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Cancer Research

Spheroids, कॉलोनी के गठन की परख, और Zebrafish Xenografts द्वारा विरोधी अनंतमूलि OT48 की सी गतिविधि के नैदानिक मूल्यांकन

Published: June 26, 2018 doi: 10.3791/57490
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Pharmacy, College of Pharmacy, Seoul National University
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम 3 डी संस्कृति और zebrafish का उपयोग कर विरोधी coumarins के नैदानिक स्क्रीनिंग प्रस्तुत करते हैं ।

Abstract

इन विट्रो में और vivo पूर्व नैदानिक स्क्रीनिंग उपंयास चिकित्सीय एजेंटों के कैंसर की दवा खोज में एक आवश्यक उपकरण हैं । हालांकि मानव कैंसर कोशिका लाइनों 2d (आयामी) monolayer सेल संस्कृतियों में चिकित्सीय यौगिकों का जवाब, 3 डी संस्कृति प्रणालियों और अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडलों में दवाओं की प्रभावकारिता को समझने के लिए विकसित किया गया । हाल के वर्षों में, एक बदलाव पूर्व में मनाया नैदानिक अनुसंधान के लिए 3 डी संस्कृति प्रणालियों में नए अणुओं की शक्ति को मांय किया गया था, और अधिक ठीक ट्यूमर microenvironment नकल उतार । इन प्रणालियों एक अधिक शारीरिक प्रासंगिक तरीके से रोग राज्य विशेषताएं और बेहतर यंत्रवत अंतर्दृष्टि और एक दिया अणु की औषधीय शक्ति की समझ हासिल करने में मदद । इसके अलावा, vivo कैंसर मॉडल में सुधार लाने में मौजूदा रुझान के साथ, zebrafish एक महत्वपूर्ण हड्डीवाला मॉडल के रूप में vivo ट्यूमर के गठन में मूल्यांकन और चिकित्सकीय एजेंटों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उभरा है । यहां, हम hydroxycoumarin OT48 अकेले या फेफड़ों के कैंसर सेल लाइन A549 में BH3 mimetics के साथ संयोजन में कॉलोनी गठन की परख सहित तीन अलग 3 डी संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करके की चिकित्सीय प्रभावकारिता की जांच की, अंडाकार आकृति गठन परख (SFA) और में vivo zebrafish xenografts.

Introduction

कैंसर सेलुलर उत्परिवर्तनों के कारण होता है और एक परिणाम के रूप में जैव रासायनिक संकेत रास्ते अनियंत्रित कोशिका विभाजन और कोशिका मृत्यु के लिए प्रतिरोध को ट्रिगर बाधित कर रहे हैं । ट्यूमर पाचन, तंत्रिका, संचार प्रणालियों और बाद में पड़ोसी ऊतकों के शारीरिक कार्यों के साथ हस्तक्षेप1. व्यापक अनुसंधान प्रयासों के बावजूद, कैंसर दुनिया में सबसे अधिक प्रचलित जीवन-धमकी रोग2रहता है । प्रेसिजन चिकित्सा भविष्य कैंसर चिकित्सकीय की नींव के रूप में मांयता प्राप्त किया गया है । नई आणविक संस्थाओं नियमित रूप से मौजूदा दवाओं के साथ संयोजन में परीक्षण कर रहे है नैदानिक परिणाम में सुधार होगा ।

हालांकि, महत्वपूर्ण नई कुशल लक्षित चिकित्सा के विकास के साथ जुड़े सीमाओं में से एक आमतौर पर इस्तेमाल किया परख की विफलता के लिए दवा जोखिम3के सटीक जैविक परिणाम अनुकरण है । कैंसर की दवा खोज अभी भी ज्यादातर कैंसर सेल में चिकित्सकीय एजेंटों की प्रभावकारिता परीक्षण पर निर्भर करता है 2 डी monolayer संस्कृतियों, जो नैदानिक परीक्षणों4में मांय करने के लिए मुश्किल है संस्कृति लाइनों में । इसलिए बेहतर कैंसर मॉडल विकसित करने के लिए रुचि बढ़ रही है जो वीवो5में ट्यूमर की देशी सुविधाओं की बेहतर नकल है । हाल के वर्षों में, 3 डी संस्कृति मॉडल में एक बढ़ती ब्याज 3 डी ट्यूमर मॉडल5का उत्पादन करने के लिए सुधार के तरीके के विकास के परिणामस्वरूप ।

यहां, हम तीन अलग 3 डी सेल संस्कृति के साथ एक दृष्टिकोण वर्तमान BH3 mimetics के साथ संयोजन में hydroxycoumarin OT486 की शक्ति की समझ में सुधार की अनुमति के लिए और अधिक से पहले vivo परख में गहराई में । हमारा तरीका एक zebrafish मॉडल पर आधारित एक vivo ट्यूमर गठन परीक्षण में एक के साथ कॉलोनी और SFAs संयोजन के होते हैं और फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं में OT48 और BH3 mimetics के संयोजन की प्रभावकारिता को मान्य करने के लिए और एक जीवित में कैंसर प्रगति की निगरानी जीव.

कॉलोनी गठन परख नियमित रूप से दोनों के लिए ठोस के रूप में अच्छी तरह से टेम कैंसर के लिए विरोधी एजेंटों की प्रभावकारिता का आकलन किया जाता है । परख एक सेल की क्षमता को अनिश्चित काल के पैदा करना और फार्म कालोनियों7निर्धारित करता है । कोशिकाओं की कॉलोनी बनाने की क्षमता पर एक विरोधी एजेंट के प्रभाव की संख्या में कमी और कालोनियों के आकार के द्वारा निर्धारित किया जाता है ।

Spheroids इन विट्रो ट्यूमर मॉडल में प्रतिनिधित्व करते हैं और विरोधी एजेंटों के लिए एक कम लागत वाली स्क्रीनिंग मंच के रूप में काम करते हैं । Spheroids निलंबन में बढ़ रही है या एक 3 डी मैट्रिक्स में एंबेडेड कोशिकाओं के समुच्चय हैं । इस दृष्टिकोण व्यापक रूप से दवा स्क्रीनिंग और ट्यूमर के विकास, प्रसार और प्रतिरक्षा संपर्क8के अध्ययन के लिए प्रयोग किया जाता है ।

एक नई दवा के गुणों को पूरी तरह समझने के लिए, यह कुतर पर vivo प्रयोगों में आयोजित करने के लिए आवश्यक है । हालांकि, इस पारंपरिक विधि महंगा है और समय लगता है । हाल के वर्षों में, zebrafish (ढाणियो rerio) एक व्यापक रूप से अध्ययन प्रयोगशाला जीव है कि सस्ता और तेजी से बढ़ा है बन गया । ट्यूमर zebrafish में विकसित एक 3 डी सेल संस्कृति दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं, लेकिन एक हड्डीवाला9की सेटिंग में वीवो के भीतर ।

कुल मिलाकर, हम यहां CFAs, SFAs और vivo ट्यूमर गठन में zebrafish सहित तीन अलग 3 डी संस्कृति दृष्टिकोण का उपयोग hydroxycoumarin OT48 के संयोजन में एक फेफड़ों के कैंसर A549 सेल मॉडल में BH3 mimetics की क्षमता विरोधी प्रदर्शन करने के लिए ।

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Protocol

1. कॉलोनी गठन परख

  1. संस्कृति A549 कोशिकाओं की एकाग्रता में २०,००० कोशिकाओं/सेमी2 RPMI1640 सेल संस्कृति मध्यम के 15 मिलीलीटर में 10% FBS (भ्रूण गोजातीय सीरम) और 1% में एक सह2 मशीन में ७५ सेमी2 कुप्पी में एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक और 5% सह2।
  2. प्रयोग के दिन, एक hemocytometer का उपयोग करके सेल एकाग्रता निर्धारित करते हैं । एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में 7 मिनट के लिए ४०० एक्स जी में केंद्रापसारक द्वारा ५०,००० कोशिकाओं को इकट्ठा करने और फिर से १०० µ एल में कोशिकाओं को निलंबित 1x बाँझ पंजाबियों (फास्फेट बफर खारा) में १.५ मिलीलीटर ट्यूबों.
  3. एक multipipette के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूबों में अर्द्ध ठोस methylcellulose-आधारित मध्यम (MCBM) के १.१ मिलीलीटर वितरण । प्रत्येक शर्त के लिए एक ट्यूब तैयार करें ।
  4. FBS के ११० µ l को जोड़ कर एक P200 micropipette का उपयोग कर के १.१ मिलीलीटर MCBM ।
  5. १,००० कोशिकाओं पर बीज कोशिकाओं/ शेयर समाधान से सेल निलंबन के २.४ µ एल लीजिए (1x पंजाब के १०० µ एल में ५०,००० कोशिकाओं) एक P2 micropipette का उपयोग कर और MCBM के १.१ मिलीलीटर 10% FBS के साथ पूरक के लिए जोड़ें ।
  6. कोशिकाओं को जोड़ने के बाद, भंवर 1 मिनट के लिए ट्यूबों, उंहें पकड़ में खड़ी उच्चतम गति से MCBM और कोशिकाओं को अच्छी तरह से मिश्रण ।
  7. परीक्षण यौगिकों जोड़ें (OT48 अकेले या A1210477 के साथ संयोजन में). इस्तेमाल विलायक के लिए एक नियंत्रण के रूप में एक अलग ट्यूब तैयार (यहां dimethyl sulfoxide (DMSO)) । यौगिकों और प्रत्येक स्थिति के लिए जोड़ा मात्रा की एकाग्रता पर निर्भर करता है, विलायक नियंत्रण विलायक के कारण प्रतिकूल प्रभाव के लिए मूल्यांकन करने के लिए, परीक्षण यौगिक की कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल विलायक के उच्चतम एकाग्रता शामिल होंगे ।
  8. 1 मिनट के लिए भंवर ट्यूबों ।
  9. प्रत्येक परख के लिए, एक 12 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के केंद्र के लिए एक P1000 micropipette के साथ मिश्रण के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  10. नमी को स्थिर करने के लिए बाँझ पानी या 1x पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ खाली कुओं भरें ।
  11. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर एक मशीन में 10 दिनों के लिए संस्कृति प्लेटें ।
  12. मशीन के 10 दिनों के बाद, एक MTT के २०० µ एल जोड़ें (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium ब्रोमाइड) स्टॉक समाधान (5 मिलीग्राम/एमएल) के लिए एक अच्छी तरह से एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए 1 मिलीग्राम/
  13. ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर एक मशीन में 10 मिनट की मशीन । व्यवहार्य कालोनियों वायलेट बंद हो जाएगा ।
  14. सफेद पृष्ठभूमि प्लेट (लास व्हाइट दीया ट्रे) का उपयोग कर एक डिजिटल कैमरा का उपयोग कर छवि पर कब्जा । निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: विधि, डिजिटलीकरण; एक्सपोज़र प्रकार, परिशुद्धता; जोखिम समय, मैनुअल, 1 सेकंड; संवेदनशीलता/संकल्प, उच्च संकल्प । tiff स्वरूप में छवि सहेजें ।
  15. ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग करके व्यवहार्य कालोनियों को बढ़ाता है । चुनें मेनू "छवि । प्रकार | 8 बिट "। मेनू चुनें "समायोजित करें । थ्रेशोल्ड "। नियंत्रण और सभी शर्तों के लिए निरंतर रखने के लिए थ्रेशोल्ड सेट करें; चुनें मेनू "विश्लेषण । विश्लेषण कणों "। डेटा सहेजें और चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए एक सांख्यिकी सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण ।

2. अंडाकार आकृति गठन की परख

  1. संस्कृति A549 कोशिकाओं की एकाग्रता में २०,००० कोशिकाओं/सेमी2 में ७५ सेमी2 RPMI १६४० मध्यम के 15 मिलीलीटर के साथ कुप्पी 10% FBS और 1% एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक ।
  2. प्रयोग के दिन, एक ९६ अच्छी तरह से यू नीचे थाली तैयार करते हैं ।
  3. प्लेट एक अच्छी तरह से जो पहले से ही ब्याज की यौगिक शामिल में १०,००० कोशिकाओं (यहां ५० OT48 के µ मीटर और/या A1210477 के 20 µ एम) । सेल संस्कृति माध्यम के १०० µ एल के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें । एक बरकरार बाहरी सीमा के साथ वर्दी spheroids प्रपत्र spheroids बनाने के लिए पर्याप्त माना जाता है कि कक्षों की संख्या ।
  4. ३७ डिग्री सेल्सियस पर और 5% सह2में एक मशीन में 3 दिनों के लिए मशीन ।
  5. मशीन के 3 दिनों के बाद, spheroids की छवियों पर कब्जा 4x आवर्धन के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ।

3. Zebrafish Xenograft परख

नोट: यह तकनीकी दृष्टिकोण एक योजनाबद्ध (चित्रा 1) के रूप में कल्पना की है ।

  1. स्टॉक रिएजेंट की तैयारी
    1. 30एक्स Danieau के समाधान के 1 एल तैयार: १७४० मिमी NaCl, 21 मिमी KCl, 12 मिमी MgSO4∙ 7H2हे, 18 मिमी सीए (कोई3)2, और १५० मिमी HEPES. ७.६ एक पीएच मीटर का उपयोग करने के लिए बफर के पीएच को समायोजित करें ।
    2. तैयार 1% (50x) tricaine समाधान: आसुत जल के 2 मिलीलीटर में एथिल 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaine) के 20 मिलीग्राम भंग ।
    3. 1% phenol लाल-पंजाबियों समाधान तैयार करें: एक १.५ µ एल ट्यूब में निष्फल पंजाबियों समाधान के १९८ µ एल के लिए phenol लाल सोडियम नमक समाधान के 2 µ एल जोड़ें ।
    4. 3% methylcellulose तैयार: 1x Danieau के समाधान के १०० मिलीलीटर के लिए methylcellulose के 3 जी जोड़ें ।
  2. Zebrafish अंडा उत्पादन और मशीन
    1. अंधेरे में २८.५ ° c पर यूवी निष्फल और फ़िल्टर किए गए नल के पानी से भरा एक विभाजन टैंक में एक महिला और एक पुरुष zebrafish को अलग करें । जुदाई के 24 ज के बाद, संभोग आरंभ करने के लिए दोनों लिंग के मिश्रण मछली । एक पेट्री डिश ताजा Danieau समाधान के 5 मिलीलीटर युक्त करने के लिए संभोग टैंक से निषेचित अंडे हस्तांतरण ।
    2. Danieau के समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ तीन बार अंडे धो लें । धोने के लिए, ध्यान से एक पिपेट और ताजा समाधान के 5 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण के साथ अंडे महाप्राण । २८.५ डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए मशीन ।
      1. Danieau के समाधान में मशीन के 8 घंटे के बाद, Danieau के समाधान के लिए बदलें ०.०३% 1 युक्त-फिनाइल-2-thiourea (PTU) रंजकता को बाधित करने के लिए । अपारदर्शी अंडे (निषेचित या युक्त अविकसित भ्रूण) के संक्रमण को रोकने के लिए क्रमबद्ध करें ।
  3. भ्रूण dechorionation
    1. 24 एच पोस्ट निषेचन (hpf), dechorionate zebrafish तीव्र संदंश का उपयोग भ्रूण । Danieau समाधान में ०.०३% PTU के साथ २८.५ ° c जब तक ४८ hpf में सेने भ्रूण मशीन ।
  4. कंपाउंड-इलाज सेल की तैयारी
    1. बीज A549 कोशिकाओं पर २०,००० कोशिकाओं/सेमी2 में 25 सेमी2 संस्कृति कुप्पी । बोने की 24 घंटे के बाद, यौगिकों जोड़ें (यहां ५० µ m पर OT48 और/या 20 µ एम पर A1210477) एक मशीन में 24 घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर । कोशिकाओं की व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए लेकिन कोशिका मृत्यु की ओर उन्हें प्रतिबद्ध करने के लिए प्रत्येक यौगिक के लिए उपचार समय निर्धारित करें । इस समय बिंदु व्यक्तिगत रूप से सेल व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान और आणविक मार्करों के आधार पर स्थापित किया जाना चाहिए ।
    2. उपचार के अंत से पहले 2 एच, ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% सह2पर फ्लोरोसेंट सेल ट्रैकर डाई सेमी-दिल की 4 µ एम के साथ कोशिकाओं दाग । मशीन के 2 ज के बाद, ०.०५% trypsin-EDTA के साथ trypsinize कोशिकाओं, और phenol लाल-पंजाबियों समाधान इंजेक्शन से पहले के ५० µ एल में 106 कोशिकाओं को पतला ।
  5. xenograft गठन के लिए कैंसर कोशिकाओं के सूक्ष्म इंजेक्शन
    1. Anesthetize 5 मिनट के लिए एक ०.०२% tricaine समाधान में zebrafish जब तक वे एक आगर प्लेट पर नीचे बसा ।
    2. एक micropipette खींचने (कार्यक्रम सेटिंग्स: P: ३००, गर्मी: २६०, पुल: ६०, VEL: ५०, और समय: २००) द्वारा एक १.० मिमी (बाहर व्यास (आयुध डिपो) ग्लास केशिका) खींचो । एक सिरिंज के साथ microcapillary कटौती एक तेज धार का उत्पादन करने के लिए । सेल के 20 µ l के साथ लोड microcapillaries/phenol रेड-पंजाबन समाधान । इंजेक्शन दबाव और समय इंजेक्शन प्रति 2 nL वितरण करने के लिए सेट करें ।
    3. 3 से 5 इंजेक्शन के माध्यम से 6 से 10 nL इंजेक्शन द्वारा जर्दी थैली में 100 – 200 कोशिकाओं इंजेक्षन । इंजेक्शन के बाद, मछली ताजा Danieau PTU समाधान युक्त समाधान के 5 मिलीलीटर में 10 से 30 मिनट के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं । 24 में डिस्पैच मछली Danieau PTU समाधान युक्त समाधान की 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से प्लेटें है और २८.५ डिग्री सेल्सियस पर ७२ ज के लिए गर्मी ।
    4. मशीन के ७२ एच के बाद, एक ०.०२% tricaine समाधान में anesthetize मछली और 3% methylcellulose की एक बूंद के साथ एक गिलास स्लाइड पर स्थिर । ६२० से ७५० एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा 5x तस्वीरें ले लो ।
    5. ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा फ्लोरोसेंट ट्यूमर के आकार को बढ़ाता है । चुनें मेनू "विश्लेषण । उपाय ". फ्लोरोसेंट संकेत करने के लिए इसी मूल्यों को बचाने और चित्रमय प्रतिनिधित्व के लिए एक आंकड़े सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण ।

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Representative Results

चित्रा 2में, फेफड़े के कैंसर के सेल लाइन A549 MCBM में OT48 अकेले या संकेत सांद्रता पर BH3 mimetic A1210477 के साथ संयोजन के साथ उपचार के बाद कालोनियों फार्म का बीज था । परिणाम से पता चला है कि संयोजन काफी संख्या, आकार और कालोनियों की कुल सतह क्षेत्र के 10 दिनों के बाद गर्मी कम ।

चित्रा 3में, A549 कोशिकाओं अकेले OT48 के साथ या BH3 mimetic A1210477 के साथ संयोजन में इलाज किया गया और यू के नीचे प्लेट तकनीक द्वारा spheroids फार्म की अनुमति दी गई । मशीन के 3 दिनों के बाद, spheroids के चित्र ले जाया गया । spheroids के ठहराव छवि जंमू और 3 डी छवियों का उपयोग किया गया था उत्पंन ।

चित्रा 4में, A459 कोशिकाओं अकेले OT48 या BH3 mimetic A1210477 के साथ संयोजन में 24 घंटे के लिए और zebrafish जर्दी थैली में इंजेक्शन के साथ इलाज किया गया । ७२ एच के बाद, फ्लोरोसेंट ट्यूमर के ठहराव यौगिक की निरोधात्मक क्षमता को संबद्ध ।

Figure 1
चित्रा 1: zebrafish xenograft परख की समग्र प्रक्रिया के योजनाबद्ध आरेख । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: hydroxycoumarin OT48 और BH-3 mimetic A1210477 द्वारा A549 कॉलोनी गठन के Synergistic निषेध । (क) एक A549 कॉलोनी के गठन की छवियों के साथ इलाज परख ५० OT48 के µ मी और/या A1210477 के 20 µ एम । (बी-डी) ठहराव की संख्या, औसत आकार, और कालोनियों की कुल सतह क्षेत्र । प्रयोगों तपसिल में महसूस किया गया. पोस्ट हॉक विश्लेषण किया गया । सांख्यिकीय महत्व p-०.०५ नीचे मानों पर मूल्यांकन किया गया और निम्न लेजेंड द्वारा प्रतिनिधित्व: * p ≤ ०.०५, * * p ≤ ०.०१, * * * p ≤ ०.००१, * * * * p ≤ ०.०००१; पद हॉक िरा Dunnett; Sidak) । सभी हिस्टोग्राम सबसे कम तीन स्वतंत्र प्रयोगों के अर्थ ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: OT48 के प्रभाव और/या A1210477 A549 कोशिकाओं की क्षमता पर फार्म spheroids के लिए । 3 दिनों के बाद A549 ट्यूमर spheroids की छवियाँ.

Figure 4
चित्रा 4: एक यौगिक द्वारा A549 ट्यूमर बड़े पैमाने पर गठन के निषेध. (क) चित्र CM-Dil-सना A549 कोशिकाओं की ट्यूमर बनाने की क्षमता पर OT48 और/या A1210477 का निरोधात्मक प्रभाव दिखा रहे हैं. (ख) ट्यूमर के गठन का ठहराव. पोस्ट हॉक विश्लेषण किया गया । सांख्यिकीय महत्व p-०.०५ नीचे मानों पर मूल्यांकन किया गया और निम्न लेजेंड द्वारा प्रतिनिधित्व: * p ≤ ०.०५, * * p ≤ ०.०१, * * * p ≤ ०.००१, * * * * p ≤ ०.०००१; पद हॉक िरा Dunnett; Sidak) । सभी हिस्टोग्राम कम से दस स्वतंत्र प्रयोगों के अर्थ ± एसडी का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

MCBM के साथ प्राप्त कॉलोनी गठन की दरें कोशिका प्रकार पर निर्भर करती हैं. आमतौर पर, गैर अनुयाई कोशिकाओं के लिए, अनुयाई कोशिकाओं की तुलना में कालोनियों की संख्या बहुत अधिक है । हमने देखा है कि A549 कोशिकाओं को 10 दिनों के बाद 30 ४० कालोनियों का गठन किया । पहले हम विभिंन ल्यूकेमिया कोशिकाओं है कि कालोनियों की संख्या २०० से २५०9के बीच है के लिए सूचना दी है । हमारे परिणामों से पता चला कि अकेले OT48 कालोनियों की संख्या की एक महत्वपूर्ण कमी का उत्पादन नहीं किया अकेले । हालांकि, A549 कोशिकाओं की A1210477 कॉलोनी बनाने की क्षमता mimetic BH3 के साथ संयोजन में कम synergistically था । पहले हम ने बताया कि एक और hydroxycoumarin व्युत्पंन OT52 भी BH3 mimetics के साथ तालमेल के लिए A549 कोशिकाओं की कॉलोनी बनाने की क्षमता को बाधित । सुझाए गए सीडिंग एकाग्रता से भिन्न हो सकते हैं 1 x 103 करने के लिए १.५ x 103. MethoCult का उपयोग कर एक मूल्यवान तकनीक नियमित रूप से विभिंन कैंसर सेल लाइनों में tumorigenesis मापने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन यह कुछ सीमाएं हैं । अक्सर प्रयोग के बाद व्यवहार्य कालोनियों की वसूली असुविधाजनक है, और कोशिकाओं को अच्छी तरह से विकसित नहीं एक बार MCBM से अलग और RPMI1640 माध्यम में वरीयता प्राप्त है । फिर भी, यह एक अच्छी तरह से स्वीकार किए जाते है पूर्व नैदानिक तकनीक को बेहतर एक 3 डी वातावरण में कैंसर की प्रगति के तंत्र को समझते हैं । 3 डी विकास की स्थिति सही में एक vivo सेटिंग में ट्यूमर के गठन के प्राकृतिक वातावरण का प्रतिनिधित्व करते हैं । हालांकि, इस विधि धीमी, श्रम गहन और उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग10के लिए उपयुक्त नहीं है ।

SFAs अनुयाई कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया है और कैंसर की दवा खोज में व्यापक लोकप्रियता प्राप्त के रूप में वे इस तरह की वृद्धि हुई सेल अस्तित्व के रूप में शारीरिक लक्षण प्रदर्शन, ट्यूमर आकृति विज्ञान और एक hypoxic कोर जो vivo स्थिति में एक के अधिक प्रतिनिधि हैं 11,12. कुल आकार, बनावट, और spheroids के U-नीचे प्लेट तकनीक द्वारा प्राप्त की अखंडता सेल लाइनों के बीच भिंन हो सकते हैं । इसके अलावा, spheroids फार्म के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की शुरुआत एकाग्रता भी अपने समग्र विकास को प्रभावित कर सकते हैं । हमारे परिणामों से पता चला कि BH3 mimeticA1210477 के साथ संयोजन में OT48 अंडाकार आकृति अखंडता बाधित और अंडाकार आकृति कोशिकाओं की क्षमता कम A549 बनाने । पहले हम एक और hydroxycoumarin BH3 mimetics9के साथ संयोजन में व्युत्पंन द्वारा A549 spheroids के निषेध की सूचना दी । इस तकनीक के प्रमुख लाभ reproducibility और लागत प्रभावशीलता हैं । अंय तकनीकों जैसे तरल ओवरले तकनीक भी नियमित रूप से कैंसर कोशिकाओं के 3 डी spheroids विकसित करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस तकनीक कोशिकाओं में एक गैर अनुयाई सेल संस्कृति पकवान पर बढ़ता है । सेल के झुरमुट तो एकत्र और निलंबन संस्कृति में रखा spheroids फार्म कर रहे हैं । हालांकि, इस तकनीक के साथ जुड़े प्रमुख सीमाओं में से एक निलंबन संस्कृति है, जो अच्छी तरह से विभिंन सेल लाइनों द्वारा सहन नहीं है कोशिका के झुरमुट के हस्तांतरण है । यौगिक स्क्रीनिंग ऐसे 3 डी संस्कृति प्रणाली का प्रवाह बढ़ाने के लिए, कुछ कंपनियों के विशिष्ट सब्सट्रेट, कम लगाव परख प्लेटें विकसित कर रहे हैं, और 3 डी संरचनाओं13के गठन में सुधार मचान । आगे तकनीकी प्रगति के साथ, एक और अधिक प्रतिनिधि 3 डी ट्यूमर मॉडल के विकास के कैंसर का एक दिया प्रकार के लिए उपंयास यौगिकों के औषध विज्ञान की एक बेहतर समझ की अनुमति देगा ।

Zebrafish xenografts सबसे अधिक लागत प्रभावी पशु नियमित रूप से विरोधी दवा विकास9,14के लिए इस्तेमाल किया परख के रूप में माना जाता है । हम विभिंन ठोस और रक्त कैंसर के प्रकार के साथ ही रोगी व्युत्पंन कोशिकाओं के साथ vivo प्रणाली में zebrafish अनुकूलित । वहां दवा स्क्रीनिंग के लिए zebrafish का उपयोग कर के लाभ के एक नंबर रहे हैं । सिद्धांत रूप में, दवाओं के पानी में सीधे जोड़ा जा सकता है और इंजेक्शन की जरूरत नहीं है । इसके अलावा, इस दृष्टिकोण भी एक दवा उंमीदवार के ADME (अवशोषण, वितरण, चयापचय और उत्सर्जन) संपत्तियों के बारे में जानकारी प्रदान करता है । हालांकि, इस तकनीक की प्रमुख सीमाओं में से एक है कुछ अणुओं पानी में घुलनशील नहीं है और इसलिए तुरंत इस विधि द्वारा जांच की जानी उपयुक्त नहीं हैं । इस सीमा को दूर करने के लिए, कैंसर की कोशिकाओं यौगिकों पूर्व vivo के साथ इलाज किया गया zebrafish में एक मंच है जहां कोशिकाओं प्रतिबद्ध हैं, फिर भी व्यवहार्यता बनाए रखने में इंजेक्शन हो । हमारे परिणामों से पता चला है कि A549 कोशिकाओं OT-४८ या BH3 mimetic A1210477 अकेले के साथ इलाज दृढ़ता से A549 और OT48 का एक संयोजन की तुलना में A1210477 कोशिकाओं के ट्यूमर बनाने की क्षमता को कम नहीं किया । इस अवलोकन के आगे इन विट्रो में हमारी पुष्टि की जहां संयोजन व्यक्तिगत उपचार की तुलना में महत्वपूर्ण विरोधी कैंसर प्रभाव दिखाया । कुल मिलाकर, इस तकनीक दवाओं के एक नैदानिक सेटिंग में तेजी से जांच करने के लिए योगदान कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

SNU में अनुसंधान ट्यूमर Microenvironment ग्लोबल कोर रिसर्च सेंटर (GCRC) अनुदान के लिए कोरिया के MEST द्वारा नेशनल रिसर्च फाउंडेशन (एनआरएफ) द्वारा समर्थित है, [अनुदान संख्या 2011-0030001]; सियोल नेशनल यूनिवर्सिटी रिसर्च ग्रांट और ब्रेन कोरिया (BK21) प्लस प्रोग्राम द्वारा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials required for colony formation assays
A549 ATCC CCL-185 37 C°
RPMI 1640 Lonza 30096 4 C°
FBS Biowest S1520-500 -20 C°
Penicillin-Streptomycin Lonza 17-602E -20 C°
Cell culture flask T75 SPL 70075 RT
PBS solution Hyclone SH30256.02 RT
1.5ml tube Extragene Tube-170-C RT
15 ml tube Hyundai Micro H20015 RT
12 well plate SPL 30012 RT
MethoCult StemCell technologies 4230 -20 C°
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) Sigma M5622 4 C°
LAS4000 GE Healthcare Technologies RT
Materials required for spheroid formation assay
A549 ATCC CCL-185 37 C°
RPMI 1640 Lonza 30096 4 C°
FBS Biowest S1520-500 -20 C°
Penicillin-streptomycin Lonza 17-602E -20 C°
Cell culture flask T75 SPL 70075 RT
PBS solution Hyclone SH30256.02 RT
Trypsin-EDTA Gibco 25-300-054 4 C°
Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate Corning 3474 RT
Microscopy Nikon Eclipse TS100 RT
Materials required for zebrafish xenografts
A549 ATCC CCL-185 37 C°
RPMI 1640 Lonza 30096 4 C°
FBS Biowest S1520-500 -20 C°
Penicillin-streptomycin Lonza 17-602E -20 C°
Cell culture flask T25 SPL 70025 RT
Cell culture flask T75 SPL 70075 RT
Cell culture flask T175 SPL 71175 RT
1.5ml tube Extragene Tube-170-C RT
24 well plate SPL 30024 RT
Petridish SPL 10100 RT
PBS solution Hyclone SH30256.02 RT
Trypsin-EDTA Gibco 25-300-054 4 C°
Sodium Chloride Sigma-Aldrich 71382 RT
Potassium chloride (KCL) Sigma-Aldrich P9541 RT
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) Sigma-Aldrich M2773 RT
Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) Sigma-Aldrich C1396 RT
HEPES solution Sigma-Aldrich H0887 RT
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) Sigma-Aldrich E10521 RT
Phenol Red solution Sigma-Aldrich P0290 RT
Methylcellulose Sigma-Aldrich M0512 RT
1-phenyl-2-thiourea (PTU) Sigma-Aldrich P7629 RT
CM-Dil dye Invitrogen C7001 -20 C°
Glass capillary World Precision Instruments TW 100F-4 RT
Micropipette puller Shutter instrument, USA P-97 RT
Micro injector World Precision Instruments PV820 RT
Syringe KOVAX 1ml RT
Micro loader Eppendorf 5242956003 RT
Glass slide Marienfeld HSU-1000612 RT
Fluorescence microscopy Leica DE/DM 5000B RT

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक १३६ Zebrafish ट्यूमर xenograft 3 डी संस्कृति प्रणाली spheroids कॉलोनी गठन सेल ट्रैकर-सना हुआ कैंसर सेल इंजेक्शन
Spheroids, कॉलोनी के गठन की परख, और Zebrafish Xenografts द्वारा विरोधी अनंतमूलि OT48 की सी गतिविधि के नैदानिक मूल्यांकन
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Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, … More

Lee, J. Y., Mazumder, A., Diederich, M. Preclinical Assessment of the Bioactivity of the Anticancer Coumarin OT48 by Spheroids, Colony Formation Assays, and Zebrafish Xenografts. J. Vis. Exp. (136), e57490, doi:10.3791/57490 (2018).

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