Summary
Способность эмбриональных стволовых клеток человека самостоятельно обновлять и дифференцироваться во все типы клеток тела показывает, что они открывают огромные перспективы для обоих медицинских приложений и в качестве инструмента исследования для решения фундаментальных вопросов в развитии и болезней. Здесь мы предлагаем краткий, шаг за шагом протокол для вывода человеческих эмбриональных стволовых клеток из эмбрионов на immunosurgical изоляции внутренней клеточной массы.
Abstract
Способность эмбриональных стволовых клеток человека самостоятельно обновлять и дифференцироваться во все типы клеток тела показывает, что они открывают огромные перспективы для обоих медицинских приложений и в качестве инструмента исследования для решения фундаментальных вопросов в развитии и болезней. Здесь мы предлагаем краткий, шаг за шагом протокол для вывода человеческих эмбриональных стволовых клеток из эмбрионов на immunosurgical изоляции внутренней клеточной массы.
Protocol
Замороженные эмбрионы человека для человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) ячейка вывода были переданы для исследования следующих надлежащего информированного согласия при исследованиях протоколов, которые были рассмотрены и одобрены обеими комитета по использованию человеческих предметов и эмбриональных стволовых клеток комитет по надзору в Гарвардском университете .
Письменный протокол ниже, основывается на опубликованных параметров сообщает Коуэн и соавт. 2004 года, с небольшими изменениями.
Эмбрион культуры
Оттепель человеческих эмбрионов использованием преимуществ Куинна Kit оттепели и культуры в каплях глобальной среде с 15% до Plasmanate развития расширил стадии бластоцисты.
Применение специфических иммунных сывороток в хирургии изоляции на основе из внутренней клеточной массы
Способ приготовления:
- Подготовка пластин для снятия зона pellucida и применение специфических иммунных сывороток в хирургии (см. ниже) путем создания капель каждого раствора в 10 см плит. Наложение с минеральным маслом, чтобы предотвратить испарение. Подготовка одной строке для каждого эмбриона предназначен для вывода.
- EmbryoMax Кислотные Tyrodes, используйте как есть.
- ЭСК ячейка вывода средств массовой информации: 75% КО-DMEM, 10% КО-сыворотка замены, 10% Plasmanate, 2,5% ЭСК проверенные эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 2 мМ Glutamax-I, 1% без незаменимых аминокислот, 50 единиц / мл пенициллина, стрептомицина 50μg/ml, 0,055 мм б-меркаптоэтанол, 5ng/ml bFGF.
- Кролик анти-человеческий красных кровяных клеток первичного антитела, восстановленная в соответствии с предложением производителя, разбавленных в 1:10 со средствами массовой информации ЭСК ячейки вывода.
- Морских свинок дополнением сыворотки, восстановленного в соответствии с предложением производителя, разбавленных в 1:10 со средствами массовой информации ЭСК ячейки вывода.
- Уравновешивать все пластины до 37 ° С в культуре ткани инкубатор перед использованием.
- Вытяните 50 мкл-100 мкл капиллярной пипетки (VWR) для использования в передаче эмбрионов. Отрежьте концы с алмазным пером и использования в рот трубку пипетки оснащен 0,2 мкм фильтр.
Применение специфических иммунных сывороток в хирургии процедуры:
Примечания:
- В этой процедуре клетки трофэктодермы разрушаются кратковременное воздействие антител, направленных против человеческих клеток в сочетании с дополнением деятельности. Таким образом, протокол работает лучше всего с высоким качеством эмбрионов с интактной трофэктодермы, так как только структурную целостность бластоцисты предотвращает от ICM также восприимчивы к иммунологической реакции.
- Все процедуры осуществляется с помощью вскрытия рамки оснащены подогревом стадии.
Шаги:
- Прополоскать рот пипеткой, которые будут использоваться для переноса эмбриона с ФБС, чтобы предотвратить эмбрионов придерживаться.
- Передача бластоцисты из культуры блюдо ЭСК холдинга капли AT блюдо.
- Начните процедуру передачи бластоцисты из ЭСК перепад серии AT капель. В третьем раскрывающемся, следите за роспуск зона pellucida (обычно 5-30 секунд). Будьте осторожны, чтобы не чрезмерно лечения или эмбриона целостность может быть нарушена.
- Трансфер бластоциста через ряд средств массовой информации ЭСК ячейка вывода капель чтобы смыть AT. Предварительная загрузка пипетки со средствами массовой информации рекомендуется сразу же нейтрализовать AT реакции. Бластоцисты могут быть проведены здесь, пока все было AT-обработке.
- Трансфер бластоциста через ряд первичных капель антитела, оставляя в третьем раскрывающемся в течение 30 минут инкубации при температуре 37 ° С в культуре ткани инкубатора.
- Трансфер бластоциста через ряд средств массовой информации ЭСК ячейка вывода капель чтобы смыть первичной.
- Трансфер бластоциста через серию дополнять каплями, оставляя в третьем раскрывающемся следить за лизис трофэктодермы клеток. Соблюдайте бластоцисты в течение первых 30 секунд на сцене "восходящей" из трофэктодермы клетки, как они лизировать. Если лизис наблюдается в течение этого времени, держать блюдо на столике микроскопа для контроля реакции до его завершения. Если нет восходящей наблюдается в течение первых 30 секунд, вернитесь в инкубаторе, проверяя каждые 5 минут, пока большая часть трофэктодермы имеет разрушается. Это может занять 5-15 минут. Монитор реакции тесно свести к минимуму время реакции и возможность повреждения внутренней клеточной массы.
- Трансфер бластоциста через ряд средств массовой информации ЭСК ячейка вывода капли, чтобы смыть дополнять деятельность.
- Использование стеклянной пипетки с диаметром, немного меньше, чем бластоцисты (вытащил из 10 мкл VWR капилляров), рисовать бластоцисты вверх и вниз по полосе от большинства лизировали трофэктодермы.
г "ALT =" 574_Figure-0 "ширина =" 577 "высота =" 270 "/> - Пластина ICM изолировать на фидерных клеток митотически инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs). MEFs должна быть подготовлена за день до этого вывода и переключился на ЭСК ячейка вывода средств массовой информации день. 4-а Nunc блюда хорошо работать для начальных этапов вывода.
- Не беспокоить пластина для первых 1-2 дней. После этого ежедневно проверять на вырост эмбриональных стволовых клеток колоний (как правило, очевидны в течение 1-2 недель). СМИ должны быть изменены в два раза объемы любой другой день, в начале 3-й день.
ES вырост клетки и пассажи
Когда результат ЭСК клетка достигла приблизительно 0,5 мм или более, он готов к расширению механические сбора.
- Механически разгона половине нарост и перехода на новые чашки, содержащие свежие фидеров. Эмбриональные стволовые клетки сгустки должна быть примерно 30-50 клетки каждый. Оставьте другой половине нарост как резервный для первого прохода (P1). Нарост (р0) можно выбрать из несколько раз, поскольку она продолжает расширяться.
- Вторичные колонии Аналогично могут быть рассеяны и расширен по большей блюда культуры до места 3-5 года, когда новые клеточные линии могут быть адаптированы к ферментативной пассажей с трипсином. Сыворотке содержание питательных сред также должны быть постепенно уменьшена до 1% и 0% в течение этих первых мест, чтобы минимизировать дифференциации ЭС клетки.
- Все установленные линий эмбриональных стволовых клеток должны быть накренился путем замораживания вниз часть ранних проходы для будущего расширения.
- Кроме того, каждой клеточной линии должны характеризоваться кариотип анализа и подтверждены плюрипотентности и дифференциации исследования в пробирке и в естественных условиях.
Discussion
Протокол, представленные здесь предоставляет исследователям краткой, простой в последующей схема того, как вывести человека линий эмбриональных стволовых клеток путем immunosurgical изоляции внутренней клеточной массы.
Acknowledgments
AEC является членом Джейн Гроб Чайлдс Мемориального фонда медицинских исследований и Merck Research Laboratories. Мы благодарим Д. Эгли и К. Коуэн для экспериментальных советы и обсуждения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quinn’s Advantage Thaw Kit | Sage | ART-8016 | |
| Global medium | Life Global | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| KO-Serum Replacement | Invitrogen | 10828-028 | |
| ES cell-tested fetal bovine serum, Defined | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Recombinant human basic fibroblast growth factor | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-mercapt–thanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| Rabbit anti-human red blood cell primary antibody | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Guinea-pig complement serum | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Capillary pipettes in 10 microL, 50 microL, 100 microL sizes | VWR international | ||
| Mouth pipettes with tubing | VWR international | supplied with capillary pipettes from VWR | |
| 0.2 microm Acrodisc syringe filter | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Tissue culture dishes | VWR international | ||
| Tissue culture dishes | Nalge Nunc international | ||
| Nikon SMZ1500 dissection scope equipped with Nikon Tokai Hit ThermoPlate warming stage | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (E12.5) |
References
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
