Summary
כאן, אנו מציגים את הקרנת הסרט פרה coumarins נגד סרטן באמצעות תרבות תלת-ממד, דג זברה.
Abstract
הקרנת קליניים בתוך חוץ גופית ו ויוו של סוכני טיפולית הרומן הן כלי חיוני בגילוי סרטן סמים. למרות שורות תאים סרטניים אנושיים מגיבים תרכובות טיפולית תרביות תאים חד שכבתי (מימד) 2D, 3D תרבות מערכות פותחו כדי להבין את היעילות של תרופות יותר מבחינה פיזיולוגית הרלוונטיים במודלים. בשנים האחרונות, שינוי פרדיגמה נצפתה במחקרים קליניים כדי לאמת את העוצמה של מולקולות חדשות במערכות תרבות תלת-ממד, ליתר דיוק מחקה את microenvironment הגידול. מערכות אלה מאפיינים את המחלה באופן רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית ולעזור כדי לקבל יותר מכניסטית תובנה והבנה של הכדורים מינון תרופתי של מולקולה נתונה. יתר על כן, עם המגמה הנוכחית בשיפור ויוו סרטן מודלים, דג זברה התפתחה כמודל חוליות חשוב להעריך ויוו היווצרות הגידול וללמוד את ההשפעה של סוכני טיפולית. . חקרנו את היעילות הטיפולית של hydroxycoumarin OT48 לבד או בשילוב עם BH3 מימטיקה ב סרטן ריאות תאים בטור A549 באמצעות שלוש מערכות התרבות 3D שונים כולל מבחני היווצרות המושבה (CFA), ספרואיד היווצרות assay (SFA) ו אין ויוו xenografts דג זברה.
Introduction
סרטן נגרמת על ידי מוטציות תאיות, כתוצאה מכך הביוכימי איתות המסלולים הם שיבשו מפעילה חלוקת תאים בלתי מבוקרת והתנגדות מוות של תאים. גידולים להפריע פונקציות פיזיולוגיים של העיכול, לחוצה, הדם מערכות, רקמות שכנות לאחר מכן1. למרות מאמצי מחקר מקיף, הסרטן נשאר המחלה שכיחה ביותר מסכני העולם2. רפואה דיוק הוכר יסוד ותרופות לסרטן בעתיד. גופים מולקולריים חדשים נבחנים באופן שגרתי בשילוב עם תרופות קיימות כדי לשפר את התוצאה הקלינית.
אולם, אחת המגבלות משמעותיים הקשורים לפיתוח טיפולים ממוקדים יעיל החדש הוא הכישלון של מבחני נפוץ לדמות התוצאה ביולוגי מדויק של חשיפה לסמים3. גילוי תרופות הסרטן עדיין בעיקר מסתמך על בדיקת יעילותם של סוכני טיפולית בתוך שורות תאים סרטן בתרבית בתרבויות טפט 2D, אשר קשה לאמת בניסויים קליניים4. לכן, אין עניין הולך וגובר לפתח מודלים סרטן יותר עדיף לחקות את התכונות מקורית של גידולים ויוו5. בשנים האחרונות, הביא עניין הולך וגדל בתרבות תלת-ממד מודלים לפיתוח מתודולוגיות שיפור לייצר מודלים 3D הגידול5.
כאן, אנו מציגים גישה עם שלוש טכניקות תרבות שונים תא 3D המאפשר לשפר את ההבנה של עוצמת hydroxycoumarin OT486 בשילוב עם BH3 מימטיקה לפני יותר בעומק ויוו מבחני. השיטה שלנו מורכב המשלב המושבה לבין SFAs עם ויוו הגידול היווצרות מבחן המבוסס על מודל של דג זברה נוסף לאמת את היעילות של השילוב של OT48 ו BH3 מימטיקה בתאי סרטן ריאות, לעקוב אחר התקדמות סרטן ב חי . אורגניזם.
מבחני היווצרות המושבה משמשים באופן שגרתי כדי להעריך את היעילות של תרופות נגד סרטן סוכנים עבור סרטן הן מוצק כמו גם hematopoietic. וזמינותו קובעת את היכולת של תא כדי להתרבות ללא הגבלת זמן ויוצרים מושבות7. ההשפעה של סוכן נגד סרטן על המושבה ויוצרים את היכולת של תאי נקבעת על ידי ירידה של מספר ו/או גודל של המושבות.
Spheroids מייצגים במבחנה הגידול מודלים ומגישים כפלטפורמה ההקרנה בעלות נמוכה עבור סוכני נגד סרטן. Spheroids אגרגטים של תאי גידול ההשעיה או מוטבע בתוך מטריצה תלת-ממד. גישה זו הוא בשימוש נרחב והתרופות הקרנה ומחקרים של הגידול, התפשטות וצמיחה של החיסון אינטראקציה עם8.
כדי להבין באופן מלא את המאפיינים של תרופה חדשה, זה חיוני כדי ניסויים ויוו מכרסמים. עם זאת, שיטה זו המקובלת היא זמן רב ויקר. בשנים האחרונות, דג זברה (רזבורה rerio) הפך אורגניזם מעבדה נרחב למד כי הוא זול יותר ומהיר יותר לגדל. גידולים שפותחה בגישה דג זברה מייצגים תלת-ממד תא תרבות אך בתוך הגדרת ויוו של חוליות9.
בסך הכל, נשתמש כאן שלוש גישות התרבות 3D שונים לרבות פרנקים, SFAs דג זברה ויוו היווצרות הגידול כדי להדגים את הקיבולת נגד סרטן של hydroxycoumarin OT48 במודל התא סרטן A549 ריאות בשילוב עם BH3 מימטיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. המושבה היווצרות מבחני
- התרבות התאים A549-ריכוז של תאים/ס מ 20,0002 ב-15 מיליליטר RPMI1640 תא בינוני תרבות בתוספת 10% FBS (סרום שור עוברית) ואנטיביוטיקה % 1 בבקבוקון2 75 ס מ ב חממה2 CO-CO 37 ° C ו-5%2.
- ביום של הניסוי, לקבוע את הריכוז תא על-ידי שימוש של hemocytometer. לאסוף 50,000 תאים על ידי צנטריפוגה ב x 400 גרם במשך 7 דקות צינור microcentrifuge 1.5 mL והשהה מחדש תאים µL 100 ל- 1 x סטרילי PBS (פוספט Buffered מלוחים) 1.5 mL צינורות.
- לוותר על 1.1 מיליליטר מוצק למחצה מבוססי methylcellulose בינוני (MCBM) 15 מ"ל צינורות עם multipipette. מכינים שפופרת אחת עבור כל תנאי.
- להוסיף µL 110 של FBS 1.1 מ של MCBM באמצעות micropipette P200.
- זרעים תאים-תאים למ"ל 1,000. לאסוף µL 2.4 תא השעיה מן הפתרון מניות (50,000 תאים ב- 100 µL ל- 1 x PBS) באמצעות micropipette P2 ולהוסיף 1.1 מ של MCBM בתוספת 10% FBS.
- לאחר הוספת התאים, מערבולת הצינורות עבור 1 דקות, החזקתם אנכית במהירות הגבוהה ביותר לערבב היטב MCBM ותאים.
- הוסף מבחן תרכובות (OT48 לבד או בשילוב עם A1210477). הכן צינור בנפרד כפקד לחומר המשמש (כאן דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)). בהתאם הריכוז של תרכובות ונפח נוסף עבור כל תנאי, הפקד הממס יכלול את הריכוז הגבוה ביותר של הממס המשמש את דילולים של הבדיקה במתחם, כדי להעריך על תופעות לוואי שנגרמו על ידי הממס.
- וורטקס צינורות במשך דקה אחת.
- עבור כל assay, להוסיף 1 מ"ל של התערובת עם micropipette P1000 מרכז טוב צלחת תרבות תא 12-. טוב.
- למלא בארות ריק עם 1 מ ל מים סטרילי או PBS x 1 לייצב את הלחות.
- תקופת דגירה תרבות צלחות של 10 ימים באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2.
- לאחר 10 ימי דגירה, להוסיף 200 µL של MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium ברומיד) מניות פתרון (5 מ"ג/מ"ל) כל טוב להגיע ריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.
- דגירה 10 דקות בתוך אינקובטור-CO 37 ° C ו-5%2. מושבות בת קיימא יהפוך ויולט.
- ללכוד את התמונה באמצעות מצלמה דיגיטלית באמצעות לוח רקע לבן (LAS דיה לבנה מגש). השתמש בהגדרות הבאות: השיטה, דיגיטייז; סוג החשיפה, דיוק; זמן החשיפה, ידני, לשנייה אחת; רגישות/רזולוציה, ברזולוציה גבוהה. לשמור את התמונה בתבנית tiff.
- לכמת מושבות בת קיימא באמצעות תוכנת ImageJ. בחר בתפריט "תמונות | סוג | 8 סיביות". בתפריט בחר ' התאם | הסף". הגדר את הסף ולשמור קבועה עבור כל התנאים; בתפריט בחר "נתח | ניתוח חלקיקים". שמירת הנתונים ולנתח עם תוכנת סטטיסטיקה עבור ייצוג גרפי.
2. ספרואיד היווצרות Assay
- התרבות תאים A549-ריכוז של תאים/ס מ 20,0002 ב- 75 ס מ2 מבחנות עם 15 mL RPMI 1640 בינוני בתוספת 10% FBS ו 1% אנטיביוטיקה.
- ביום של הניסוי, להכין 96 ובכן צלחת U-התחתון.
- צלחת 10,000 תאים לבאר וכבר מכילה את המתחם עניין (כאן 50 מיקרומטר של OT48) ו/או 20 מיקרומטר של A1210477. לכוון את עוצמת הקול הסופי כדי 100 µL תא תרבות בינוני. מספר התאים היוצרים spheroids אחיד עם הגבול החיצוני ללא פגע נחשב מספיק כדי spheroids טופס.
- תקופת דגירה של 3 ימים באינקובטור 37 ° C וכן ב 5% CO2.
- לאחר 3 ימי דגירה, לכידת תמונות של spheroids באמצעות מיקרוסקופ אור עם 4 x הגדלה.
3. דג זברה Xenograft Assay
הערה: גישה טכנית זו הוא מדמיין כמו שרטוט (איור 1).
-
הכנה של ריאגנטים מניות
- להכנת 1 ליטר של 30 x הפתרון של Danieau: 1740 מ"מ NaCl, 21 מ מ אשלגן כלורי, 12 מ מ MgSO4∙7H2O, 18 מ מ Ca (3)2ו- 150 מ מ HEPES. התאם את רמת ה-pH של המאגר כדי 7.6 באמצעות מד pH.
- להכין 1% (50 x) tricaine פתרון: לפזר 20 מ ג של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) ב- 2 מ ל מים מזוקקים.
- להכין 1% פנול אדום-PBS פתרון: להוסיף 2 µL פנול אדום מלח נתרן לפתרון µL 198 בפתרון PBS סטיריליים צינור 1.5 µL.
- להכין 3% methylcellulose: להוסיף דור 3 של methylcellulose 100 מ של 1 x הפתרון של Danieau.
-
ייצור הביצים דג זברה, דגירה
- הפרד בין נקבה אחת ואחד דג זברה זכר במיכל מחיצה מלאה עם מים מהברז עיקור UV ומסוננות ב 28.5 ° C בחושך. לאחר 24 שעות של הפרדה, מערבבים דג של שני המינים כדי להזדווג. העברה הביצים ממיכל ההזדווגות צלחת פטרי המכיל 5 מ של הפתרון של Danieau טריים.
- לשטוף ביצים שלוש פעמים עם 5 מ של הפתרון של Danieau. לשטיפת מכוניות, תשאף היטב את הביצים עם פיפטה, העברה עד 5 מ"ל של פתרון טריים. תקופת דגירה של 8 שעות ב- 28.5 ° C.
- אחרי 8 שעות של דגירה בפתרון של Danieau, שנה, לאודנום של Danieau 0.03% 1-phenyl-2-thiourea (פרופילתיואוראציל) כדי לעכב פיגמנטציה. למיין את הביצים אטום (מופרית או המכיל לא מפותחים עוברי) כדי למנוע זיהום.
-
העובר dechorionation
- h 24 שעות ביממה פוסט הפריה (hpf), העוברים דג זברה dechorionate באמצעות מלקחיים חדה. דגירה הבקיעה עוברי בפתרון של Danieau עם 0.03% פרופילתיואוראציל ב 28.5 ° C עד 48 hpf.
-
הכנת תרכובת שטופלו תא
- זרעי A549 תאים-תאים/ס מ 20,0002 ב 25 ס מ2 תרבות מבחנות. לאחר 24 שעות של זריעה, להוסיף תרכובות (OT48 כאן ב 50 מיקרומטר, ו/או A1210477 ב- 20 מיקרומטר) במשך 24 שעות ביממה באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO2. להגדיר את זמן הטיפול בכל המתחם כדי לשמור על הכדאיות של התאים, אבל לבצע אותם לקראת מוות של תאים. הפעם צריך נקודת בנפרד להגדיר מבוסס על הכדאיות תא, המורפולוגיה. סמנים מולקולריים.
- שעתיים לפני סוף הטיפול, הכתם תאים עם 4 מיקרומטר של התא פלורסנט המעקב לצבוע ס מדיל-CO 37 ° C ו-5%2. לאחר שעתיים של דגירה, trypsinize תאים עם 0.05% טריפסין-EDTA, לדלל 106 תאים ב- 50 µL של פנול אדום-PBS פתרון לפני ההזרקה.
-
מיקרו-הזרקה של תאי הסרטן על היווצרות xenograft
- עזים ומתנגד דג זברה בפתרון tricaine 0.02% במשך 5 דקות עד שיספיקו להתמקם על צלחת אגר.
- משוך 1.0 מ מ (מחוץ קוטר (OD) זכוכית נימי) מאת פולר micropipette (תוכנית הגדרות: 300 p:, חום: 260, משוך: ול 60,: 50, זמן: 200). חותכים את microcapillary עם מזרק כדי ליצור קצה חד. לטעון microcapillaries עם 20 µL של התא/פנול אדום-PBS פתרון. הגדר הזרקה בלחץ והזמן כדי לוותר על 2 nL לכל זריקה.
- להזריק 100-200 תאים לתוך שק החלמון על ידי שהזרקת 6 עד 10 nL באמצעות זריקות 3 עד 5. לאחר ההזרקה, לאפשר דגים לשחזר למשך 10-30 דקות ב 5 מ של הפתרון של Danieau טריים המכילים פרופילתיואוראציל פתרון. מוקד בדגים. ובכן 24 צלחות עם 1 מ"ל של הפתרון של Danieau המכילה פתרון פרופילתיואוראציל, תקופת דגירה של 72 h ב- 28.5 ° C.
- לאחר 72 h של דגירה, עזים ומתנגד דגים בפתרון tricaine 0.02%, לשתק על משטח זכוכית עם ירידה של 3% methylcellulose. לצלם תמונות x 5 על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ באורך-גל של 620-750 ננומטר.
- לכמת את הגודל של גידולים פלורסנט באמצעות תוכנת ImageJ. בתפריט בחר "נתח | מדד". שמירת ערכים המתאימים לאות פלורסנט ולנתח עם תוכנת סטטיסטיקה עבור ייצוג גרפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
איור 2, סרטן ריאות תא קו A549 היה נזרע ב MCBM למושבות הטופס לאחר הטיפול עם OT48 לבד או בשילוב עם A1210477 מימטי BH3 בריכוזים המצוין. התוצאות הראו כי השילוב הקטינה באופן משמעותי מספר וגודל השטח הכולל של המושבות לאחר 10 ימים של דגירה.
איור 3, התאים A549 שטופלו OT48 לבד או בשילוב עם A1210477 מימטי BH3, הורשו טופס spheroids על ידי הטכניקה צלחת U-התחתון. לאחר 3 ימי דגירה, צולמו תמונות של spheroids. כימות spheroids נעשה באמצעות תמונה J ו- 3D תמונות נוצרו.
איור 4, A459 תאים שטופלו OT48 לבד או בשילוב עם A1210477 מימטי BH3 במשך 24 שעות ביממה, מזריקים שק החלמון דג זברה. לאחר 72 h, כימות של גידולים פלורסנט המתייחס הפוטנציאל המעכבת של המתחם.
איור 1: תרשים סכמטי של התהליך הכולל של דג זברה וזמינותו xenograft. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: היווצרות המושבה עיכוב סינרגטי של A549 על ידי hydroxycoumarin OT48 BH-3 מימטי A1210477. (א) תמונות של המושבה assay היווצרות A549 שטופלו 50 מיקרומטר של OT48 ו/או 20 מיקרומטר של A1210477. (B-D) כימות של מספר, גודל ממוצע, השטח הכולל של המושבות. ניסויים התממשו דולר. פוסט הוק ניתוחים בוצעו. חשיבות סטטיסטית היו מוערכים ב- p-הערכים מתחת 0.05 ומיוצגים על-ידי האגדה הבאה: * p ≤0.05, * * p ≤0.01, * * * p ≤0.001, * * * p ≤0.0001; פוסט הוק מנתח Dunnett; Sidak). היסטוגרמות כל לייצג זאת אומרת ± SD לפחות שלושה ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: אפקט של OT48 ו/או A1210477 על היכולת של A549 תאים טופס spheroids. תמונות של A549 spheroids הגידול לאחר 3 ימים.
איור 4: עיכוב של היווצרות מסת הגידול A549 על ידי תרכובת. תמונות (A) מראה את ההשפעה המעכבת OT48 ו/או A1210477 את הגידול ויוצרים קיבולת של תאים A549 ס מדיל-צבעונית. (B) כימות של היווצרות הגידול. פוסט הוק ניתוחים בוצעו. חשיבות סטטיסטית היו מוערכים ב- p-הערכים מתחת 0.05 ומיוצגים על-ידי האגדה הבאה: * p ≤0.05, * * p ≤0.01, * * * p ≤0.001, * * * p ≤0.0001; פוסט הוק מנתח Dunnett; Sidak). היסטוגרמות כל לייצג זאת אומרת ± SD לפחות עשרה ניסויים עצמאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיעור של היווצרות המושבה שהושג עם MCBM תלויה בסוג התא. בדרך כלל, עבור תאים שאינם מחסידי, מספר מושבות הוא הרבה יותר גבוה לעומת תאים חסיד. הבחנו כי תאים A549 הקימו מושבות 30 עד 40 לאחר 10 ימים. בעבר דיווחנו על תאי סרטן שונים כי מספר מושבות הוא בין 200 ל-2509. התוצאות שלנו הראה כי OT48 לבד לא לייצר ירידה משמעותית של מספר מושבות לבד. עם זאת, בשילוב עם BH3 ויוצרים-יכולת מימטי של A1210477 המושבה, תאים A549 בסינרגיה צומצם. בעבר דיווחנו נגזרת hydroxycoumarin עוד את OT52 גם סיווג עם BH3 מימטיקה כדי לעכב את היכולת ויוצרים מושבה של תאים A549. ריכוז זריעה המוצע עשוי להשתנות בין עונה 1 פרק 103 1.5 x 103. פרנק באמצעות MethoCult היא טכניקה יקר באופן שגרתי המשמשת למדידת tumorigenesis בשורות תאים סרטן שונים, אבל יש כמה מגבלות. לעיתים קרובות ההתאוששות של מושבות בת קיימא לאחר הניסוי הוא לא נוח, התאים לא גדלים טוב פעם מבודד מן MCBM, נזרע RPMI1640 בינוני. עם זאת טכניקה קליניים מקובל היטב כדי להבין טוב יותר את המנגנון של התקדמות סרטן בסביבה תלת-ממד. התנאים צמיחה 3D מייצגים במדויק את הסביבה הטבעית של היווצרות הגידול באווירה ויוו . אולם, שיטה זו היא איטית, עבודה אינטנסיבית, אינו מתאים תפוקה גבוהה הקרנת10.
SFAs הופיעה עם תאים חסיד, לפופולריות רחבה בגילוי סרטן סמים כפי שהם מייצגים את תכונות פיזיולוגיות כמו הישרדות cell מוגברת, ומורפולוגיה הגידול גרעין ובשפתיים אשר מייצגים יותר מצב ויוו 11,12. הגודל הכולל מרקם, שלמות של spheroids מתקבל על ידי הטכניקה צלחת U-התחתון עשוי להשתנות בין שורות תאים. יתר על כן, הריכוז ההתחלתי של תאים נהגה טופס spheroids עשויים גם להשפיע התפתחותו הכללית. התוצאות שלנו הראה כי OT48 בשילוב עם BH3 mimeticA1210477 עכבות ספרואיד שלמות מופחתת ספרואיד ויוצרים את היכולת של תאי A549. בעבר דיווחנו עיכוב של A549 spheroids על ידי אחר נגזרת hydroxycoumarin בשילוב עם BH3 מימטיקה9. היתרונות העיקריים של שיטה זו הן הפארמצבטית ויחס עלות-תועלת. טכניקות טיפול נוספות הטכניקה כיסוי נוזלי משמשים גם שגרתי לפתח spheroids 3D של תאים סרטניים. בטכניקה זו התאים גדלים על צלחת תרבות שאינם מחסידי התא. תא כגיהנום שנאספו ואז והניח בתרבות השעיה על טופס spheroids. אולם, אחת המגבלות הגדולות הקשורים עם טכניקה זו היא העברת תא גושים לתרבות ההשעיה, אשר לא הוא נסבל היטב על ידי שורות תאים שונים. כדי להגדיל את התפוקה של תרכובת הקרנת מערכת כזו תרבות תלת-ממד, חברות מסוימות מפתחים סובסטרטים ספציפי מצורף נמוך assay צלחות, פיגומים שיפור היווצרות של מבנים תלת-ממד13. עם ההתקדמות הטכנית נוסף, פיתוח של מודל תלת-ממדי הגידול יותר ייצוגית יאפשר להבין טוב יותר פרמקולוגיה של תרכובות הרומן עבור סוג מסוים של סרטן.
דג זברה xenografts נחשבים את מבחני בעלי חיים חסכוניים ביותר בשימוש שגרתי עבור תרופה נגד סרטן פיתוח9,14. אנחנו אופטימיזציה מערכת ויוו דג זברה עם סוגים שונים של סרטן hematological ומוצקה, כמו גם עם החולה, נגזר תאים. ישנם מספר יתרונות השימוש דג זברה להקרנה סמים. בעקרון, הסמים ניתן להוסיף ישירות לתוך המים, לא צריך להיות מוזרק. יתר על כן, בגישה זו גם מספקת מידע על גלית נחמני (קליטה, הפצה, חילוף החומרים, והוצאת) מאפייני מועמד סמים. עם זאת, אחת המגבלות הגדולות של טכניקה זו היא כמה מולקולות אינם מסיסים במים, ולכן אינם מתאימים מיד להיחקר על ידי שיטה זו. כדי להתגבר על מגבלה זו, תאים סרטניים שטופלו תרכובות לשעבר vivo כדי להיות מוזרק דג זברה בשלב שבו תאים מחויבים, ובכל זאת לשמור על יכולת הקיום. התוצאות שלנו הראה כי A549 תאים שטופלו OT-48 או עם A1210477 מימטי BH3 לבד לא חריפה להפחית את הגידול ויוצרים את היכולת של תאי A549 בהשוואה לשילוב של OT48 ו A1210477. התבוננות זו תוקף נוסף שלנו במבחנה פרנק שבו השילוב הראה השפעה אנטי סרטניים משמעותית בהשוואה טיפולים פרטניים. בסך הכל, טכניקה זו יכול לתרום מיון מהיר של סמים באווירה פרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מחקר-סנו נתמך על ידי נבחרת מחקר קרן (ב- NRF) על ידי MEST של קוריאה למענק הגידול Microenvironment גלובל הליבה מחקר במרכז (GCRC), [גרנט מספר 2011-0030001]; המענק מחקר סיאול האוניברסיטה הלאומית ועל ידי המוח קוריאה (BK21), בנוסף לתוכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
