  18. Opitz, N., et al. Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast. Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).
  19. Mackmull, M. T., et al. Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity. Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).
  20. Kim, D. I., et al. BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation. J Proteome Res. , (2017).
  21. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  22. Chapat, C., et al. Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs. P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).
  23. Luker, K. E., et al. Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  24. De Munter, S., et al. Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions. FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).
  25. Xue, M., et al. Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells. Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).
  26. Branon, T. C., et al. Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms. bioRxiv. , (2017).

Tags

Biokemi spørgsmål 134 BioID proteomics protein engineering protein-fragmenter komplementering analyse protein-protein interaktioner nærhed mærkning
Split-BioID — Proteom analyse af kontekst-specifik proteinkomplekser i deres Native cellulære miljø
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schopp, I. M., Béthune, J.… More

Schopp, I. M., Béthune, J. Split-BioID — Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment. J. Vis. Exp. (134), e57479, doi:10.3791/57479 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter