Summary
Qui, presentiamo lo screening preclinico di cumarine anticancro utilizzando zebrafish e cultura 3D.
Abstract
Lo screening pre-clinico in vitro e in vivo di nuovi agenti terapeutici sono uno strumento essenziale nella scoperta della droga di cancro. Anche se linee cellulari tumorali umane rispondono ai composti terapeutici nelle colture delle cellule dello strato monomolecolare (dimensionali) 2D, 3D cultura sistemi sono stati sviluppati per comprendere l'efficacia delle droghe nei modelli più fisiologicamente rilevanti. Negli ultimi anni, un cambiamento di paradigma è stata osservata in ricerca pre-clinica per convalidare la potenza di nuove molecole in sistemi di coltura 3D, più precisamente che imita il microambiente tumorale. Questi sistemi caratterizzano lo stato di malattia in un modo più fisiologicamente rilevante e aiutano ad per acquisire meglio meccanicistico conoscenza e la comprensione della potenza farmacologica di una data molecola. Inoltre, con l'attuale tendenza al miglioramento in vivo modelli del cancro, zebrafish è emerso come un importante modello di vertebrati di valutare in vivo la formazione del tumore e di studiare l'effetto degli agenti terapeutici. Qui, abbiamo studiato l'efficacia terapeutica di hydroxycoumarin OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetics nella linea cellulare di cancro del polmone delle cellule A549 utilizzando tre sistemi differenti della coltura 3D tra cui saggi di formazione di Colonia (CFA), analisi di formazione della sferoide (SFA) e in vivo gli xenotrapianti zebrafish.
Introduction
Il cancro è causato da mutazioni cellulari e di conseguenza pathway biochimici sono interrotti innescando la divisione cellulare incontrollata e resistenza alla morte cellulare. I tumori interferiscano con funzioni fisiologiche dell'apparato digerente, nervoso, circolatorio e successivamente vicini tessuti1. Nonostante gli sforzi di ricerche approfondite, il cancro rimane la malattia pericolosa più diffusa nel mondo2. Medicina di precisione è stato riconosciuto come il fondamento della terapeutica del cancro futuro. Nuove entità molecolari sono testate regolarmente in combinazione con farmaci già esistenti per migliorare il risultato clinico.
Tuttavia, uno dei limiti significativi connessi con lo sviluppo di nuove terapie mirate efficiente è il fallimento di analisi comunemente usati per simulare il risultato biologico esatto della droga dell'esposizione3. Scoperta della droga di cancro ancora in gran parte si basa su test l'efficacia degli agenti terapeutici in linee cellulari tumorali coltivate in colture monostrato 2D, che sono difficili da convalidare in studi clinici4. Di conseguenza, c'è un crescente interesse a sviluppare modelli migliori di cancro che meglio simulano le funzionalità native di tumori in vivo5. Negli ultimi anni, un crescente interesse nei modelli 3D cultura ha provocato lo sviluppo di metodologie di miglioramento per produrre tumore 3D modelli5.
Qui, presentiamo un approccio con tre tecniche di coltura differenti delle cellule 3D che permette di migliorare la comprensione della potenza di hydroxycoumarin OT486 in combinazione con BH3 mimetics prima più in profondità in vivo saggi. Il nostro metodo consiste di combinazione di Colonia e SFAs con un in vivo del tumore formazione test basato su un modello di zebrafish ulteriormente convalidare l'efficacia della combinazione di OT48 e BH3 mimetici in cellule di cancro del polmone e monitorare la progressione del cancro in una vita organismo.
Saggi di formazione di Colonia sono abitualmente utilizzati per valutare l'efficacia di farmaci antitumorali per i tumori sia solidi, nonché ematopoietici. Il test determina la capacità di una cellula a proliferare indefinitamente e formano colonie7. L'effetto di un agente anticancro sulla capacità delle cellule di formazione di colonie è determinata dalla diminuzione del numero e/o dimensioni delle colonie.
Sferoidi rappresentano modelli di tumore in vitro e servono come una piattaforma di screening a basso costo per agenti anticancro. Sferoidi sono aggregati di cellule che crescono in sospensione o incorporati in una matrice 3D. Questo approccio è ampiamente usato per lo screening di stupefacenti e gli studi di tumore crescita, proliferazione e immunitario interazione8.
Per comprendere appieno le proprietà di un nuovo farmaco, è essenziale per condurre esperimenti in vivo su roditori. Tuttavia, questo metodo convenzionale è costoso e richiede tempo. Negli ultimi anni, zebrafish (Danio rerio) è diventato un organismo laboratorio ampiamente studiati che è più economico e più veloce per aumentare. Tumori si sono sviluppati nell'approccio di coltura cellulare di zebrafish rappresentano un 3D, ma all'interno della regolazione in vivo di un vertebrato9.
Complessivamente, usiamo qui tre approcci diversi cultura 3D tra cui CFAs, SFAs e formazione di zebrafish in vivo del tumore per dimostrare la capacità anticancro di hydroxycoumarin OT48 in un modello cellulare di cancro delle cellule A549 polmone in combinazione con BH3 mimetici.
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Protocol
1. colony formazione Assays
- Cellulari cellule A549 cultura ad una concentrazione di 20.000 cellule/cm2 a 15 mL di RPMI1640 cultura supplementato con 10% FBS (siero fetale bovino) e 1% antibiotici in un pallone da2 cm 75 in incubatore a CO2 a 37 ° C e 5% CO2.
- Il giorno dell'esperimento, determinare la concentrazione di cellule utilizzando un emocitometro. Raccogliere 50.000 cellule mediante centrifugazione a 400 x g per 7 min in una microcentrifuga da 1,5 mL e risospendere le cellule in 100 µ l di 1 x sterile PBS (Phosphate Buffered Saline) in provette da 1,5 mL.
- Dispensare 1,1 mL di mezzo di metilcellulosa-base semi-solido (MCBM) in provette da 15 mL con un multipipette. Preparare una provetta per ogni condizione.
- Aggiungere 110 µ l di FBS a 1,1 mL di MCBM utilizzando una micropipetta P200.
- Cellule di semi a 1.000 cellule/mL. Raccogliere 2,4 µ l di sospensione cellulare dalla soluzione stock (50.000 cellule in 100 µ l di PBS 1X) utilizzando una micropipetta P2 e aggiungere a 1,1 mL di MCBM supplementato con 10% FBS.
- Dopo aver aggiunto le cellule, vortex le provette per 1 min, tenendoli verticalmente alla massima velocità per mescolare bene MCBM e cellule.
- Aggiungere sostanze da testare (OT48 da solo o in combinazione con A1210477). Preparare un tubo separato come un controllo per il solvente usato (qui il solfossido dimetilico (DMSO)). A seconda della concentrazione dei composti e il volume aggiunto per ogni condizione, il controllo solvente includerà la più alta concentrazione di solvente utilizzato per le diluizioni del composto, test per valutare gli effetti negativi causati da parte del solvente.
- Tubi di vortice per 1 minuto.
- Per ogni dosaggio, aggiungere 1 mL della miscela con una micropipetta P1000 al centro anche di una piastra di coltura delle cellule 12-pozzetti.
- Riempire i pozzetti vuoti con 1 mL di acqua sterile o 1X PBS per stabilizzare l'umidità.
- Incubare le piastre di coltura per 10 giorni in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
- Dopo 10 giorni di incubazione, aggiungere 200 µ l di una soluzione di riserva (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromuro) MTT (5 mg/mL) ad ogni pozzetto per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/mL.
- Incubare per 10 minuti in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Colonie vitali diventerà viola.
- Acquisire l'immagine utilizzando una fotocamera digitale mediante la piastra di fondo bianco (vassoio di bianco dia LAS). Utilizzare le seguenti impostazioni: metodo, digitalizzare; Tipo di esposizione, precisione; Tempo di esposizione, manuale, 1 secondo; Sensibilità/risoluzione, alta risoluzione. Salvare l'immagine in formato tiff.
- Quantificare le colonie vitali utilizzando software ImageJ. Selezionare il menu "immagine | Tipo | 8 bit". Selezionare il menu "regolare | Soglia". Imposta la soglia per controllare e mantenere costante per tutte le condizioni; Selezionare il menu "Analyze | Analizzare le particelle". Salvare i dati e analizzare con un software di statistiche per la rappresentazione grafica.
2. analisi di formazione sferoide
- Cellule A549 di coltura ad una concentrazione di 20.000 cellule/cm2 in boccette2 75cm con 15 mL di RPMI 1640 supplementato con 10% FBS e 1% antibiotici.
- Il giorno dell'esperimento, preparare un 96 ben piastra di fondo U.
- Piastra di 10.000 cellule in un pozzo che contiene già il composto di interesse (qui 50 µM di OT48) e/o 20 µM di A1210477. Regolare il volume finale di 100 µ l di terreno di coltura cellulare. Il numero di cellule che formano sferoidi uniforme con un contorno esterno intatto è ritenuto sufficiente per sferoidi di forma.
- Incubare per 3 giorni in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2.
- Dopo 3 giorni di incubazione, acquisire immagini di sferoidi utilizzando un microscopio con ingrandimento 4x.
3. Zebrafish Xenograft Assay
Nota: Questo approccio tecnico è visualizzato come uno schema (Figura 1).
-
Preparazione dei reagenti stock
- Preparare 1 L di soluzione di Danieau: 30x: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12mm MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2e 150 mM HEPES. Regolare il pH del buffer a 7.6 utilizzando un pH-metro.
- Preparare la soluzione di tricaina 1% (50x): sciogliere 20 mg di etile 3-aminobenzoate methanesulfonate (tricaina) in 2 mL di acqua distillata.
- Preparare la soluzione di 1% di rosso fenolo-PBS: aggiungere 2 µ l di soluzione di sale di sodio fenolo rosso a 198 µ l di soluzione di PBS sterilizzati in un tubo di 1,5 µ l.
- Preparare 3% metilcellulosa: aggiungere 3 g di metilcellulosa a 100 mL di soluzione di Danieau 1x.
-
Incubazione e la produzione di uova di pesce zebra
- Separare uno femminile e uno maschile zebrafish in un serbatoio di partizione riempito con acqua di rubinetto filtrata e sterilizzata UV a 28,5 ° C al buio. Dopo 24 h di separazione, mescolare pesce di entrambi i sessi per iniziare l'accoppiamento. Trasferire uova fecondate dal serbatoio dell'accoppiamento di una piastra Petri contenente 5 mL di soluzione di Danieau fresco.
- Lavare le uova tre volte con 5 mL di soluzione di Danieau. Per il lavaggio, aspirare accuratamente le uova con una pipetta e trasferimento a 5 mL di soluzione fresca. Incubare per 8 h a 28,5 ° C.
- Dopo 8 h di incubazione in soluzione di Danieau, cambiare per la soluzione di Danieau contenente 0.03% 1-fenil-2-tiourea (PTU) per inibire la pigmentazione. Ordinare uova opache (non fecondate o contenenti embrioni non sviluppati) per prevenire la contaminazione.
-
Embrione dechorionation
- 24h post fertilizzazione (hpf), embrioni di zebrafish dechorionate usando pinze taglienti. Incubare gli embrioni di schiusa in soluzione di Danieau con 0,03% PTU a 28,5 ° C fino a 48 hpf.
-
Preparazione delle cellule trattate composto
- Cellule A549 seme a 20.000 cellule/cm2 in matracci di cultura di 25 cm2 . Dopo 24 h di semina, aggiungere composti (qui OT48 a 50 µM ed e/o A1210477 a 20 µM) per 24 h in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Impostare il tempo di trattamento per ogni composto per mantenere la vitalità delle cellule ma di commetterle verso la morte delle cellule. Stavolta punto deve essere impostato individualmente sulla base attuabilità delle cellule, morfologia e marcatori molecolari.
- 2 h prima della fine del trattamento, cellule di macchia con 4 µM di tracker cellulare fluorescente tingono CM-Dil a 37 ° C e 5% CO2. Dopo 2 h di incubazione, tripsinizzano cellule con tripsina-EDTA 0,05% e diluire 106 cellule in 50 µ l di soluzione di rosso fenolo-PBS prima dell'iniezione.
-
Micro-iniezione delle cellule tumorali per la formazione dello xenotrapianto
- Anestetizzare zebrafish in una soluzione di tricaina 0,02% per 5 minuti fino a quando essi stabilirsi su una piastra di agar.
- Tirare un 1.0 mm (all'esterno di vetro di diametro (OD) capillare) di un estrattore micropipetta (le impostazioni del programma: p: 300, calore: 260, tirare: 60, VEL: 50 e tempo: 200). Tagliare il microcapillary con una siringa per produrre un bordo tagliente. Caricare microcapillari con 20 µ l di cella/fenolo rosso-soluzione PBS. Impostare la pressione di iniezione e ora per erogare 2 nL per iniezione.
- Iniettare 100 – 200 cellule il sacco vitellino di iniezione da 6 a 10 nL tramite iniezioni di 3 a 5. Dopo l'iniezione, consentire pesce recuperare per 10 a 30 min in 5 mL di soluzione di Danieau fresco contenente soluzione di PTU. Spedizione pesce in piastre da 24 pozzetti con 1 mL di soluzione di Danieau contenente soluzione di PTU sono e incubare per 72 h a 28,5 ° C.
- Dopo 72 h di incubazione, anestetizzare il pesce in una soluzione di tricaina 0.02% e immobilizzare su un vetrino con un calo del 3% metilcellulosa. 5 x fotografare da microscopia di fluorescenza alla lunghezza d'onda di 620 a 750 nm.
- Quantificare la dimensione dei tumori fluorescente da software ImageJ. Selezionare il menu "Analyze | Misura". Salvare i valori corrispondenti per il segnale fluorescente e analizzare con un software di statistiche per la rappresentazione grafica.
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Representative Results
Nella Figura 2, il cancro del polmone delle cellule linea A549 è stato seminato in MCBM di formare le colonie dopo il trattamento con OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetico A1210477 alle concentrazioni indicate. I risultati hanno mostrato che la combinazione significativamente ridotto numero, dimensione e superficie totale delle colonie dopo 10 giorni di incubazione.
Nella Figura 3, cellule A549 sono state trattate con OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetico A1210477 e sono stati permessi sferoidi forma mediante la tecnica di piastra di fondo U. Dopo 3 giorni di incubazione, sono state scattate immagini di sferoidi. Quantificazione degli sferoidi è stato fatto utilizzando Image J e 3D le immagini sono state generate.
Nella Figura 4, A459 cellule sono state trattate con OT48 da solo o in combinazione con BH3 mimetico A1210477 per 24 h e iniettate in vitellino zebrafish. Dopo 72 h, quantificazione dei tumori fluorescenti è correlata al potenziale inibitorio del composto.
Figura 1: rappresentazione schematica del processo complessivo del dosaggio dello xenotrapianto zebrafish. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: inibizione sinergica di A549 formazione della Colonia da hydroxycoumarin OT48 e BH-3 mimetico A1210477. (A) le immagini di un'analisi di formazione della Colonia A549 trattati con 50 µM di OT48 e/o 20 µM di A1210477. (B-D) Quantificazione del numero, dimensione media e la superficie totale delle colonie. Gli esperimenti sono stati realizzati in triplice copia. Sono state eseguite analisi post hoc . Statistiche significati sono stati valutati a valori di p inferiore a 0.05 e rappresentate dalla seguente leggenda: * p ≤ 0.05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤0.001, * * * p ≤ 0.0001; post hoc, analizza Dunnett; Sidak). Tutti gli istogrammi rappresentano la media ± SD di almeno tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: effetto di OT48 e/o A1210477 sulla capacità delle cellule A549 cellule di sferoidi forma. Immagini di sferoidi tumore A549 dopo 3 giorni.
Figura 4: l'inibizione di formazione di massa del tumore delle cellule A549 di un composto. (A) immagini mostrano l'effetto inibitorio di OT48 e/o A1210477 sul tumore formando la capacità delle cellule A549 CM-Dil-macchiate. (B) quantificazione di formazione del tumore. Sono state eseguite analisi post hoc . Statistiche significati sono stati valutati a valori di p inferiore a 0.05 e rappresentate dalla seguente leggenda: * p ≤ 0.05, * * p ≤ 0,01, * * * p ≤0.001, * * * p ≤ 0.0001; post hoc, analizza Dunnett; Sidak). Tutti gli istogrammi rappresentano la media ± SD di almeno dieci esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I tassi di formazione della Colonia ottenuti con MCBM dipende dal tipo delle cellule. Di solito, per cellule non aderenti, il numero di colonie è molto superiore rispetto a cellule aderenti. Abbiamo osservato che le cellule A549 formano colonie di 30 a 40 dopo 10 giorni. Precedentemente abbiamo segnalato per le cellule di leucemia differenti che il numero di colonie è compreso tra 200-2509. I nostri risultati hanno mostrato che OT48 da solo non ha prodotto una diminuzione significativa del numero di colonie da solo. Tuttavia, in combinazione con BH3 mimetico A1210477 capacità di formatura di Colonia di cellule A549 sinergico è stato ridotto. Precedentemente abbiamo segnalato che un altro derivato hydroxycoumarin OT52 anche sinergizzato con BH3 mimetics di inibire la capacità di formatura di Colonia di cellule A549. La concentrazione di semina consigliata può variare da 1 x 103 a 1,5 x 103. CFA utilizzando MethoCult è una tecnica importante abitualmente utilizzata per la misurazione di tumorigenesi in varie linee cellulari di cancro, ma ha alcune limitazioni. Spesso il recupero delle colonie vitali dopo l'esperimento è scomodo, e le cellule non si sviluppano bene una volta isolato da MCBM e seminato nel terreno di RPMI1640. Tuttavia, è una tecnica ben accettata pre-clinica per capire meglio il meccanismo della progressione del cancro in un ambiente 3D. Le condizioni di sviluppo 3D rappresentano accuratamente l'ambiente naturale di formazione del tumore in una regolazione in vivo . Tuttavia, questo metodo è lento, lavoro intensivo e non adatto per high throughput screening10.
SFAs vengono eseguiti con le cellule aderenti ed acquisito vasta popolarità nella scoperta della droga di cancro come essi presentano tratti fisiologici come cellula aumentata sopravvivenza, morfologia del tumore e un nucleo hypoxic che sono più rappresentativi di una situazione in vivo 11,12. La dimensione complessiva, texture e integrità di sferoidi ottenuto con la tecnica del piatto fondo U possono variare tra linee cellulari. Inoltre, la concentrazione iniziale di celle utilizzate per sferoidi modulo può anche influenzare il suo sviluppo globale. I nostri risultati hanno mostrato che OT48 in combinazione con BH3 mimeticA1210477 ha inibito l'integrità della sferoide e ridotto sferoide formando la capacità delle cellule A549. Precedentemente abbiamo segnalato l'inibizione di sferoidi A549 con un altro hydroxycoumarin derivato in combinazione con BH3 mimetics9. I principali vantaggi di questa tecnica sono la riproducibilità ed economicità. Altre tecniche come la tecnica di sovrapposizione di liquido sono anche abitualmente utilizzati per sviluppare 3D sferoidi delle cellule tumorali. In questa tecnica le cellule crescono su una piastra di coltura delle cellule non-aderenti. I grumi di cellule sono quindi raccolti e messi nella coltura di sospensione di sferoidi di forma. Tuttavia, uno dei principali limiti connessi con questa tecnica è il trasferimento di grumi di cellule per la coltura di sospensione, che non è ben tollerato da varie linee cellulari. Per aumentare la velocità effettiva di un tale sistema di cultura 3D di screening composto, alcune aziende stanno sviluppando specifici substrati, piastre di attacco basso dosaggio e impalcature migliorando la formazione di strutture 3D13. Con ulteriori progressi tecnici, sviluppo di un modello 3D del tumore più rappresentativo consentirà una migliore comprensione della farmacologia di nuovi composti per un determinato tipo di cancro.
Zebrafish xenotrapianti sono considerati come i saggi di animale più convenienti usati ordinariamente per farmaco anticancro sviluppo9,14. Abbiamo ottimizzato il sistema in vivo di zebrafish con vari tipi di cancro solidi ed ematologici, come pure con le cellule derivate dal paziente. Ci sono una serie di vantaggi dell'utilizzo di zebrafish per lo screening di stupefacenti. In linea di principio, i farmaci possono essere aggiunti direttamente in acqua e non è necessario essere iniettato. Inoltre, questo approccio fornisce anche informazioni sulle proprietà ADME (assorbimento, distribuzione, metabolismo ed escrezione) di un candidato della droga. Tuttavia, uno dei principali limiti di questa tecnica è che alcune molecole non sono solubili in acqua e pertanto non sono immediatamente adatti ad essere studiati da questo metodo. Per ovviare a questa limitazione, le cellule tumorali sono state trattate con composti ex vivo per essere iniettato in zebrafish in una fase in cui le cellule sono impegnate, tuttavia mantenere la redditività. I nostri risultati hanno mostrato che le cellule A549 trattati con OT-48 o con BH3 mimetico A1210477 da solo non hanno ridotto fortemente il tumore formando la capacità delle cellule A549 rispetto ad una combinazione di OT48 e A1210477. Questa osservazione ulteriormente convalidato nostro in vitro CFA dove la combinazione ha mostrato effetto anti-cancro significativo rispetto ai trattamenti individuali. Complessivamente, questa tecnica può contribuire alla rapido screening di farmaci in un ambiente preclinico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ricerca presso SNU è sostenuta da Fondazione nazionale per la ricerca (NRF) MEST di Corea per concessione di tumore microambiente Global Core Research Center (GCRC), [numero di grant 2011-0030001]; da la Seoul National University Research Grant e dal cervello Corea (BK21) oltre a programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
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