Summary
Hier präsentieren wir Ihnen die präklinische Vorführung von krebsbekämpfende Cumarine mit 3D Culture und Zebrafisch.
Abstract
In Vitro und in Vivo prä-klinischen Screening von neuartiger Therapeutika sind ein wesentliches Instrument in der Drogeentdeckung Krebs. Obwohl menschliche Krebszelllinien therapeutischen Verbindungen in 2D (dreidimensionale) Monoschicht Zellkulturen Rechnung zu tragen, wurden 3D Culture Systeme entwickelt, um die Wirksamkeit von Medikamenten in mehr physiologisch relevanten Modelle zu verstehen. In den letzten Jahren verzeichneten ein Paradigmenwechsel in der präklinischen Forschung, die Potenz der neuen Moleküle in 3D Culture Systeme, genauer imitiert den Tumor Mikroumgebung zu validieren. Diese Systeme den Krankheitszustand zu charakterisieren, in gewissem Sinne mehr physiologisch relevanten und helfen, besser mechanistische Einblicke und Verständnis der pharmakologischen Potenz eines bestimmten Moleküls. Darüber hinaus ist mit dem aktuellen Trend in Vivo Krebs Modelle zu verbessern, Zebrafisch entstanden, als ein wichtiges fest gefügten Modell zu bewerten in Vivo Tumorbildung und Studie die Wirkung von therapeutischen Wirkstoffen. Hier untersuchten wir die therapeutische Wirksamkeit des Hydroxycoumarin OT48 allein oder in Kombination mit BH3-Mimetika in Lunge-Krebs-Zell-Linie A549 mithilfe von drei verschiedenen 3D Culture-Systeme einschließlich der Kolonie Bildung Assays (CFA), Sphäroid Bildung Assay (SFA) und in Vivo Zebrafisch Xenotransplantate.
Introduction
Krebs wird durch zelluläre Mutationen verursacht und folglich biochemischen Signalwege gestört werden, unkontrollierte Zellteilung und Widerstand zum Zelltod auszulösen. Tumoren stören mit physiologischen Funktionen von Verdauungs, Nervensystem, Herz-Kreislauf-Systems und anschließend benachbarte Gewebe1. Trotz umfangreicher Forschungsbemühungen bleibt Krebs die häufigste lebensbedrohliche Krankheit in der Welt2. Präzisions-Medizin wurde als Grundlage für zukünftige Krebstherapie anerkannt. Neue Wirkstoffe werden routinemäßig getestet in Kombination mit vorhandenen Drogen, klinische Outcome zu verbessern.
Eine erhebliche Einschränkung verbunden mit der Entwicklung der neuen effiziente zielgerichtete Therapien ist jedoch das Scheitern von häufig verwendeten Assays, die genaue biologische Ergebnis der Droge Exposition3zu simulieren. Krebs Wirkstoffforschung stützt sich nach wie vor überwiegend auf testen die Wirksamkeit therapeutischer Wirkstoffe in Krebszelllinien kultiviert in 2D Monolayer-Kulturen, die schwer in klinischen Studien4zu validieren sind. Daher gibt es ein wachsendes Interesse, bessere Krebs Modelle zu entwickeln, die die systemeigene Funktionen von Tumoren in Vivo5besser zu imitieren. In den letzten Jahren führte ein zunehmendes Interesse an 3D Culture Modelle die Entwicklung von verbesserten Methoden, 3D Tumor Modelle5zu produzieren.
Hier stellen wir einen Ansatz mit drei verschiedenen 3D Zelle Kulturtechniken zur Verbesserung des Verständnisses der Potenz des Hydroxycoumarin OT486 in Kombination mit BH3-Mimetika vor mehr in Tiefe in Vivo Tests. Unsere Methode besteht darin, Kolonie und SFAs mit einem in Vivo Tumor Bildung Test basiert auf einem Zebrafisch-Modell weiter bestätigen die Wirksamkeit der Kombination von OT48 und BH3-Mimetika in Lungenkrebszellen und überwachen Krebsentwicklung in einer lebendigen verbinden Organismus.
Kolonie-Bildung-Assays sind routinemäßig zur Wirksamkeit der Anti-Krebs-Agents für solide sowie hämatopoetischen Krebsarten zu beurteilen. Der Test bestimmt die Fähigkeit einer Zelle zu vermehren auf unbestimmte Zeit und bilden Kolonien7. Die Wirkung von Anti-Krebs-Agent auf die koloniebildenden Fähigkeit der Zellen wird durch Abnahme der Anzahl und/oder Größe der Kolonien bestimmt.
Sphäroide vertreten in Vitro Tumormodellen und dienen als eine kostengünstige Screening-Plattform für Anti-Krebs-Agenten. Sphäroide sind Aggregate von Zellen in Suspension wachsen oder in einer 3D Matrix eingebettet. Dieser Ansatz ist für Wirkstoff-Screening und Studien von Tumor Wachstum, Vermehrung und Immune Interaktion8verbreitet.
Um die Eigenschaften eines neuen Medikaments vollständig zu verstehen, gilt es in Vivo Experimente auf Nagetiere durchzuführen. Diese herkömmliche Methode ist jedoch teuer und zeitaufwendig. Zebrafisch (Danio Rerio) wurde in den letzten Jahren ein weit studierte Labor-Organismus, der ist billiger und schneller zu erhöhen. Tumoren entwickelt im Zebrafisch repräsentieren eine 3D Zelle Kultur Ansatz aber innerhalb der in Vivo -Einstellung eines Wirbeltier-9.
Insgesamt verwenden wir hier drei verschiedene 3D Culture Ansätze einschließlich aufgewendete, SFAs und Zebrafisch in Vivo Tumorbildung um die Anti-Krebs der Hydroxycoumarin OT48 in einem Lungenkrebs Krebs A549 Zellmodell in Kombination mit BH3-Mimetika unter Beweis zu stellen.
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Protocol
(1) Kolonie Bildung Assays
- Kultur A549 Zellen in einer Konzentration von 20.000 Zellen/cm2 in 15 mL RPMI1640 Zelle Kulturmedium ergänzt mit 10 % FBS (fetale Rinderserum) und 1 % Antibiotika in einem 75 cm2 Kolben in eine CO2 Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Am Tag des Experiments bestimmen Sie die Zellkonzentration mithilfe eines Hemocytometer. Sammeln Sie 50.000 Zellen durch Zentrifugation bei 400 X g für 7 min in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und auszusetzen Sie Zellen in 100 µL 1 X sterile PBS (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung) in 1,5 mL Röhrchen wieder.
- 1,1 mL halbfeste Methylcellulose-basierte Medium (MCBM) in 15 mL Tuben mit einer Multipipette zu verzichten. Bereiten Sie eine Röhre für jede Bedingung.
- 1,1 mL MCBM mit einer Mikropipette P200 fügen Sie 110 µL FBS hinzu.
- Samen Zellen bei 1.000 Zellen/mL. 2.4 µL Zellsuspension aus der Stammlösung (50.000 Zellen in 100 µL 1 X PBS) sammeln mit Hilfe einer Mikropipette P2 und hinzufügen auf 1,1 mL MCBM ergänzt mit 10 % FBS.
- Nach dem Hinzufügen der Zellen Wirbel die Röhren für 1 min, hielt sie vertikal mit der höchsten Geschwindigkeit MCBM und Zellen gut mischen.
- Fügen Sie Testverbindungen (OT48 allein oder in Kombination mit A1210477). Bereiten Sie einen separaten Schlauch als Steuerelement für das Lösungsmittel verwendet (hier Dimethyl Sulfoxid (DMSO)). Abhängig von der Konzentration der Verbindungen und die Lautstärke für jede Bedingung hinzugefügt beinhaltet das Lösungsmittel-Steuerelement die höchste Konzentration an Lösungsmittel verwendet für die Verdünnungen der Testverbindung für Beeinträchtigungen durch das Lösungsmittel zu bewerten.
- Vortex-Rohre für 1 Minute.
- Fügen Sie für jede Probe 1 mL der Mischung mit einer Mikropipette P1000 auch ein 12-Well Zellplatte Kultur Zentrum hinzu.
- Füllen Sie leere Brunnen mit 1 mL sterilem Wasser oder 1 X PBS, Luftfeuchtigkeit zu stabilisieren.
- 10 Tage im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren Sie Kultur Platten.
- Fügen Sie nach 10 Tagen Inkubation 200 µL der Stammlösung ein MTT-(Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium Bromid) (5 mg/mL) in jede Vertiefung, eine Endkonzentration von 1 mg/mL zu erreichen.
- Inkubieren Sie 10 min. im Inkubator bei 37 ° C und 5 % CO2. Tragfähige Kolonien schaltet sich violett.
- Erfassen Sie das Abbild mit einer Digitalkamera mit der weiße Hintergrundplatte (LAS weißen Dia Tray). Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Methode, zu digitalisieren; Exposition Art, Präzision; Belichtungszeit, Handbuch, 1 Sekunde; Empfindlichkeit/Auflösung, hohe Auflösung. Speichern Sie das Bild im TIFF-Format.
- Quantifizieren Sie tragfähige Kolonien mit ImageJ-Software. Menü "Auswahl" "Bild | Typ | 8-Bit". Menü "Auswahl" "Adjust | Threshold". Festlegen Sie Schwellenwert, zu kontrollieren und halten Sie für alle Bedingungen konstant zu; Menü "Auswahl" "Analyze | Analysieren Sie Partikel". Daten speichern und analysieren mit einer Statistik-Software für grafische Darstellung.
(2) Sphäroid Bildung Assay
- Kultur A549 Zellen in einer Konzentration von 20.000 Zellen/cm2 in 75 cm2 Fläschchen mit 15 mL RPMI 1640 Medium mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika ergänzt.
- Am Tag des Experiments, bereiten eine 96 gut U-Bodenplatte.
- Platte 10.000 Zellen in einen Brunnen, der bereits die Verbindung von Interesse (hier 50 µM der OT48) bzw. 20 µM A1210477 enthält. Die letzte Lautstärke zu 100 µL Zellkulturmedium. Die Anzahl der Zellen, die einheitliche Sphäroide mit eine intakte äußere Begrenzung gilt als ausreichend, um Form Sphäroide.
- 3 Tage im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2inkubieren.
- Nach 3 Tagen Inkubation die Aufnahmen von der Sphäroide mit einem Lichtmikroskop mit 4 X Vergrößerung.
(3) Zebrafisch Xenograft-Assay
Hinweis: Dieser technische Ansatz ist als ein Schaltplan (Abbildung 1) visualisiert.
-
Vorbereitung der Lager Reagenzien
- Bereiten Sie 1 L 30 x Danieaus Lösung: 1740 mM NaCl, KCl 21 mM, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (NO3)2und 150 mM HEPES. Der pH-Wert des Puffers bis 7.6 mit dem pH-Meter passen.
- Bereiten Sie 1 % (50 X) Tricaine Lösung: 20 mg Ethyl-3-Aminobenzoate-Methanesulfonate (Tricaine) in 2 mL destilliertem Wasser auflösen.
- Bereiten Sie 1 % Phenol Red-PBS-Lösung: Add 2 µL Phenol rot Natrium-Salz-Lösung zu 198 µL sterilisierte PBS-Lösung in einem 1,5 µL Rohr.
- 3 % Methylcellulose vorbereiten: 100 mL 1 x Danieaus Lösung 3 g von Methylcellulose hinzufügen.
-
Zebrafisch-Ei-Produktion und Inkubation
- Trennen eines weiblichen und eines männlichen Zebrafisch in eine Partition Tank gefüllt mit UV-sterilisiert und gefiltertes Leitungswasser bei 28,5 ° C im Dunkeln. Nach 24 Stunden der Trennung mix Fisch beider Geschlechter, Paarung zu initiieren. Übertragen Sie befruchtete Eier aus der Paarung Tank auf einer Petrischale mit 5 mL frischem Danieau Lösung.
- Waschen Sie Eier dreimal mit 5 mL Danieau Lösung. Aspirieren Sie für das Waschen sorgfältig die Eier mit einer Pipette und Transfer zum 5 mL frische Lösung. 8 h bei 28,5 ° c inkubieren
- Ändern Sie nach 8 h Inkubation in Danieau Lösung in Danieau Lösung mit 0,03 % 1-Phenyl-2-Thioharnstoff (PTU), Pigmentierung zu hemmen. Aussortieren von undurchsichtigen Eier (unbefruchtete oder mit unbebauten Embryonen) um Verunreinigungen zu verhindern.
-
Embryo-dechorionation
- 24 h post Düngung (hpf), Dechorionate Zebrafisch-Embryonen mit scharfen Pinzette. Schraffur Embryonen in Danieau Lösung mit 0,03 % inkubieren PTU bei 28,5 ° C bis 48 hpf.
-
Verbindung-behandelten Zellen Vorbereitung
- Samen A549 Zellen bei 20.000 Zellen/cm2 in 25 cm2 Kulturflaschen. Nach 24 Stunden der Aussaat Verbindungen hinzufügen (hier OT48 bei 50 µM und/oder A1210477 bei 20 µM) für 24 Std. im Brutschrank bei 37 ° C und 5 % CO2. Richten Sie die Behandlungszeit für jede Verbindung die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, sondern in Richtung Zelltod zu begehen. Dieser Zeitpunkt muss individuell anhand der Zellviabilität, Morphologie und molekulare Marker eingerichtet werden.
- 2 h vor dem Ende der Behandlung, Farbstoff Fleck Zellen mit 4 µM fluoreszierende Zelle Tracker CM-Dil bei 37 ° C und 5 % CO2. Nach 2 h Inkubation trypsinize Zellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA und 106 Zellen in 50 µL Phenol Red-PBS-Lösung vor der Injektion zu verdünnen.
-
Mikro-Injektion von Krebszellen für Xenograft-Bildung
- Zebrafisch eine 0,02 % Tricaine Lösung für 5 min zu betäuben, bis sie auf einer nährbodenplatte niederzulassen.
- Ziehen Sie eine 1,0 mm (außen Durchmesser (OD) Glas Kapillare) von einer Mikropipette Abzieher (Programm-Einstellungen: P: 300, Hitze: 260, ziehen: 60, VEL: 50 und Zeit: 200). Schneiden Sie die Microcapillary mit einer Spritze, eine scharfe Kante zu produzieren. Laden mikrokapillaren mit 20 µL der Zelle/Phenol Red-PBS-Lösung. Einspritzdruck und Uhrzeit einstellen, um zu verzichten, 2 nL pro Injektion.
- Injizieren von 100 – 200 Zellen in dem Dottersack durch Injektion 6 bis 10 nL über 3 bis 5 Injektionen. Können Sie nach der Injektion Fisch für 10 bis 30 min in 5 mL frisches Danieau Lösung mit PTU Lösung wiederherstellen. Versand Fische in 24-Well-Platten mit 1 mL Danieau Lösung mit PTU Lösung und 72 h bei 28,5 ° c inkubieren
- Nach 72 h Inkubationszeit Fisch in einer 0,02 % Tricaine Lösung zu betäuben und auf einem Objektträger mit einem Rückgang von 3 % Methylcellulose zu immobilisieren. 5 X fotografieren durch Fluoreszenzmikroskopie bei einer Wellenlänge von 620 bis 750 nm.
- Quantifizieren Sie die Größe des fluoreszierenden Tumoren von ImageJ-Software. Menü "Auswahl" "Analyze | Maßnahme". Speichern von Werten entspricht das Fluoreszenzsignal und analysieren mit einer Statistik-Software für grafische Darstellung.
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Representative Results
In Abbildung 2Lungenkrebs Zelllinie, die A549 in MCBM Form Kolonien nach der Behandlung mit OT48 allein oder in Kombination mit BH3 mimetischen A1210477 in den angegebenen Konzentrationen ausgesät wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass die Kombination Anzahl, Größe und Fläche der Kolonien nach 10 Tagen Inkubation deutlich reduziert.
In Abbildung 3A549 Zellen wurden mit OT48 allein oder in Kombination mit BH3 mimetischen A1210477 behandelt und durften Form Sphäroide durch die U-Boden-Platte-Technik. Nach 3 Tagen Inkubation wurden Bilder von Sphäroide genommen. Quantifizierung der Sphäroide erfolgte mit Bild J und 3D Bilder erzeugt wurden.
In Abbildung 4waren A459 Zellen mit OT48 behandelt, allein oder in Kombination mit BH3 mimetischen A1210477 für 24 h und in der Zebrafisch Dottersack injiziert. Nach 72 h Quantifizierung von fluoreszierenden Tumoren korreliert mit der hemmenden Potenzial der Verbindung.
Abbildung 1: Schematische Darstellung des gesamten Prozesses der Zebrafisch-Xenograft-Assays. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: synergistische Hemmung A549 Kolonie Bildung von Hydroxycoumarin OT48 und BH-3 mimetischen A1210477. (A) Bilder von einem A549 Kolonie Bildung Assay mit 50 µM OT48 und/oder 20 µM A1210477 behandelt. (B-D) Quantifizierung der Gesamtfläche von Kolonien, Anzahl und durchschnittliche Größe. Experimente wurden in dreifacher Ausführung realisiert. Post-hoc- Analysen wurden durchgeführt. Statistischen Bedeutungen wurden auf p-Werte unter 0,05 ausgewertet und dargestellt durch die folgende Legende: * p ≤0.05, ** p ≤0.01 *** p ≤0.001 *** p ≤0.0001; Post-Hoc Analysen Dunnett; Sidak). Alle Histogramme repräsentieren den Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Wirkung von OT48 und/oder A1210477 auf die Kapazität der A549 Zellen zu Form Sphäroide. Bilder von A549 Tumor Sphäroide nach 3 Tagen.
Abbildung 4: Hemmung der A549 Masse Tumorbildung durch eine Verbindung. (A) Bilder zeigen die hemmende Wirkung des OT48 bzw. A1210477 auf den Tumor Kapazität von CM-Dil-gefärbten A549 Zellen bilden. (B) Quantifizierung der Tumorbildung. Post-hoc- Analysen wurden durchgeführt. Statistischen Bedeutungen wurden auf p-Werte unter 0,05 ausgewertet und dargestellt durch die folgende Legende: * p ≤0.05, ** p ≤0.01 *** p ≤0.001 *** p ≤0.0001; Post-Hoc Analysen Dunnett; Sidak). Alle Histogramme repräsentieren den Mittelwert ± SD von mindestens zehn unabhängigen Experimenten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die Preise der Kolonie Formation mit MCBM erhalten richtet sich nach dem Zelltyp. Für nicht-anhaftende Zellen, wird die Anzahl der Kolonien in der Regel viel höher mit adhärenten Zellen verglichen. Wir beobachteten, dass A549 Zellen nach 10 Tagen 30 bis 40 Kolonien gegründet. Zuvor haben wir für verschiedene Leukämiezellen berichtet, dass die Anzahl der Kolonien zwischen 200 bis 2509ist. Unsere Ergebnisse zeigten, dass OT48 allein keine signifikante Abnahme der Anzahl der Kolonien allein herstellte. Allerdings wurde in Kombination mit BH3 mimetischen A1210477 Kolonie bildende Fähigkeit A549 Zellen synergistisch reduziert. Zuvor haben wir berichtet, dass ein weiteres Hydroxycoumarin-Derivat OT52 auch mit BH3-Mimetika zusammenwirkten, um die Kolonie bildende Fähigkeit A549 Zellen zu hemmen. Die vorgeschlagenen seeding Konzentration variiert von 1 x 103 bis 1,5 x 103. CFA mit MethoCult ist eine wertvolle Technik zur Messung der Tumorgenese in verschiedenen Krebszelllinien routinemäßig eingesetzt, aber es hat einige Einschränkungen. Oft die Wiederherstellung von tragfähigen Kolonien nach das Experiment unbequem ist, und Zellen nicht auch einmal wachsen von MCBM isoliert und in RPMI1640 Medium ausgesät. Dennoch ist es eine gut angenommen vorklinischen Technik zum besseren Verständnis des Mechanismus der Krebsentwicklung in einer 3D-Umgebung. Die 3D Wachstumsbedingungen repräsentieren genau die natürliche Umgebung der Tumorbildung in einer in Vivo . Aber diese Methode ist langsam, arbeitsintensiv und nicht geeignet für Hochdurchsatz-screening-10.
SFAs sind mit adhärenten Zellen durchgeführt und große Popularität in der Drogeentdeckung Krebs gewonnen, da sie physiologische Eigenschaften wie erhöhte Zelle überleben, Tumor Morphologie und einem hypoxischen Kern aufweisen, die für eine in-Vivo -Situation mehr repräsentativ sind 11,12. Die Gesamtgröße, die Textur und die Integrität der Sphäroide erhalten durch die U-Boden-Platte-Technik variieren zwischen Zell-Linien. Darüber hinaus kann ab Konzentration der Zellen zur Form Sphäroide ebenfalls seine Gesamtentwicklung beeinflussen. Unsere Resultate zeigten, dass OT48 in Kombination mit BH3 mimeticA1210477 Sphäroid Integrität gehemmt und reduziert Sphäroid Fähigkeit A549 Zellen bilden. Zuvor berichteten wir Hemmung der A549 Sphäroide durch ein weiteres Hydroxycoumarin-Derivat in Kombination mit BH3-Mimetika-9. Wesentliche Vorteile dieser Technik sind die Reproduzierbarkeit und die Wirtschaftlichkeit. Andere Techniken wie die flüssige Overlay-Technik sind auch routinemäßig verwendet, um 3D Sphäroide von Krebszellen entwickeln. Bei dieser Technik wachsen Zellen in der Kulturschale-anhaftende Zellen. Die Zelle Klumpen sind dann gesammelt und in SUSPENSIONSKULTUR, Form Sphäroide. Eine der großen Einschränkungen verbunden mit dieser Technik ist jedoch die Übertragung der Zelle Klumpen, die Federung-Kultur, die durch verschiedene Zelllinien nicht gut vertragen wird. Um den Durchsatz des zusammengesetzten screening ein 3D Kultursystem zu erhöhen, entwickeln einige Unternehmen bestimmte Substrate, niedrige anbauplatten Assay und Gerüste, die Verbesserung der Bildung von 3D-Strukturen13. Mit weiteren technischen Fortschritten wird ein repräsentativer 3D Tumor-Modell ermöglichen ein besseres Verständnis für die Pharmakologie des neuartigen Verbindungen für eine bestimmte Art von Krebs.
Zebrafisch Xenotransplantate gelten als die kostengünstigste Tier Assays für Krebsmedikament Entwicklung9,14routinemäßig eingesetzt. Wir optimiert das Zebrafisch- in Vivo -System mit verschiedenen festen und hämatologische Krebsarten sowie mit Patienten gewonnenen Zellen. Es gibt eine Reihe von Vorteile der Verwendung von Zebrafisch für Drogen-Screening. Im Prinzip die Medikamente direkt ins Wasser zugesetzt werden und müssen nicht injiziert werden. Darüber hinaus informiert dieser Ansatz auch über die ADME (Absorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung) Eigenschaften eines Wirkstoff-Kandidaten. Eine wichtige Einschränkung dieser Technik ist jedoch einige Moleküle sind nicht wasserlöslich und eignen sich daher nicht sofort von dieser Methode untersucht werden. Um diese Einschränkung zu umgehen, wurden Krebszellen mit Verbindungen Ex Vivo in Zebrafisch injiziert werden, zu einem Zeitpunkt, wo die Zellen begangen werden, dennoch warten Lebensfähigkeit behandelt. Unsere Resultate zeigten, dass A549 Zellen mit OT-48 behandelt oder mit BH3 mimetischen A1210477 allein nicht stark reduzieren den Tumor bilden Fähigkeit A549 Zellen im Vergleich zu einer Kombination aus OT48 und A1210477. Diese Beobachtung bestätigt weiter unseren in-vitro- CFA, wo die Kombination signifikante Anti-Krebs-Wirkung im Vergleich zu einzelnen Behandlungen zeigte. Insgesamt kann diese Technik zu schnell-Screening von Drogen in einer präklinischen Einstellung beitragen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Forschung an der SNU wird unterstützt durch die National Research Foundation (NRF) von MEST Korea für Tumor Mikroumgebung Global Core Research Center (GCRC) Zuschuss, [Grant-Nummer 2011-0030001]; von der Seoul National University Research Grant und Gehirn Korea (BK21) PLUS Programm.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
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