Summary
وهنا، نقدم الفحص السريري من السرطان كومارينس استخدام الثقافة 3D والزرد.
Abstract
فحص ما قبل السريرية في المختبر و في فيفو من العوامل العلاجية الرواية أداة أساسية في اكتشاف الأدوية السرطان. على الرغم من أن خطوط خلايا السرطان البشرية تستجيب للمركبات العلاجية في 2D أحادي الطبقة (الأبعاد) خلية الثقافات، وضعت نظم الثقافة 3D لفهم مدى فعالية العقاقير في النماذج ذات الصلة أكثر فسيولوجيا. في السنوات الأخيرة، لوحظ تحولاً نموذجياً في البحوث السريرية قبل التحقق من فاعلية الجزيئات الجديدة في نظم الثقافة 3D، ومحاكاة أكثر دقة وورم المكروية. هذه الأنظمة تميز حالة المرض بطريقة أكثر فسيولوجيا ذات صلة وتساعد على اكتساب أفضل آليا إلى المعرفة والفهم للفاعلية الدوائية لجزيء معين. وعلاوة على ذلك، ومع الاتجاه الحالي في تحسين نماذج السرطان في فيفو ، برز الزرد فقاريات نموذجا هاما لتقييم في فيفو تشكيل الورم ودراسة أثر العوامل العلاجية. هنا، نحن التحقيق في الفعالية العلاجية هيدروكسيكومارين OT48 وحدها أو في تركيبة مع mimetics BH3 في خط خلية سرطان الرئة A549 باستخدام ثلاثة نظم الثقافة 3D مختلفة بما في ذلك فحوصات تشكيل مستعمرة (CFA)، كروي تشكيل المقايسة (SFA) و في فيفو تكثيفها الزرد.
Introduction
سرطان ناجم عن الطفرات الخلوية، ونتيجة لذلك تتعطل مسارات الإشارات البيوكيميائية تسبب في انقسام الخلايا غير المنضبط والمقاومة لموت الخلايا. أورام تتداخل مع الوظائف الفسيولوجية لنظم الدورة الدموية، الجهاز الهضمي والجهاز العصبي، و الأنسجة المجاورة في وقت لاحق1. وعلى الرغم من الجهود البحثية واسعة النطاق، يظل السرطان أمراض تهدد الحياة الأكثر انتشارا في العالم2. اعترف الطب الدقيقة كأساس لعلاجات السرطان مستقبلا. الكيانات الجزيئية الجديدة يتم اختبارها بشكل روتيني في تركيبة مع العقاقير الموجودة لتحسين النتائج السريرية.
ومع ذلك، أحد القيود الهامة المرتبطة بتطوير علاجات جديدة تستهدف كفاءة هو فشل الاختبارات المستخدمة عادة لمحاكاة نتائج البيولوجية الدقيقة للمخدرات التعرض3. اكتشاف المخدرات السرطان لا يزال معظمها يعتمد على اختبار فعالية العوامل العلاجية في خطوط خلايا السرطان المستزرعة في 2D أحادي الطبقة الثقافات، مما يصعب من التحقق من صحة في التجارب السريرية4. ولذلك، هناك اهتمام متزايد بتطوير نماذج سرطان أفضل تقليد أفضل الميزات الأصلية للأورام في فيفو5. في السنوات الأخيرة، أدى اهتمام متزايد في نماذج الثقافة 3D تطوير المنهجيات المحسنة لإنتاج نماذج ثلاثية الأبعاد الورم5.
نقدم هنا، هو نهج مع ثلاث تقنيات استزراع خلية 3D مختلفة مما يسمح بتحسين فهم فاعلية هيدروكسيكومارين OT486 في تركيبة مع mimetics BH3 قبل أكثر في العمق في فيفو فحوصات. يتكون لدينا طريقة للجمع بين مستعمرة وسفاس مع فيفو ورم تشكيل اختبار استناداً إلى نموذج الزرد لمواصلة التحقق من فعالية الجمع بين mimetics OT48 و BH3 في خلايا سرطان الرئة، ورصد تطور السرطان في العيش الكائن الحي.
وتستخدم بشكل روتيني فحوصات تشكيل مستعمرة لتقييم فعالية عوامل السرطان للسرطان سواء الصلبة وكذلك المكونة للدم. الإنزيم يحدد قدرة خلية تتكاثر إلى أجل غير مسمى وتشكيل المستعمرات7. أثر عامل السرطان على المستعمرة تشكل قدرة الخلايا يتحدد بخفض عدد و/أو حجم المستعمرات.
تمثل نماذج في المختبر الورم الماغنيسيوم وتكون بمثابة منصة فحص منخفضة التكلفة لوكلاء السرطان. الماغنيسيوم مجاميع خلايا تنمو في تعليق أو مضمن في مصفوفة ثلاثية الأبعاد. وهذا النهج يستخدم على نطاق واسع لفحص المخدرات ودراسات للورم النمو والانتشار والمناعة التفاعل8.
لفهم خصائص دواء جديد تماما، من الضروري إجراء تجارب في فيفو على القوارض. ومع ذلك، هذه الطريقة التقليدية مكلفة وتستغرق وقتاً طويلاً. وفي السنوات الأخيرة، أصبح الزرد (دانيو rerio) كائن مختبر دراسة على نطاق واسع هو أرخص وأسرع لرفع. تطوير أورام في نهج الثقافة الخلية تمثل 3D الزرد ولكن ضمن الإعداد في فيفو من الفقاريات9.
بالإجمال، نحن نستخدم هنا ثلاثة نهج ثقافة 3D مختلفة منها الماليين وسفاس الزرد في فيفو تشكيل الورم لإثبات قدرة السرطان هيدروكسيكومارين OT48 في نموذج خلية A549 سرطان الرئة في تركيبة مع BH3 mimetics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-مستعمرة تشكيل فحوصات
- خلايا A549 الثقافة في تركيز من 20,000 خلايا/سم2 في 15 مل RPMI1640 الخلية المتوسطة الثقافة تستكمل مع 10% FBS (الجنين المصل البقري) والمضادات الحيوية % 1 في قارورة2 75 سم في حاضنة2 CO في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- في يوم التجربة، تحديد تركيز الخلية باستخدام هيموسيتوميتير. جمع الخلايا 50,000 بالطرد المركزي في 400 x ز لمدة 7 دقائق في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل وتعليق إعادة الخلايا في 100 ميليلتر من 1 x العقيمة PBS (الفوسفات مخزنة المالحة) في أنابيب 1.5 مل.
- الاستغناء عن 1.1 مل من شبه الصلبة المتوسطة المستندة إلى ميثيلسيلولوسي (مكبم) في أنابيب 15 مل مع مولتيبيبيتي. إعداد أنبوب واحد لكل حالة.
- إضافة 110 ميليلتر من FBS إلى 1.1 مل مكبم باستخدام ميكروبيبيتي P200.
- خلايا البذور في 1,000 خلايا/مل. جمع 2.4 ميليلتر من تعليق خلية من الحل الأسهم (الخلايا 50,000 في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني 1 x) استخدام ميكروبيبيتي P2، وإضافة إلى 1.1 مل مكبم وتستكمل مع 10% FBS.
- بعد إضافة الخلايا، دوامة الأنابيب ل 1 دقيقة، عقد منها عمودياً على أعلى سرعة لمزج الخلايا ومكبم جيدا.
- إضافة اختبار المركبات (OT48 وحدها أو في تركيبة مع A1210477). إعداد أنبوب منفصلة كعنصر تحكم للمذيبات المستخدمة (هنا ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس])). اعتماداً على تركيز المركبات وحجم المضافة لكل شرط، ستشمل مراقبة المذيبات أعلى تركيز للمذيبات المستخدمة لتخفيف اختبار المركب، لتقييم الآثار الضارة الناجمة عن المذيبات.
- دوامة الأنابيب لمدة 1 دقيقة.
- لكل فحص، إضافة 1 مل المخلوط مع ميكروبيبيتي P1000 إلى مركز لوحة الثقافة الخلية 12-جيدا جيدا.
- سد الآبار فارغة مع 1 مل الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني x 1 لتحقيق الاستقرار في الرطوبة.
- احتضان ثقافة لوحات لمدة 10 أيام في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
- وبعد 10 أيام حضانة، إضافة 200 ميليلتر محلول الأسهم (بروميد ميثيلثيازوليلديفينيل-تيترازوليوم) MTT (5 ملغ/مل) لكل بئر للوصول إلى نهائي بتركيز 1 ملغ/مل.
- احتضان 10 دقيقة في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. سوف تتحول المستعمرات قابلة للحياة البنفسجي.
- التقاط الصور باستخدام كاميرا رقمية باستخدام لوحة خلفية بيضاء (لاس ديا الأبيض صينية). استخدم الإعدادات التالية: الأسلوب، رقمنة؛ نوع التعرض، والدقة؛ زمن التعرض للضوء، دليل، 1 ثانية؛ حساسية/القرار، عالية الدقة. حفظ الصورة في تنسيق tiff.
- التحديد الكمي للمستعمرات قابلة للتطبيق باستخدام برنامج إيماجيج. اختر القائمة "صورة | نوع | 8 بت ". اختر القائمة "ضبط | عتبة ". تعيين العتبة إلى السيطرة وتبقى ثابتة لجميع الظروف؛ اختر القائمة "تحليل | تحليل الجزيئات ". حفظ البيانات وتحليلها باستخدام برنامج الإحصاء لتمثيل رسومي.
2-كروي تكوين الإنزيم
- خلايا A549 الثقافة في تركيز من 20,000 خلايا/سم2 في 75 سم2 قوارير مع 15 مل متوسط RPMI 1640 تستكمل مع المضادات الحيوية FBS و 1% 10%.
- في يوم التجربة، تعد من 96 جيدا U-أسفل لوحة.
- لوحة 10,000 الخلايا في بئر الذي يحتوي بالفعل على مجمع الفائدة (هنا 50 ميكرون من OT48) و/أو 20 ميكرون من A1210477. ضبط الحجم النهائي إلى 100 ميليلتر من مستنبت الخلية. عدد الخلايا التي تشكل الماغنيسيوم موحدة مع حد خارجي سليمة يعتبر كافياً الماغنيسيوم النموذج.
- احتضان لمدة 3 أيام في حاضنة في 37 درجة مئوية وفي شركة 5%2.
- بعد 3 أيام حضانة، التقاط صور الماغنيسيوم استخدام مجهر خفيفة مع 4 x التكبير.
3-الزرد Xenograft الإنزيم
ملاحظة: هو تصور هذا النهج التقني تخطيطي (الشكل 1).
-
إعداد الكواشف الأسهم
- تحضير 1 لتر 30 × الحل دانيو: 1740 مم كلوريد الصوديوم و 21 مم بوكل، 12 مم MgSO4∙7H2س، 18 ملم Ca (لا3)2و 150 مم هيبيس. ضبط لدرجة الحموضة من المخزن المؤقت إلى 7.6 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
- إعداد 1% (50 س) تريكيني الحل: حل 20 ملغ من إيثيل 3-أمينوبينزواتي ميثانيسولفوناتي (تريكيني) في 2 مل ماء المقطر.
- تحضير محلول الفينول الحمراء-برنامج تلفزيوني 1%: إضافة 2 ميليلتر الفينول الأحمر الصوديوم الملح حل ميليلتر 198 الحل برنامج تلفزيوني معقمة في أنبوب 1.5 ميليلتر.
- إعداد methylcellulose 3%: إضافة الجيل الثالث 3g ميثيلسيلولوسي إلى 100 مل 1 × الحل دانو.
-
إنتاج البيض الزرد والحضانة
- أنثى واحدة منفصلة وواحد الزرد الذكور في خزان قسم مليئة بماء الصنبور تعقيم الأشعة فوق البنفسجية والتي تمت تصفيتها في 28.5 درجة مئوية في الظلام. بعد 24 ساعة من انتهاء الخدمة، مزيج من الأسماك من كلا الجنسين لبدء التزاوج. نقل البويضات المخصبة من خزان التزاوج إلى طبق بتري يحتوي على 5 مل من محلول الطازجة دانو.
- أغسل البيض ثلاث مرات مع 5 مل من محلول في دانيو. بعناية للغسيل، نضح البيض مع ماصة ونقل إلى 5 مل من محلول الطازجة. احتضانها ح 8 عند 28.5 درجة مئوية.
- بعد 8 ح الحضانة في حل دانو، تغيير إلى دانو في محلول يحتوي على 0.03% 1-فينيل-2-ال (PTU) تمنع التصبغ. فرز البيض غير شفاف (المخصبة أو تحتوي على أجنة متخلفة) لمنع التلوث.
-
ديتشوريونيشن الجنين
- ح 24 وظيفة التسميد (hpf)، ديتشوريوناتي الزرد الأجنة باستخدام الملقط حادة. تبني الأجنة الفقس في حل دانو مع 0.03% PTU في 28.5 درجة مئوية حتى 48 هبف.
-
إعداد الخلايا المعالجة بالمجمع
- خلايا A549 البذور 20,000 خلايا/سم2 في قوارير الثقافة2 25 سم. بعد 24 ساعة من البذر، إضافة مركبات (OT48 هنا في 50 ميكرومتر وو/أو A1210477 في 20 ميكرومتر) ح 24 في حاضنة في 37 درجة مئوية و 5% CO2. إعداد وقت المعالجة لكل مجمع للحفاظ على سلامة الخلايا ولكن الالتزام بها تجاه موت الخلية. هذا الوقت احتياجات النقطة التي ستنشأ على حدة استناداً إلى جدوى خلية ومورفولوجيا والمؤشرات الجزيئية.
- 2 ح قبل نهاية العلاج، صبغ الخلايا وصمة عار مع 4 ميكرومتر لتعقب خلية الفلورسنت ديل سم في 37 درجة مئوية و 5% CO2. بعد 2 ساعة حضانة، تريبسينيزي الخلايا التي تحتوي على 0.05% التربسين-يدتا، وتمييع 106 خلايا في 50 ميليلتر من حل الفينول الحمراء-برنامج تلفزيوني قبل الحقن.
-
الصغير-حقن الخلايا السرطانية لتشكيل إكسينوجرافت
- تخدير الزرد في حل تريكيني 0.02 في المائة لمدة 5 دقائق حتى أنها تستقر على صفيحة أجار.
- سحب من 1.0 مم (خارج القطر (OD) الزجاج الشعرية) بساحبة ميكروبيبيتي (إعدادات البرنامج: p: 300، والحرارة: 260، سحب: 60، حطي: 50، والوقت: 200). قص ميكروكابيلاري مع حقنه لإنتاج على حافة حادة. تحميل ميكروكابيلاريس مع 20 ميليلتر من خلية/الفينول الأحمر-حل برنامج تلفزيوني. تعيين ضغط الحقن، وحان الوقت للاستغناء عن 2 nL للحقنة.
- حقن الخلايا 100-200 كيس ألمح بالحقن 6 إلى 10 nL عن طريق الحقن 3 إلى 5. بعد الحقن، تسمح للأسماك لاسترداد لمدة 10 إلى 30 دقيقة في 5 مل الطازجة دانو الحل الذي يتضمن الحل PTU. إرسال الأسماك في لوحات 24-جيدا مع 1 مل من محلول دانو ليحتوي على حل PTU واحتضانها ح 72 في 28.5 درجة مئوية.
- بعد 72 ساعة حضانة، تخدير الأسماك في حل تريكيني 0.02% وشل على شريحة زجاجية مع قطره ميثيلسيلولوسي 3%. تأخذ 5 x صور بالميكروسكوب fluorescence في موجه من 620 إلى 750 نانومتر.
- التحديد الكمي لحجم الأورام الفلورسنت بالبرمجيات إيماجيج. اختر القائمة "تحليل | التدبير ". حفظ القيم المقابلة لإشارة الفلورسنت وتحليلها باستخدام برنامج الإحصاء لتمثيل رسومي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في الشكل 2، سرطان الرئة الخلية خط A549 كان المصنف في مكبم على شكل مستعمرات بعد العلاج مع OT48 وحدها أو في تركيبة مع A1210477 BH3 mimetic في تركيزات المشار إليه. وأظهرت النتائج أن التركيبة انخفاضا ملحوظا العدد والحجم والمساحة الكلية للمستعمرات بعد 10 أيام حضانة.
في الشكل 3، خلايا A549 تعامل مع OT48 وحدها أو في تركيبة مع BH3 mimetic A1210477 وسمح لهم بشكل الماغنيسيوم بتقنية يو-أسفل لوحة. بعد 3 أيام حضانة، أخذت صور الماغنيسيوم. تم التحديد الكمي الماغنيسيوم "ي الصور" و 3D باستخدام الصور التي تم إنشاؤها.
في الشكل 4، تعامل مع OT48 وحدها أو في تركيبة مع A1210477 mimetic BH3 ح 24 A459 الخلايا وحقنها في كيس ألمح الزرد. بعد 72 ساعة، يرتبط القياس الكمي للأورام الفلورسنت إمكانات المثبطة للمجمع.
رقم 1: رسم تخطيطي للعملية الشاملة للمقايسة xenograft الزرد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: تشكيل مستعمرة التآزري لتثبيط A549 هيدروكسيكومارين OT48 والبوسنة والهرسك-3 A1210477 ميميتيك- (أ) الصور للمقايسة تشكيل مستعمرة A549 تعامل مع 50 ميكرون من OT48 و/أو 20 ميكرون من A1210477. (ب-د) التحديد الكمي لعدد ومتوسط الحجم، والمساحة الكلية للمستعمرات. وتحققت تجارب في ثلاث نسخ. أجريت التحاليل بعد المخصصة . دلالات إحصائية تم تقييمها في الرتبة فقيم أقل من 0.05 ويمثلها الأسطورة التالية: * ≤0.05 ف، * * ≤0.01 ف، * * * ≤0.001 ف، * * * ≤0.0001 ف؛ وظيفة المخصصة ويحلل دونيت؛ صداق). جميع رسوم بيانية تمثل ± يعني SD على الأقل ثلاث تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: تأثير OT48 و/أو A1210477 على قدرة A549 الخلايا إلى شكل الماغنيسيوم. صور الماغنيسيوم الورم A549 بعد 3 أيام.
الشكل 4: تثبيط الورم A549 تشكيل كتلة بمجمع. تظهر الصور (أ) تأثير المثبطة OT48 و/أو A1210477 على الورم تشكيل قدرة خلايا A549 ديل الملطخة سم. (ب) التحديد الكمي لتشكيل الأورام. أجريت التحاليل بعد المخصصة . دلالات إحصائية تم تقييمها في الرتبة فقيم أقل من 0.05 ويمثلها الأسطورة التالية: * ≤0.05 ف، * * ≤0.01 ف، * * * ≤0.001 ف، * * * ≤0.0001 ف؛ وظيفة المخصصة ويحلل دونيت؛ صداق). جميع رسوم بيانية تمثل ± يعني SD من تجارب مستقلة على الأقل عشرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
معدلات تكوين مستعمرة الحصول عليها مع مكبم يعتمد على نوع الخلية. عادة، هو عدد المستعمرات للخلايا غير ملتصقة، أعلى بكثير مقارنة بالخلايا ملتصقة. ولاحظنا أن خلايا A549 شكلت مستعمرات 30 إلى 40 بعد 10 أيام. سابقا قد أبلغنا لخلايا اللوكيميا المختلفة أن عدد المستعمرات ما بين 200 إلى 2509. وأظهرت النتائج التي توصلنا إليها أن OT48 وحدها لا تنتج انخفاضا كبيرا في عدد من المستعمرات وحدها. ومع ذلك، ميميتيك A1210477 من القدرة على تشكيل مستعمرة خلايا A549 تآزر انخفض في تركيبة مع BH3. نحن أفاد سابقا أن مشتق هيدروكسيكومارين آخر OT52 أيضا التآزر مع BH3 mimetics تحول دون قدرة خلايا A549 تشكيل مستعمرة. قد تختلف تركيز بذر المقترح 1 × 103 إلى 1.5 × 103. فرنك ميثوكولت باستخدام تقنية قيمة تستخدم بشكل روتيني لقياس توموريجينيسيس في مختلف خطوط خلايا السرطان، ولكن لديه بعض القيود. غالباً ما استرداد المستعمرات قابلة للاستمرار بعد التجربة غير مريح، والخلايا لا تنمو جيدا مرة واحدة معزولة عن مكبم وتبذر في المتوسط RPMI1640. ومع ذلك، أسلوب ما قبل سريرية مقبولة تماما لفهم إليه تطور السرطان في بيئة ثلاثية الأبعاد. ظروف النمو 3D تمثيل دقيق للبيئة الطبيعية في تشكيل الأورام في جو في فيفو . ومع ذلك، هذا الأسلوب بطيء، العمل المكثف وغير مناسب لإنتاجية عالية فحص10.
يتم تنفيذها مع خلايا ملتصقة سفاس واكتسبت شعبية واسعة في اكتشاف الأدوية السرطان كما أنها تظهر الصفات الفسيولوجية مثل بقاء زيادة خلية ومورفولوجيا الورم ونواة التاكسج التي أكثر تمثيلاً من الوضع في فيفو 11،12. قد يختلف الحجم الكلي والنسيج، وسلامة الماغنيسيوم التي حصلت عليها تقنية يو-أسفل لوحة بين خطوط الخلايا. وعلاوة على ذلك، تركز بدءاً من الخلايا المستخدمة في النموذج الماغنيسيوم قد تؤثر أيضا في التنمية الشاملة. النتائج التي توصلنا إليها أظهرت أن OT48 في تركيبة مع BH3 mimeticA1210477 تحول دون سلامة كروي، وخفضت كروي تشكيل قدرة خلايا A549. سابقا أننا عنها تثبيط الماغنيسيوم A549 آخر مشتقات هيدروكسيكومارين في تركيبة مع BH3 mimetics9. المزايا الرئيسية لهذا الأسلوب هي إمكانية تكرار نتائج وفعالية التكاليف. وتستخدم تقنيات أخرى مثل تقنية تراكب السائل أيضا بشكل روتيني وضع الماغنيسيوم 3D للخلايا السرطانية. في هذا الأسلوب تنمو خلايا على طبق ثقافة خلية غير ملتصقة. هي كتل الخلايا ثم جمعها ووضعها في الثقافة تعليق الماغنيسيوم النموذج. أحد أوجه القصور الرئيسية المرتبطة بهذا الأسلوب غير أن نقل كتل الخلية إلى ثقافة الوقف، الذي أمر لا يمكن تحمله جيدا بمختلف خطوط الخلايا. لزيادة الإنتاجية من مجمع فحص نظام ثقافة 3D، بعض شركات تطوير ركائز محددة، ولوحات الفحص مرفق منخفضة، والسقالات تحسين تشكيل هياكل ثلاثية الأبعاد13. مع زيادة التقدم التقني، سيتيح وضع نموذج ثلاثي الأبعاد الورم أكثر تمثيلاً إلى فهم أفضل لعلم الصيدلة مركبات جديدة لنوع معين من السرطان.
وتعتبر تكثيفها الزرد فحوصات الحيوان الأكثر فعالية من حيث التكلفة التي تستخدم بشكل روتيني للمخدرات السرطان التنمية9،14. نحن الأمثل في فيفو الزرد النظام مع مختلف أنواع السرطان الصلبة والدم وكذلك مع الخلايا المستمدة من المريض. وهناك عدد من المزايا لاستخدام الزرد لفحص المخدرات. من حيث المبدأ، يمكن أن تضاف مباشرة في الماء ولا تحتاج إلى حقن المخدرات. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا النهج أيضا معلومات حول ADME خصائص (الاستيعاب، والتوزيع، والايض والافراز) مرشح المخدرات. غير أن أحد أوجه القصور الرئيسية في هذا الأسلوب بعض الجزيئات ليست للذوبان في الماء وبالتالي لا مناسبة فورا التحقيق في هذا الأسلوب. للتغلب على هذا التحديد، تعامل الخلايا السرطانية مع مركبات فيفو السابقين أن حقن الزرد في مرحلة التي ترتكب فيها الخلايا، ومع ذلك الحفاظ على استمرارية. أظهرت نتائجنا أن خلايا A549 تعامل مع OT-48 أو مع BH3 mimetic A1210477 وحدها لا بشدة يقلل الورم تشكيل قدرة خلايا A549 مقارنة بمزيج من OT48 و A1210477. كذلك التحقق من صحة هذه الملاحظة لدينا في المختبر فرنكات الجماعة المالية الأفريقية حيث أظهرت أن الجمع بين تأثير مضاد للسرطان كبير مقارنة بالعلاجات الفردية. إجمالاً، يمكن أن تسهم هذه التقنية الفرز السريع للمخدرات في إعداد الإكلينيكية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
البحث في SNU معتمد من قبل مؤسسة البحوث الوطنية (جبهة الخلاص الوطني) من MEST كوريا لمنحه ورم المكروية العالمية الأساسية البحث مركز (جكرك)، [عدد المنح 2011-0030001]؛ منحة بحثية الجامعة الوطنية في سيول، والدماغ كوريا (BK21) بالإضافة إلى ذلك البرنامج.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
