Summary
Die Fähigkeit von humanen embryonalen Stammzellen sich selbst zu erneuern und zu differenzieren sich in alle Zelltypen des Körpers lässt vermuten, dass sie großes Versprechen für medizinische Anwendungen und als Recherche-Tool für die Bewältigung grundlegender Fragen in Entwicklung und Krankheit zu halten. Hier bieten wir Ihnen einen kurzen Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen aus Embryonen, die durch immunosurgical Isolierung der inneren Zellmasse.
Abstract
Die Fähigkeit von humanen embryonalen Stammzellen sich selbst zu erneuern und zu differenzieren sich in alle Zelltypen des Körpers lässt vermuten, dass sie großes Versprechen für medizinische Anwendungen und als Recherche-Tool für die Bewältigung grundlegender Fragen in Entwicklung und Krankheit zu halten. Hier bieten wir Ihnen einen kurzen Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen aus Embryonen, die durch immunosurgical Isolierung der inneren Zellmasse.
Protocol
Gefrorene menschlichen Embryonen zu humanen embryonalen Stammzellen (hES) Zellen Ableitung verwendet wurden für die Forschung nach einer ordnungsgemäßen Einwilligung Rahmen von Forschungs-Protokolle, die überprüft und durch das Komitee über die Verwendung von menschlichen Probanden und die Forschung an embryonalen Stammzellen Aufsichtsgremium genehmigt an der Harvard University gespendet .
Geschrieben untenstehenden Protokoll basiert auf den veröffentlichten Parametern von Cowan et al berichtet wurden. 2004, mit leichten Modifikationen.
Embryo Culture
Thaw menschlichen Embryonen mit Quinn Advantage Kit auftauen und Kultur in Tropfen von Global-Medium mit 15% Plasmanate bis zur Entwicklung der erweiterten Blastozystenstadium ergänzt.
Immunosurgery-basierte Isolierung der inneren Zellmasse
Zubereitung:
- Bereiten Platten für die Entfernung der Zona pellucida und immunosurgery (siehe unten) durch die Einrichtung Tropfen jeder Lösung in 10cm-Platten. Overlay mit Mineralöl, um Verdunstung zu verhindern. Bereiten Sie eine einzelne Zeile pro Embryo für die Ableitung bestimmt.
- EmbryoMax Saure Tyrodes, verwenden Sie wie es ist.
- hES-Zell-Ableitung Medien: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum Replacement, 10% Plasmanate, 2,5% ES-Zellen getestet fötales Rinderserum (FBS), 2mM Glutamax-I, 1% nicht-essentiellen Aminosäuren, 50 Einheiten / ml Penicillin, 50μg/ml Streptomycin, 0,055 b-Mercaptoethanol, 5ng/ml bFGF.
- Kaninchen Anti-Human-roten Blutkörperchen primärer Antikörper, rekonstituiert nach Herstellerangaben Vorschlag, bei 1:10 mit hES-Zell-Ableitung Medien verdünnt.
- Meerschweinchen-Komplement-Serum, rekonstituiert nach Herstellerangaben Vorschlag, bei 1:10 mit hES-Zell-Ableitung Medien verdünnt.
- Äquilibrieren alle Platten bis 37 ° C in Gewebekultur-Inkubator vor dem Gebrauch.
- Ziehen Sie 50 ul-100 &mgr; Kapillarpipetten (VWR) für den Einsatz bei der Übertragung von Embryonen. Cut endet mit Diamant-Stift und den Einsatz mit dem Mund pipettieren Schlauch mit einem 0,2 um-Filter ausgestattet.
Immunosurgery Vorgehen:
Notes:
- In diesem Verfahren werden die Zellen des Trophektoderm durch kurze Exposition gegenüber Antikörpern gegen menschliche Zellen in Tandem mit Komplement-Aktivität gerichtet zerstört. Deshalb arbeitet Protokoll am besten mit qualitativ hochwertigen Embryonen mit intakter Trophektoderm, da nur die strukturelle Integrität der Blastozyste verhindert, dass die ICM aus auch anfällig für die immunologische Reaktion.
- Alle Verfahren unter Verwendung einer Dissektion Umfang mit beheizten Bühne ausgestattet.
Steps:
- Mund ausspülen Pipette für Embryotransfer mit FBS Embryonen aus Zusammenkleben zu verhindern verwendet werden.
- Transfer von Blastozysten Kulturschale zu hES hält Tropfen AT Gericht.
- Begin Verfahren durch die Übertragung von Blastozysten aus hES Tropfen durch Serie von AT Tropfen. In dritter Tropfen, für die Auflösung der Zona pellucida (in der Regel 5-30 Sekunden) zu beobachten. Achten Sie darauf, nicht zu stark zu behandeln oder Embryo Integrität beeinträchtigt werden kann.
- Transfer Blastozyste durch Reihe von hES-Zell-Ableitung Medien fallen auf abspülen AT. Preloading Pipette mit Medien wird empfohlen, sofort AT Reaktion zu neutralisieren. Blastozysten können hier abgehalten werden, bis alle AT-verarbeitet wurden.
- Transfer Blastozyste durch Reihe von Primär-Antikörper sinkt, so dass in dritter Tropfen für 30 Minuten Inkubation bei 37 ° C in einer Gewebekultur-Inkubator.
- Transfer Blastozyste durch Reihe von hES-Zell-Ableitung Medien fallen auf abspülen primär.
- Transfer Blastozyste durch Serien von Komplement Tropfen, so dass im dritten Drop für die Lyse von Trophektoderm Zellen zu beobachten. Beachten Sie Blastozyste für die ersten 30 Sekunden auf der Bühne für "sprudelnden" von Trophektoderm Zellen, wie sie zu lysieren. Wenn Lyse innerhalb dieses Zeitrahmens zu beobachten ist, halten Gericht über Mikroskoptisch, um die Reaktion bis zur Fertigstellung zu überwachen. Wenn keine Blasenbildung während der ersten 30 Sekunden beobachtet wird, um Inkubator zurück, Überprüfung alle 5 Minuten, bis die meisten der Trophektoderm hat lysiert. Dies kann 5-15 Minuten. Monitor-Reaktion eng mit Reaktionszeit und mögliche Schäden an der inneren Zellmasse zu minimieren.
- Transfer Blastozyste durch Reihe von hES-Zell-Ableitung Medien fallen auf abwaschen Komplement-Aktivität.
- Mit Glaspipette mit einem Durchmesser, der geringfügig kleiner als der Blastozyste (gezogen von 10 &mgr; l VWR Kapillaren) ist, zeichnen sich die Blastozyste nach oben und unten abzustreifen meisten der lysierten Trophektoderm.
g "alt =" 574_Figure-0 "width =" 577 "height =" 270 "/> - Platte ICM isolieren auf Feeder-Zellen mitotisch inaktivierten Maus-Embryo-Fibroblasten (MEFs). MEFs sollte der Tag vor der Ableitung vorbereitet werden und wechselte zu hES-Zell-Ableitung Medien Tag. 4-und NUNC Gerichte eignen sich gut für erste Schritte der Ableitung.
- Bitte nicht stören Platte für die ersten 1-2 Tage. Danach täglich überprüfen Auswuchs der embryonalen Stammzellen Kolonien (in der Regel, welche innerhalb von 1-2 Wochen). Die Medien sollten in der Hälfte Bände geändert werden jeden zweiten Tag zu Beginn am Tag 3.
ES-Zell-Auswuchs und Passagierung
Wenn der hES-Zell-Auswuchs hat ca. 0,5 mm oder mehr erreicht, ist es bereit für die Expansion durch mechanische Kommissionierung.
- Mechanisch verteilen die Hälfte der Auswuchs und Übertragung auf neue Platten mit frischen Feeder. Embryonale Stammzellen Zellklumpen sollte etwa 30-50 Zellen jeder werden. Lassen Sie andere Hälfte der Auswuchs als Back-up für den ersten Durchgang (p1). Der Auswuchs (p0) können aus verschiedenen Zeiten abgeholt werden, da es sich weiterhin ausbreitet.
- Sekundäre Kolonien können in ähnlicher Weise verteilt werden und erweitert in größere Kulturschalen bis Passagen 3-5, zu welchem Zeitpunkt die neuen Zelllinien enzymatische Passagieren mit Trypsin angepasst werden kann. Das Serum-Gehalt der Kulturmedien sollte auch schrittweise auf 1% und 0% werden in diesen ersten Passagen reduziert, um ES-Zell-Differenzierung zu minimieren.
- Alle etablierten embryonalen Stammzelllinien sollte durch Einfrieren unten einen Teil der frühen Passagen für zukünftige Erweiterungen angeschüttet werden.
- Darüber hinaus sollte jeder Zelllinie von Karyotyp-Analyse charakterisiert und validiert werden, indem Pluripotenz und Differenzierung in vitro und in vivo.
Discussion
Das Protokoll hier vorgestellten bietet den Forschern eine prägnante, leicht zu folgen Überblick darüber, wie die Ableitung humanen embryonalen Stammzelllinien durch immunosurgical Isolierung der inneren Zellmasse.
Acknowledgments
AEC ist ein Fellow des Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research und den Merck Research Laboratories. Wir danken D. Egli und C. Cowan für experimentelle Beratung und Diskussion.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global medium | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| ES cell-tested fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Recombinant human basic fibroblast growth factor | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| Rabbit anti-human red blood cell primary antibody | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Guinea-pig complement serum | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes | VWR international | ||
| Mouth pipettes with tubing | VWR international | supplied with capillary pipettes from VWR | |
| 0.2 microm Acrodisc syringe filter | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tissue culture dishes | VWR international | ||
| Tissue culture dishes | Nalge Nunc international | ||
| Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (E12.5) |
References
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
