우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.
기존 친 화력 정화 (AP)를 보완 하기 위해 단백질 단백질 상호 작용 (PPI)의 식별에 대 한 접근, 효소는 살아있는 세포에 있는 단백질의 근접-종속 라벨 수 있도록 도입 되었습니다. 하나 같은 효소, BirA * (BioID 접근에서 사용), 중재 약 10의 범위 내에서 단백질의 biotinylation nm. 그러므로, 관심사의 단백질을 융합 하 고 셀에 표현, 그것은 그들의 네이티브 환경에서 근 단백질의 라벨 수 있습니다. 조립된 단백질 복합물의 정화에 의존 하는 AP, 반대로 BioID 아무리 여부 그들은 여전히와 상호 작용 하 관심사의 단백질 들은 고립 된 세포 내에서 표시 된 단백질을 감지 합니다. 이후 biotinylates 근 단백질, 하나 그들을 매우 효율적으로 biotin에 streptavidin의 뛰어난 선호도에 투자 또한 수 있습니다. BioID 식별 과도 또는 약한 상호 작용에 대 한 AP 보다 더 나은 수행 하는 동안 두 AP 및 BioID 질량 분석 방법 주어진된 단백질이 있을 수 있습니다 모든 가능한 상호 작용에 대 한 개요를 제공 합니다. 그러나, 그들은 각 확인 된 PPI의 맥락에서 정보를 제공 하지 않습니다. 실제로, 대부분의 단백질 일반적으로 뚜렷한 성숙 단계 나 다른 기능 단위에 해당 하는 여러 단지의 일부입니다. 두 방법의 일반적인 제한이를 해결 하기 위해 우리 BirA * 효소에 따라 단백질 조각 보완성 분석 결과 설계 했습니다. 이 분석 결과에 BirA *의 2 개의 비활성 파편 수 때 가까운 근접에서 있는 그들은 융합 하는 두 개의 상호 작용 단백질에 의해 활성 효소로 재조 립. 결과 분할 BioID 분석 결과 따라서 단백질 단백질 상호 작용의 한 쌍의 주위에 조립의 라벨 수 있습니다. 이 두 가지는 주어진 컨텍스트에서 상호, 제공 분할 BioID 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 특정 컨텍스트에 종속 기능 단위 분석을 다음 수 있습니다. 여기, 우리는 테스트 하 고 분할-BioID 상호 작용 단백질의 쌍에 적용 하는 단계별 프로토콜을 제공 합니다.
대부분 세포 기능 동적으로 조립 고분자 복합물 단백질에 의해 수행 됩니다, 단백질 단백질 상호 작용 (PPI)의 식별 생물 의학 연구에서 주요 노력 이다. 실제로, PPI 자주 질병에 폐지 하 고 치료제1에 대 한 잠재적인 목표를 나타냅니다. 가장 널리 사용 되는 메서드 PPI의 식별, 친 화력 정화 (AP) 접근을 위한 세포 세포의 용 해, 관심사의 단백질은 특히 행렬에 정화 하 고 관련된 단백질 질량 분석에 의해 확인 이후에 (MS)입니다. AP-MS는 강력한 접근, 그것은 일반적으로 수행 하지 않습니다 가난 하 게 녹는 단백질 복합물, 아주 일시적인 상호 작용 또는 subcellular 구조를 필요로 하는 PPI에 잘. 또한, 데이터의 해석 단일 단백질은 종종 여러 가지 단백질 복합물의 부분으로 PPI 네트워크의 동적 특성에 의해 복잡 될 수 있습니다.
BioID2 APEX23,4 등 근접 라벨 기술은 최근 AP MS 접근의 제한 사항 중 일부를 해결 하기 위해 개발 되었다. BioID에서 효소 BirA * (에 해당 하는 야생 타입 대장균 효소의 G115R 이체) catalyzes 정한 biotinyl-앰프 (바이오-앰프) 주 아민과 반응의 형성. 야생 타입 효소, 바이오-앰프의 활성 중심에 유지, 반대로 BirA * 해제 바이오 앰프 주변 환경에의 확산을 허용 합니다. 그러므로, 관심사의 단백질을 융합 하 고 셀에 표현, 근 단백질 biotinylated 10 nm5의 예상된 범위 내에서 될 수 있습니다. 이러한 근 위 표시는 다음 streptavidin 풀 다운에 의해 고립 된 단백질과 MS로 식별. AP-MS, 반대로 BioID 융합 단백질의 식이 필요합니다. 그것은 따라서만 적용할 수 있습니다 단백질 누구의 기능 태그 방해 하지. 또한, 라벨의 속도 느린, 일반적으로 6-24 h2,6, 도전 짧은 단백질의 탐지를 만들기. 아직, AP-MS에 비해, BioID MS 제공 합니다 여러 주요 장점: 첫 번째, 그 캡처 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상호 작용 두 번째, 레이블이 단백질 보다는 조립된 단지 세포 세포의 용 해; 다음 격리 됩니다. 셋째, streptavidin pulldowns 변성 버퍼 및 거친 세척 상태를 사용 하 여 허용 합니다. 따라서, 방법은 더 과도 또는 약한 상호 작용7 또는 특정에서 발생 하는 상호 작용에 민감하고 subcellular 구조8을 하드입니다.
그러나, 대부분의 단백질 보통 세포 신호 또는 수행 해야 하는 함수에 개장 수 큰 단지의 일부입니다. 따라서, 단일 단백질은 일반적으로 여러 단지, 뚜렷한 기능 단위에 대응, 고유 포함 및 PPI 중복의 부분 이다. 두 방법 모두 게 주어진된 단백질이 있을 수 있습니다, 모든 협회의 개요를 제공 하지만 그들은 개별 PPI의 상황을 해결 하기 위해 실패 합니다. 후자의 해상도 높이기 위해 설계 된 단백질 조각을 보완성 분석 결과 (PCA)는 2 개의 비활성 파편 BirA * (촉매 도메인에 포함 된 NBirA *, 그리고 CBirA * 재 활성화 도메인으로 볼 수 있는)의 수에 재어셈블 때 가까이에 두는 활성 효소로 단백질9상호 작용. 결과 분할 BioID 분석 결과는 단백질 상호 작용 단백질의 쌍의 주위에 조립 및 따라서 컨텍스트 식별 종속 단백질 어셈블리에 근접 종속 biotinylation을 집중 한다. 우리는 최근 중재 하는 miRNA 유전자 침묵 통로9에 관련 된 두 가지 단백질 복합물을 해결 하 여 분할-BioID의 뛰어난 해상도 파워를 시연.
전부, 단일 및 간단한 분석 결과, 분할 BioID 수 있습니다 발견 하 고 구체적으로 정의 된 기능 단위는 주어진된 단백질 관련, 해당 단백질 복잡 한의 추가 상호 작용 단백질 알려져 제공에 PPI를 할당.
개요 절차 플라스 미드, biotinylation 상호 작용 유도 대 한 테스트 하는 방법 및 질량 분석 분석에 대 한 biotinylated 단백질을 분리 하는 방법 분할 BioID에 관심사의 유전자를 복제 하는 방법을 설명 합니다. 여기 과도 transfection에 따라 절차를 설명 합니다. 융해 단백질의 표정은 dox 매체에 추가 금액에 의해 조정 될 수 있다, 그러나 과도 transfection 조잡 한 overexpress 융합 단백질은 내 생에 비교 될 때 일부 셀과 비 균질 단백질 식으로 이어질 수 있습니다. 대조 물입니다. 이 해당 interactomes의 왜곡 하 고 충실 하 게 내 인 성 단백질을 포함 하는 상호 작용을 반영 하지 않는 PPI로 이어질 수 있습니다. 그것은 따라서 일반적으로 분할 BioID 과도 시스템으로 설정 된 후 안정 된 세포를 구성 하는 것이 좋습니다. 플라스 미드 Flp 중재 재결합 시스템과 호환 되며 동일한 tet 응답 요소의 규정의 두 유전자 장소. 필요한 경우, 그리고 호환 포유류 세포와 함께 사용 하는 경우, 안정적인 유도할 수 있는 세포의 쉽게 만들을 수 있습니다. 예를 들어 우리 rtTA 항생물질 활성화 녹음 방송 활성 제와 항생물질 중재 하는 유전자 발현 단단히 규제12수 있는 독특한 대상 게놈 소재 시를 표현 하는 헬러-EM2-11 줄을 사용 합니다. 이 세포 선 및 재결합 Flp 중재를 사용 하 여, 2-3 주 이내는 transgene의 복사본을 하나만 포함 하는 안정적인 셀 라인을 얻을 수 있습니다. 또는, 하나 또한 관심사의 유전자의 네이티브 게놈 loci에 BirA * 조각 소개 현재 게놈 편집 기술을 사용할 수 있습니다.
태그는 단백질에 의존 하는 모든 분석 결과에서 하나 결과 융해 단백질 기능 인지 고려 해야 합니다. 사용할 수 있는 데이터는 관심사의 단백질 (GFP 이미징 연구에 대 한)와 예 태그 기능 테스트는 유용 BirA * 조각 한다 결정을 복제 상류 또는 하류 관심의 유전자. 이러한 데이터를 사용할 수 있는 하나 N 말기 테스트 해야 또는 C 말기 단백질 기능 분석 결과에 태그. 예를 들어 있는 생 단백질 노크 아웃 되었고 야생 타입 상황에 비해 셀 라인에서 융해 단백질의 활동을 테스트할 수 있습니다. 관심사의 단백질 모두 N 및 C 터미널 태그 경우, 둘 다 시험 되어야 한다. 실제로, BioID 실험, 융해 단백질의 방향22라벨의 효율성을 좌우할 수 있다. 또한, 우리는 관찰 그 때 분할 BioID 단백질의 쌍에 적용, 두 단백질의는 추가 중 하나는 NBirA * CBirA * 조각 또한 영향9라벨의 효율성. 분할-BioID 플라스 미드에는 16 아미노산 긴 글리신/떠들고 풍부한 링커 BirA * 조각에 관심사의 단백질을 결합 했다 다른 PCA23 에서 촬영 하 고 모든 상호 작용 단백질에 대 한 우리를 위해 일했다 테스트 했습니다 지금까지. 그러나, 하나는 일부 단백질 쌍 짧은 지 또는 긴지를 링커 함께 잘 작동 수 있습니다 고려해 야 합니다. 최종적인 노트의 또 다른 분석 결과 Bollen 그룹24에 의해 설명 되었다. 이 분석 결과에 BirA * 우리 (E256/G257) 보다 다른 사이트 (E140/Q141)에서 분할 됩니다. 우리 모두 분할 BioID 맛 측면-의해-측면 테스트 한 E256/G257,이 프로토콜에 설명 된 두 개의 상호 작용 단백질에 결합 될 때 더 강한 재 활성화를 이끌어 발견9.
이 방법의 1 개의 일반적인 결점은 라벨의 느린 속도. 일반적으로 6 ~ 24 h 보육 시간 biotin 감지할 수 biotinylation6, 단백질 복합물의 동적 개장 공부에 대 한이 기술의 사용을 제외를 얻을 필요가 있다. 이 분석 결과 부분적으로 상호 작용 하는 두 단백질 활성화만이 경고를 해결, 하는 동안 라벨의 저속 응답 매우 동적 프로세스 또는 짧은 단백질 분석 공부에 대 한 그것의 사용을 배제. 설계 된 과산화 효소 APEX2 1 분3이내 근 단백질의 효율적인 라벨 홍보로 알려져 있다. APEX2에 따라 PCA BioID 파생 분석 실험의 느린 표시 속도 한계를 주소 따라서 수 있습니다. 증거의 원리 연구 같은는 분할 APEX2 분석 결과25설명. 그러나, homodimerizing 단백질은 성공적으로 biotinylated, 증명 남아 여부 분석 결과 또한 사용할 수 있습니다 레이블 및 단백질 단백질 상호 작용의 한 쌍의 주위에 조립 확인 하. 최근 감독된 진화 했다 TurboID 그리고 miniTurbo, 10 분26으로 훨씬 짧은 표시 시간 창을 허용 하는 향상 된 활동의 BirA * 2 개의 이체를 만드는 데 사용 됩니다. 분할-BioID이 새로운 변종에 적응 추가 애플 리 케이 션의 광범위 한 분야에이 기술의 사용을 확장할 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 독일 우수 이니셔티브 (CellNetworks DFG 실 81)와 공동 연구 센터 SFB638 부분 회계를 통해 독일 연구 위원회 (DFG)에 의해 융자 되었다.
Acetic acid (glacial) | VWR | 20104.298 | To make TAE buffer |
Agarose | Sigma | A9539 | Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction |
Ammonia solution 25% NH3 | Bernd Kraft | 6012 | To dissolve biotin |
Ampicillin | Sigma | A9518 | To select transformed bacteria |
Bioruptor plus sonification device | Diagenode | B01020001 | Other sonification devices are also ok |
Biotin | Sigma | B4639 | To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation |
Bovine serum albumin fraction V | Carl Roth | 8076 | Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays |
Bradford Ultra reagent | Expedeon | BFU05L | Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents |
Cell scrappers | TPP | 99002 | Any other model is also fine |
ClaI | New England Biolabs | R0197 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion) |
DMEM medium | Sigma | D6046 | If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium |
DNA miniprep kit | Sigma | PLN350 | Any other kit is also fine |
Doxycycline | Applichem | A2951 | Dox is light sensitive |
DTT | Applichem | A2948 | Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh |
DyLight 680-conjugated streptavidin | Thermo scientific | 21848 | to use with a LiCor Western blot scanning device |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65002 | The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution) |
EDTA | Applichem | A5097 | Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder |
Ethanol | Sigma | 32205 | Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1 |
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Any other kit is also fine |
HCl 37% | Merck | 1.00317.1000 | To adjust pH of biotin stock solution |
HEPES | Carl Roth | 6763 | Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4 |
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm | Millipore | IPFL00010 | This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device |
LiCl | Grüssing GmbH | 12083 | Make a 5M stock solution |
Odyssey CLx imaging system | LI-COR | N/A | To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-2 | Any other transfection reagent is also fine |
Milk powder | Carl Roth | T145 | To block Western blot membranes |
MluI-HF | New England Biolabs | R3198 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion) |
Na-deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 10% (w/v) stock solution |
NaCl | Sigma | 31434 | Make a 5M stock solution |
NP-40 (Nonidet P40 substitute) | Sigma | 74385 | Make a 20% (v/v) stock solution |
PacI | New England Biolabs | R0547 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion) |
Phosphate buffer saline (PBS) | Sigma | 806552 | To wash cells before scrapping |
PmeI | New England Biolabs | R0560 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion) |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | Added to the lysis buffer to prevent protein degradation |
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP | Addgene | 90003 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir | Addgene | 90004 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP | Addgene | 90008 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir | Addgene | 90009 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
Q5 High-Fidelity PCR kit | New England Biolabs | E0555S | To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine. |
Quick ligation kit | New England Biolabs | M2200S | To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine. |
RunBlue 4-20% SDS precast gels | Expedeon | BCG42012 | To use when running samples for MS analysis |
RunBlue LDS Sample Buffer | Expedeon | NXB31010 | Running buffer for the RunBlue precast gels |
SDS | Sigma | 5030 | Comes as a 20% stock solution |
tet-free serum | Biowest | S181T | we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins |
Trans-Blot Turbo Transfer system | Bio-Rad | 1704150 | High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine |
Tris | Carl Roth | 4855 | Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8) |
Triton X-100 | Applichem | A4975 | Make a 20% (v/v) stock solution |
Tween-20 | Carl Roth | 9127 | Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step |