Summary
Aquí, presentamos la evaluación preclínica de cumarinas contra el Cáncer utilizando el pez cebra y cultura 3D.
Abstract
Investigación preclínica in vitro e in vivo de nuevos agentes terapéuticos son una herramienta esencial en el descubrimiento de fármacos de cáncer. Aunque las líneas celulares de cáncer humano responden a compuestos terapéuticos en cultivos de células de la monocapa (dimensional) 2D, 3D cultura sistemas fueron desarrollados para comprender la eficacia de fármacos en modelos más fisiológicamente relevantes. En los últimos años, se observó un cambio de paradigma en investigación preclínica para validar la potencia de nuevas moléculas en sistemas de cultivo 3D, concretamente imitando el microambiente tumoral. Estos sistemas caracterizan el estado de la enfermedad de una manera más fisiológico relevante y ayudan a obtener mejor visión mecanicista y la comprensión de la potencia farmacológica de una molécula dada. Por otra parte, la tendencia actual en la mejora de modelos de cáncer en vivo , pez cebra ha surgido como un modelo vertebrado importante a evaluar en vivo formación de tumor y estudiar el efecto de agentes terapéuticos. Aquí, hemos investigado la eficacia terapéutica de hidroxicumarina OT48 solo o en combinación con BH3 miméticos en línea de células de cáncer de pulmón A549 utilizando tres sistemas diferentes cultura 3D incluyendo ensayos de formación de Colonia (CFA), ensayo de formación esferoide (SFA) y en vivo xenoinjertos de pez cebra.
Introduction
El cáncer es causado por mutaciones celulares y como consecuencia bioquímicas vías de señalización se interrumpen provocando división celular incontrolada y resistencia a la muerte celular. Tumores de interfieran en las funciones fisiológicas del aparato digestivo, nervioso, circulatorio y posteriormente vecinos de tejidos1. A pesar de los esfuerzos de investigación extensa, el cáncer sigue siendo la enfermedad mortal más frecuente en el mundo2. Medicina de precisión ha sido reconocida como el fundamento de la terapéutica de cáncer futuro. Nuevas entidades moleculares se prueban rutinariamente en combinación con los medicamentos existentes para mejorar el resultado clínico.
Sin embargo, una de las limitaciones significativas asociadas con el desarrollo de nuevas terapias dirigidas eficientes es la falta de ensayos utilizados para simular el resultado biológico exacto de drogas exposición3. Descubrimiento de fármacos de cáncer todavía sobre todo se basa en la prueba de la eficacia de agentes terapéuticos en líneas celulares de cáncer cultivadas en cultivos monocapa 2D, que son difíciles de validar en ensayos clínicos4. Por lo tanto, hay un interés creciente para desarrollar mejores modelos de cáncer que imitan mejor las características nativas de tumores en vivo5. En los últimos años un creciente interés en los modelos 3D de la cultura dio lugar al desarrollo de mejores metodologías para producir tumor 3D modelos5.
Aquí, presentamos un enfoque con tres técnicas de cultivo celular 3D diferentes lo que permite para mejorar la comprensión de la potencia de la hidroxicumarina OT486 en combinación con BH3 miméticos antes más en profundidad en vivo ensayos. Nuestro método consiste en combinar la Colonia y SFAs con una en vivo tumor formación prueba basada en un modelo de pez cebra para validar la eficacia de la combinación de OT48 y BH3 miméticos en las células de cáncer de pulmón y monitorear la progresión del cáncer en una vida organismo.
Ensayos de formación de Colonia se utilizan habitualmente para evaluar la eficacia de los agentes contra el cáncer para los cánceres tanto sólidos como hematopoyéticos. El ensayo determina la capacidad de una célula a proliferar indefinidamente y forman colonias7. El efecto de un agente contra el cáncer sobre la capacidad de las células formadoras es determinado por la disminución del número o tamaño de las colonias.
Esferoides representan modelos de tumores en vitro y servir como una plataforma de proyección de bajo costo para agentes anticancerígenos. Esferoides son agregados de células en suspensión o embebidas en una matriz 3D. Este enfoque es ampliamente utilizado para la detección de drogas y estudios del tumor crecimiento, proliferación e inmune interacción8.
Para entender completamente las propiedades de un nuevo medicamento, es esencial para llevar a cabo experimentos en vivo en roedores. Sin embargo, este método convencional es costoso y desperdiciador de tiempo. En los últimos años, pez cebra (Danio rerio) se convirtió en un organismo de laboratorio ampliamente estudiado que es más barato y más rápido para subir. Tumores se convirtieron en el enfoque de cultura de pez cebra representan un 3D celular pero en el marco de en vivo de un vertebrado9.
En conjunto, utilizamos aquí tres enfoques diferentes cultura 3D incluyendo CFAs, SFAs y pez cebra en vivo tumor formación para demostrar la capacidad anticancerígena de hidroxicumarina OT48 en un modelo de celular A549 el cáncer de pulmón en combinación con BH3 miméticos.
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Protocol
1. Colonia formación ensayos
- Células A549 en cultivo en una concentración de 20.000 células/cm2 en 15 mL de RPMI1640 celular medio de cultivo suplementado con 10% FBS (suero bovino Fetal) y 1% antibióticos en un matraz de2 75 cm en un incubador de CO2 a 37 ° C y 5% CO2.
- En el día del experimento, determinar la concentración de células usando un hemocitómetro. Recoger 50.000 células por centrifugación a 400 x g por 7 min en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL y resuspender las células en 100 μl de PBS estéril x 1 (fosfato tampón salino) en tubos de 1,5 mL.
- Distribuir 1,1 mL de medio semisólido metilcelulosa-basado (MCBM) en tubos de 15 mL con una pipeta múltiple. Preparar un tubo para cada condición.
- Agregar 110 μl de FBS a 1,1 mL de MCBM utilizando una micropipeta P200.
- Células de las semillas en 1.000 células/mL. Recoger la solución (50.000 células en 100 μl de PBS 1 x) 2.4 μL de suspensión celular con una micropipeta de P2 y añadir a 1,1 mL de MCBM suplementado con 10% FBS.
- Después de añadir las células, vórtex los tubos durante 1 minuto, mantiene verticalmente a la máxima velocidad para mezclar MCBM y células bien.
- Añadir compuestos de prueba (OT48 solos o en combinación con A1210477). Preparar un tubo separado como un control para que el disolvente utilizado (aquí dimetilsulfóxido (DMSO)). Dependiendo de la concentración de los compuestos y el volumen añadido para cada condición, el control solvente incluirá la mayor concentración de solvente utilizado para las diluciones de la sustancia, de ensayo para evaluar los efectos adversos causados por el solvente.
- Tubos Vortex durante 1 minuto.
- Para cada ensayo, añadir 1 mL de la mezcla con una micropipeta P1000 al centro de una placa de cultivo celular 12-bien.
- Llenar vacíos pozos con 1 mL de agua estéril o 1 x PBS para estabilizar la humedad.
- Incubar las placas de cultivo durante 10 días en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
- Después de 10 días de incubación, añadir 200 μL de una solución de stock (bromuro de methylthiazolyldiphenyl-tetrazolio) de MTT (5 mg/mL) a cada pocillo para alcanzar una concentración final de 1 mg/mL.
- Incubar 10 minutos en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Colonias viables se pondrá violeta.
- Capturar la imagen utilizando una cámara digital usando la placa de fondo blanco (bandeja de LAS dia blanco). Utilice la siguiente configuración: método, digitalizar; Tipo de exposición, precisión; Tiempo de exposición, manual, 1 segundo; Sensibilidad/resolución, alta resolución. Guarda la imagen en formato tiff.
- Cuantificar las colonias viables utilizando el software ImageJ. Seleccionar el menú "imagen | Tipo | 8 bits". Seleccionar el menú "ajuste | Umbral". Ajuste umbral para controlar y mantener constantes para todas las condiciones; Seleccionar el menú "analizar | Analizar las partículas". Guardar los datos y analizar con un software de estadísticas para la representación gráfica.
2. esferoide formación ensayo
- Células A549 en cultivo en una concentración de 20.000 células/cm2 en2 frascos de 75 cm con 15 mL de Medio RPMI 1640 suplementado con 10% FBS y 1% antibióticos.
- En el día del experimento, preparar un 96 bien placa de U-inferior.
- Placa de 10.000 células en un pozo que ya contiene el compuesto de interés (aquí 50 μm de OT48) y 20 μm de A1210477. Ajustar el volumen final a 100 μl de medio de cultivo celular. El número de células que forman esferoides uniforme con un límite exterior intacto se considera esferoides de forma adecuado.
- Incubar durante 3 días en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2.
- Después de 3 días de incubación, capturar imágenes de los esferoides con un microscopio óptico de 4 aumentos.
3. pez cebra xenoinjerto ensayo
Nota: Este planteamiento técnico se visualiza como un esquema (figura 1).
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Preparación de los reactivos comunes
- Preparar 1 L de 30 x solución de Danieau: 1740 mM NaCl, KCl de 21 mM, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2y 150 mM HEPES. Ajustar el pH del buffer a 7.6 usando un medidor de pH.
- Preparar solución de Metanosulfonato 1% (50 x): disolver 20 mg de metanosulfonato de 3-aminobenzoato de etilo (Metanosulfonato) en 2 mL de agua destilada.
- Preparar la solución de rojo de fenol-PBS 1%: Añadir 2 μl de solución de sal de sodio rojo de fenol a 198 μl de solución de PBS esterilizada en un tubo de 1,5 μl.
- Preparar 3% metilcelulosa: Añadir a 100 mL de solución de Danieau 1 x 3 g de metilcelulosa.
-
Incubación y producción de huevos de pez cebra
- Separado una hembra y un pez cebra macho en un tanque de partición llenan con agua del grifo filtrada y esterilizada por rayos UV a 28,5 ° C en la oscuridad. Después de 24 h de separación, mezclar peces de ambos sexos para iniciar el apareamiento. Transferencia de óvulos fecundados del tanque del acoplamiento a una placa Petri que contiene 5 mL de solución de Danieau fresco.
- Lavar los huevos tres veces con 5 mL de solución de Danieau. Para el lavado, Aspire cuidadosamente los huevos con una pipeta de transferencia a 5 mL de solución fresca. Incubar durante 8 h a 28,5 ° C.
- Después de 8 h de incubación en la solución de Danieau, cambiar a solución de Danieau que contiene 0.03% 1-fenil-2-tiourea (PTU) para inhibir la pigmentación. Arreglar huevos opacos (no fecundados o que contienen embriones sin desarrollar) para evitar la contaminación.
-
Embrión dechorionation
- 24 horas post fecundación (hpf), embriones de pez cebra de dechorionate con unas pinzas afiladas. Incubar Incubar embriones en solución de Danieau con 0,03% PTU a 28,5 ° C hasta 48 hpf.
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Preparación de la célula tratada con compuesto
- Células A549 de semilla a 20.000 células/cm2 en frascos de cultivo de 25 cm2 . Después de 24 h de la siembra, añadir compuestos (aquí OT48 a 50 μm y o A1210477 a 20 μm) por 24 h en una incubadora a 37 ° C y 5% CO2. Configurar el tiempo de tratamiento para cada uno de ellos para mantener la viabilidad de las células pero cometer hacia la muerte celular. Esta vez punto deben configurarse individualmente basado en la viabilidad celular, morfología y marcadores moleculares.
- 2 h antes de finalizar el tratamiento, mancha las células con 4 μm del rastreador de celular fluorescente tinte CM Dil a 37 ° C y 5% CO2. Después de 2 h de incubación, trypsinize células con 0.05% tripsina-EDTA y diluya 106 células en 50 μl de solución de rojo de fenol-PBS antes de la inyección.
-
Microinyección de células cancerosas para formación de xenoinjerto
- Anestesiar el pez cebra en una solución de metanosulfonato de 0,02% por 5 min hasta que establecen en una placa de agar.
- Tire un 1,0 mm (fuera del diámetro (OD) capilar de vidrio) por un tirador de la micropipeta (programar ajustes: P: 300, calor: 260, tire: 60, VEL: 50 y el tiempo: 200). Corte el microcapillary con una jeringa para producir un borde afilado. Carga de microcapilares con 20 μl de células/fenol rojo-solución de PBS. Presión de inyección y el tiempo para dispensar 2 nL por inyección.
- Inyectar 100-200 células en el saco vitelino por inyección 6 a 10 nL a través de 3 a 5 inyecciones. Después de la inyección, permitir a los peces a recuperar de 10 a 30 min en 5 mL de solución de Danieau fresco que contiene solución PTU. Envío peces en placas de 24 pozos con 1 mL de solución de Danieau que contiene solución PTU son e incuban por 72 h a 28,5 ° C.
- Después de 72 h de incubación, anestesiar peces en una solución de metanosulfonato de 0,02% e inmovilizar en un portaobjeto con una gota de metilcelulosa al 3%. Tomar 5 fotos x por microscopía de fluorescencia a una longitud de onda de 620 a 750 nm.
- Cuantificar el tamaño de tumores fluorescentes por el software ImageJ. Seleccionar el menú "analizar | Medida". Guardar valores correspondientes a la señal fluorescente y analizar con un software de estadísticas para la representación gráfica.
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Representative Results
En la figura 2, cáncer de pulmón de células A549 fue sembrada en MCBM a colonias de forma después del tratamiento con OT48 solo o en combinación con BH3 mimética A1210477 en las concentraciones indicadas. Los resultados mostraron que la combinación reduce significativamente número, tamaño y superficie total de las colonias después de 10 días de incubación.
En la figura 3, las células A549 fueron tratadas con OT48 solos o en combinación con BH3 mimética A1210477 y fueron permitidas esferoides de forma mediante la técnica de placa de fondo U. Después de 3 días de incubación, se tomaron imágenes de esferoides. Cuantificación de los esferoides fue realizada utilizando Image J y 3D imágenes fueron generadas.
En la figura 4, A459 células fueron tratadas con OT48 solo o en combinación con BH3 mimética A1210477 durante 24 h e inyectadas en el saco de yema de huevo de pez cebra. Después de 72 h, cuantificación de tumores fluorescentes se corresponde con el potencial inhibitorio del compuesto.
Figura 1: esquema del proceso general del análisis de xenoinjerto de pez cebra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: formación de la colonia la inhibición sinérgica de A549 hidroxicumarina OT48 y BH-3 mimética A1210477. (A) imágenes de un ensayo de formación de Colonia A549 con 50 μm de OT48 y 20 μm de A1210477. (B-D) Cuantificación del número, tamaño promedio y superficie total de las colonias. Experimentos se realizaron por triplicado. Se realizaron análisis post hoc . Significados estadísticos fueron evaluados a los valores de p por debajo de 0,05 y representados por la siguiente leyenda: * p ≤0. 05, ** p ≤0. 01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; post hoc analiza Dunnett; Sidak). Los histogramas representan la media ± SD de por lo menos tres experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: efecto de OT48 o A1210477 en la capacidad de A549 células esferoides forma. Imágenes de esferoides de tumor A549 después de 3 días.
Figura 4: inhibición de la formación masiva de A549 tumor por un compuesto de. (A) imágenes muestran el efecto inhibitorio de la OT48 o A1210477 en el tumor que se forma la capacidad de las células A549 CM-Dil-manchadas. (B) cuantificación de la formación de tumores. Se realizaron análisis post hoc . Significados estadísticos fueron evaluados a los valores de p por debajo de 0,05 y representados por la siguiente leyenda: * p ≤0. 05, ** p ≤0. 01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; post hoc analiza Dunnett; Sidak). Los histogramas representan la media ± SD de al menos diez experimentos independientes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Las tasas de formación de la Colonia con MCBM depende del tipo de célula. Generalmente, para las células no adherentes, el número de colonias es mucho mayor en comparación con las células adherentes. Observamos que las células A549 formaron colonias de 30 a 40 después de 10 días. Previamente hemos reportado para las células de leucemia diferentes que el número de colonias es entre 200 a 2509. Nuestros resultados demostraron que solo OT48 no produjo una disminución significativa del número de colonias solo. Sin embargo, en combinación con BH3 mimética A1210477 capacidad formación de Colonia de células A549 sinérgicamente se redujo. Previamente informó otro hidroxicumarina derivado OT52 también sinergizado con BH3 miméticos para inhibir la capacidad de formación de Colonia de células A549. La concentración de siembra sugerida puede variar de 1 x 103 a 1.5 x 103. Utilizando MethoCult CFA es una técnica valiosa que se utiliza habitualmente para medir la tumorigénesis en varias líneas celulares de cáncer, pero tiene algunas limitaciones. A menudo la recuperación de colonias viables después de que el experimento es incómodo, y las células no crecen bien, una vez aislados MCBM y sembradas en medio RPMI1640. Sin embargo, es una técnica bien aceptada preclínica para comprender mejor el mecanismo de progresión del cáncer en un entorno 3D. Las condiciones de crecimiento 3D representan fielmente el entorno natural de formación de un tumor en un escenario en vivo . Sin embargo, este método es lento, mano de obra intensiva y no apto para alto rendimiento detección10.
SFAs realizadas con células adherentes y ha ganado gran popularidad en descubrimiento de fármacos de cáncer como exhiben características fisiológicas como la supervivencia creciente de la célula, morfología del tumor y un núcleo hipóxico que son más representativos de una situación en vivo 11,12. El tamaño, la textura y la integridad de esferoides obtenidos por la técnica de placa de fondo U pueden variar entre las líneas celulares. Por otra parte, la concentración inicial de células esferoides de forma también puede influir en su desarrollo general. Nuestros resultados mostraron que OT48 en combinación con BH3 mimeticA1210477 inhibido integridad esferoide y había reducido esferoide formando la capacidad de las células A549. Hemos divulgado previamente inhibición de esferoides A549 por otro hidroxicumarina derivado en combinación con BH3 miméticos9. Principales ventajas de esta técnica son la reproducibilidad y el costo efectividad. Otras técnicas como la técnica de recubrimiento líquido se utilizan habitualmente para desarrollar esferoides 3D de las células cancerosas. En esta técnica las células crecen en una placa de cultivo celular no adherente. Los grupos de células entonces se recogen y colocan en cultura de suspensión esferoides de forma. Sin embargo, una de las principales limitaciones asociadas con esta técnica es la transferencia de grupos de células a la cultura de la suspensión, que no es bien tolerado por varias líneas celulares. Para aumentar el rendimiento de tal sistema de la cultura 3D compuesto, algunas empresas están desarrollando sustratos específicos, las placas de ensayo de fijación baja y andamios mejora la formación de estructuras 3D13. Con más avances técnicos, desarrollo de un modelo más representativo del tumor 3D permitirá una mejor comprensión de la farmacología de compuestos novedosos para un tipo dado de cáncer.
Xenoinjertos de pez cebra son considerados como los más rentables ensayos animales utilizados habitualmente para el medicamento contra el cáncer desarrollo9,14. Hemos optimizado el pez cebra en vivo sistema con varios tipos de cáncer sólidos y hematológicos, así como con células derivadas del paciente. Hay un número de ventajas del uso de pez cebra para la detección de drogas. En principio, las drogas se pueden agregar directamente en el agua y no necesita ser inyectada. Por otra parte, este enfoque también proporciona información acerca de las propiedades ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción) de un candidato a fármaco. Sin embargo, una de las principales limitaciones de esta técnica es que algunas moléculas no son solubles en agua y por lo tanto no son inmediatamente aptos ser investigados por este método. Para superar esta limitación, las células cancerosas fueron tratadas con compuestos ex vivo para ser inyectado en el pez cebra en una etapa donde las células están comprometidas, sin embargo mantener la viabilidad. Nuestros resultados mostraron que las células A549 trataron con OT-48 o con BH3 mimética A1210477 solo no fuertemente redujo el tumor que se forma la capacidad de las células A549 en comparación con una combinación de OT48 y A1210477. Esta observación más validado nuestro en vitro CFA donde la combinación demostró un efecto significativo contra el cáncer en comparación con tratamientos individuales. En conjunto, esta técnica puede contribuir a la detección rápida de drogas en un entorno de preclínica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Investigación en SNU es apoyada por la Fundación Nacional de investigación (NRF) de MEST de Corea para la concesión de microambiente Global núcleo investigación centro (GCRC) Tumor, [número de concesión 2011-0030001]; por la beca de investigación de Universidad Nacional de Seúl y Corea de cerebro (BK21) más el programa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
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