Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama

Published: August 3, 2018 doi: 10.3791/57509
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2
1Department of Pediatrics, Division of Hematology and Oncology, Washington University School of Medicine, 2Center for Genome Sciences and Systems Biology, Washington University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Yeni nesil sıralama (NGS) platformu (~0.5–2.0%) yüksek hata oranı tarafından sınırlı genomik karakterizasyonu için güçlü bir araçtır. NGS hata oranı önlemek ve mutasyonlar varyant alleli kesirler 0,0001 nadir, tespit etmemize izin bizim hata düzeltilmiş sıralama yöntemleri açıklanmaktadır.

Abstract

Geleneksel yeni nesil sıralama teknikleri (NGS) için bir on yıl içinde muazzam genomik karakterizasyonu için izin vermiş. Özellikle, NGS klonal mutasyonlar spektrum malignite çözümlemek için kullanılan. Yine de çok daha verimli geleneksel Sanger yöntemleri, nadir klonal ve subclonal mutasyonlarının ~0.5–2.0 oranında onun yüksek hata nedeniyle belirlenmesi ile NGS mücadele daha. Böylece, standart NGS algılaması olan mutasyonlar için bir sınırı vardır > 0,02 varyant alleli kesir (VAF). Bilinen hastalık belirsizdir olmadan artık hastalık olduğunda mutasyonlar bu hastalarda nadir için klinik önemi ise lösemi için tedavi edilen hastaların önemli ölçüde sonuçlar iyileştirilmiştir < 0,0001 akış sitometresi tarafından. NGS artefactual bu arka plan azaltmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Burada hata düzeltilmiş DNA ve RNA sıralama (hata düzeltme için 16 bp rasgele dizindeki ve çoğullama için 8 bp hastaya özgü dizin ile bireysel moleküllerin etiketleme içerir ECS), için bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim Yöntem algılamak ve varyant alleli kesirler (VAFs) iki büyüklük NGS algılama sınırı daha düşük ve 0.0001 VAF gibi nadir, klonal mutasyonlar izlemek.

Introduction

Biz yaş, mutajen ve somatik aberasyonları genom ve bu birikimi sonucunda hücre bölünmesi sırasında Stokastik hataları maruz altında yatan malign transformasyon, temel patogenezinde nöro-gelişimsel hastalıkları, pediyatrik bozuklukları ve normal yaşlanma1,2. Somatik mutasyon hastalık sürüş potansiyeli olan erken teşhis ve risk yönetimi3,4,5önemli tanılama ve prognostik biyolojik vardır. Fizyolojik clonogenesis daha iyi anlamak için hangi klinik bilgilendirmek ve kararları, doğru miktar ve bu mutasyonlar karakterizasyonu araştırma birincil önem taşımaktadır. Yeni nesil sıralama (NGS) Şu anda türdeş olmayan DNA örnekleri klonal mutasyonların incelemek için kullanılır; Ancak, NGS mutasyonlar, belirlenmesi için sınırlıdır > 0,02 varyant alleli kesir (VAF) — nedeniyle 0.5-2.0 içsel hata oranını % sıralama platformları6,7,8. Sonuç olarak, takip eden ve prognostically önemli somatik değişik alt VAF adlı standart NGS kullanarak elde edilemez.

Son zamanlarda, hata oranı NGS8,9,10,11aşmak için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemleri kullanmak moleküler etiketleme, hata düzeltme sonra sıralama sağlar. Her molekül veya sıralama kitaplığı'genomik parça ile bir rasgele benzersiz moleküler tanımlayıcı (Bu molekül özgü UMI) etiketlenir. UMIs bir dizi randomize nükleotit (8-16 H) permütasyon tarafından inşa edilir. İkinci bir örnek özgü barkod Ayrıca birden fazla örnekleri çalıştırmak aynı NGS sıralama içine çoğullama sağlar iş akışı içine entegre edilmiştir. PCR güçlendirme tatlı öğesini Kütüphane üzerinde gerçekleştirilir ve daha sonra kütüphane sıralama için gönderilir. Kütüphane hazırlık sırasında bu hata rastgele genomik parçası PCR güçlendirme ve sıralama8sırasında tanıtılacaktır bekleniyor. Rasgele sıralama hatalarını kaldırmak için ham sıralama okuma UMI göre gruplandırılır. Sıralama yapılardan ise gerçek bir değişken sadakatle güçlendirilmiş ve aynı UMI paylaşan tüm okur sıralı konumunda aynı genomik Stokastik olması nedeniyle giriş, aynı UMI ile tüm okuma bulunması beklenen değil. Eserleri kaldırıldı bioinformatically vardır. Burada, biz üç yöntem, hata düzeltilmiş sıralama (Laboratuvar tek nükleotid türevleri (SNVs) ve küçük ekleme-silme (Indels) tanımlamak DNA ve RNA gen ifade aşağıdaki miktar kolaylaştırmak en iyi duruma getirilmiş ECS) tarif NGS hata eşiği.

İlk yöntem nadir somatik olay araştırmacılar tarafından tasarlanmış gen belirli primerler kullanılarak aramak için bir yol anlatılmaktadır. Kütüphane hazırlık önce araştırmacılar faiz parçaları hedeflemek için astar tasarlamalısınız. Biz web-app Primer3 kullanılan (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). UMIs dahil edilmiştir bir kez bunlar olacak gibi Amplicons 200-250 BP polimeraz zincir tepkimesi (PCR) için ideal, eşleştirilmiş uç okuma 150 bp eşleştirilmiş uç okuma ile örtüşen oluşturmak. Kullanılacak en uygun astar tasarım koşullar: en az astar boyutu = 19; En uygun astar boyutu = 25; Maksimum astar boyutu = 30; En az Tm = 64 ° C; Optimum Tm = 70 ° C; Maksimum Tm = 74 ° C; En fazla Tm farkı = 5 ° C; En az GC içerik = 45; Maksimum GC oranı = 80; Dönmek için sayı = 20; En fazla 3' sonunda istikrar = 100.

Yöntem 2'de, Illumina Kimya klonal SNVs ve küçük Indels gibi amplicons yüzlerce içerir ticari olarak mevcut Gen panellerini kullanarak 0.0001 VAF nadir için anket için ECS-DNA Protokolü birleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Biz TruSight Myeloid sıralama paneli (Illumina) bizim deneme için kullanılan ve genişletilmiş bir masası çocuk miyeloid hastalıkları için ilgi ek genler dahil etmek için tasarlanmış. Bu paneller biz bu paneller için bağdaştırıcı stratejimiz ekledik böylece hata düzeltme, kolaylaştırmak moleküler benzersiz tanımlayıcıları (UMIs) teklif değil. ECS-meli iş herhangi bir farklı hastalıklar ile ilişkili genler için zenginleştirmek için tasarlanmış diğer paneller ile eşit derecede iyi. DNA izolasyon ve sonraki miktar doku veya örnek ilgi önerilir en az 500 için ng stok numune DNA. Biz düzenli olarak 250 kullanarak bir tek sıralama kitaplığı yapmak için mümkün olduğunca çok benzersiz genomik parçası olarak aşağı yakalamak için DNA'ın ng okur de-çoğaltma ve VAF hesaplama. Bir isteğe bağlı çoğaltma sıralama kitaplığı kalan 250 ile yapılan DNA'ın ng. Biz her zaman örnek başına iki Çoğalt kitaplık yapmak ve biz bağımsız olarak her iki çoğaltır gerçek pozitif olarak tespit olayları düşünün. Ayrıca değişken4,13arama doğruluğunu artırmak için genomik pozisyon özgü binom hata modeli uygulanır.

Son olarak, biz kapalı QIAseq hedef RNA panelleri (QIAGEN) kullanarak transkript miktar için RNA sıralama için ECS kaplin bir yöntem açıklanmaktadır. UMIs de-çoğaltma için gerekli ve hata düzeltme kitleri dahil ve araştırmacılar kitaplıkları üreticinin önerilerini takip yapabilirsiniz. Bioinformatically, araştırmacılar Protokolü bölümünde ayrıntılı olarak açıklanacaktır ECS-DNA için özetlenen boru hattı takip edebilirsiniz.

Protocol

1. hedef DNA için sıralama hatası düzeltildi

  1. PCR güçlendirme, ilgi genomik parçacıkları.
    1. Amplicons (Malzeme tablo, madde 1) yükseltmek için bir yüksek-sadakat DNA polimeraz kullanın. PCR reaksiyon termal cycler aşağıdaki koşullarda ile yükseltmek: 30 s 98 ° c; 18-40 döngüleri 10 98 ° c, 30 s s 66 ° c ile 30 s 72 ° c; 2 dk 72 ° c; 4 ° C'de tutun
    2. PCR ürünleri paramagnetic boncuk (Malzemeler tablo, madde 2) ile arındırmak. Boncuk PCR reaksiyon bir 1: 1.8 oranı ekleyin (PCR reaksiyon birim: boncuk birim) üreticinin protokolüne göre. GKD2O. 20 µL ile elute
    3. DNA (Malzemeler tablo, madde 3) DNA'ın son konsantrasyonu belirlemek için konsantrasyon ölçmek.
    4. DNA'ın bir aliquot amplicons boyutunu onaylamak için bir % 2 özel jel (Malzemeler tablo, madde 4) çalıştırın.
      Not: Alternatif olarak, araştırmacılar güçlendirilmiş genomik parçaları boyutunu yanı sıra ürünlerin konsantrasyonu belirlemek için PCR ürünleri Bioanalyzer analizi yapmak için devre dışı bırakabilirsiniz.
  2. Bağdaştırıcı tavlama sıralama
    1. İ7 bağdaştırıcıları (Malzemeler tablo, Madde 5) edinin. Onlar için sonraki adımlar verilmiştir olarak kullanmak.
    2. Satın 16N i5 bağdaştırıcılarla ticari olarak aşağıdaki oligo sıralama (malzemeler tablo madde 6): AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC(N1:25252525)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1)(N1) (N1) ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
      Not: Eski yerine koymak 16N i5 bağdaştırıcıları standart i5 bağdaştırıcıları ve onlar ECS kolaylaştırmak için bir dizi 16 rastgele nükleotit bağdaştırıcılarıdır.
    3. 16N i5 bağdaştırıcısı çalışma çözüm olun: 100 µM 16N i5 bağdaştırıcısı stokunun 40 µL, 10 µL TE arabelleği ve 500 µM NaCl çözüm 10 µL.
    4. Aliquot 7.5 µL ayrı PCR kuyu içine adım 1.2.3 hazırlanan i5 çalışma çözüm.
    5. Örnek özgü i7 bağdaştırıcısının 5 µL karşılık gelen kuyu ekleyin.
    6. 95 ° c 5 min için kuluçkaya sonra her 30 1 ° C tarafından serin s 4 ° c termal cycler içinde.
    7. 4 ° C'de tutun
  3. Sonunda tamir & dA-takip kütüphanelerin
    Not: bağdaştırıcı tavlama ile paralel olarak bir son onarım ve dA-takip PCR amplicons adım 1.1 üzerinden gerçekleştirebilirsiniz. Bu adımların tamamlanmasını takiben, tavlanmış adım 1.2 üstüne belgili tanımlık son tamir ve PCR amplicons dA kuyruklu bağdaştırıcılarının tüp ligasyonu gerçekleştirilir. Bağdaştırıcı ligasyonu ECS Kütüphane inşaat tamamlanır.
    1. Begin ile en az 1 µg DNA başlayan (en az ~ 200 ng)
    2. Son onarım ve dA-kuyruk amplicons (Malzeme tablo, Madde 7) gerçekleştirin.
      1. Son hazırlık enzim Mix 3.0 µL ve son onarım arabelleği 6.5 µL ekleyin.
      2. Karıştırmak için 65 ° C'de 30 dk sonra için 20 ° C'de 30 dk kuluçkaya ve 4 ° C'de tutun
    3. Tüp ligasyonu tavlanmış bağdaştırıcılarında (Malzemeler tablo, madde 8) gerçekleştirin.
      1. Tavlanmış bağdaştırıcılarının 2.5 µL adım 2, Blunt/TA ligaz Mastermix 15 µL ve ligasyonu artırıcı 1 µL ekleyin.
      2. Karıştırmak sonra 37 ° C'de 15 dakika için 20 ° C'de 15 dakika için kuluçkaya
    4. Manyetik boncuklar (malzemeler tablo madde 2) kitaplıklarıyla kadar temiz: boncuk PCR reaksiyon bir tarihinde 1: 0,75 oranı ekleyin (PCR reaksiyon birim: manyetik boncuk birimi):
      1. Manyetik boncuk Çözüm 62.6 µL PCR ürünlerinin adım 1.2.7 83,5 µL içine pipet.
      2. Karışımı bir 1,5 mL düşük bağlama tüp aktarın.
      3. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın.
      4. Karışımı oda sıcaklığında 5 dakika standı bırakın.
      5. Tüp bir manyetik tutucu üzerine yerleştirin. 2 dakika oda sıcaklığında veya süpernatant kadar kuluçkaya açıktır.
      6. Süpernatant kaldırın.
      7. Boncuk 200 µL % 70 etanol ile yıkayın.
      8. 30 s. Kaldır etanol için kuluçkaya.
      9. Etanol yıkama bir kez adımları yineleyin.
      10. Boncuk kuruması.
      11. GKD2O. 20 µL ile elute
        Not: Bu değişiklik PCR reaksiyon manyetik boncuk oranı tercihen 200 daha küçük olan DNA parçalarının kaldıracak bp.
  4. Miktar tarafından damlacık dijital PCR
    Not: Sequencer yüklenen her kitaplık moleküllerinin sayısı sıkı riayet kesin mutasyon miktar gerektirir. Bunu başarmak için birim hacim başına bireysel kitaplıkları için molekülleri sayısı miktarının QX200 damlacık dijital PCR (ddPCR) platform kullanılarak yapılır — kantitatif PCR alternatif bir seçenektir. DdPCR analizi, okuma molekülleri µL Kütüphane başına başına sayısını belirtir.
    1. ECS Kütüphaneler 1:1,000 artımlı olarak 10 PCR şerit-tüpler bir faktörle sulandrarak sulandırmak.
    2. DdPCR 1.5 mL tüp içinde aşağıdaki mastermix hazırlamak: 10 µL PCR karışımı (Malzemeler tablo, madde 9), P5 astar, P7 astar, adım 1.4.1 ECS temizlenmiş ürünün 5 µL 0.2 µL 0.2 µL. ve 4,5 µL GKD2O.
    3. İçine de 8 katları olduğundan emin yapma her örnek mastermix aliquot 20 µL.
      1. Aliquot 70 µL damlacık üretimi petrol (Malzemeler tablo, madde 10) her petrol kuyusu içine. Bir lastik conta ile kaset kapağı.
    4. Damlacık jeneratör (Malzemeler tablo, madde 11) kullanarak damlacıkları olun.
    5. Bir çok kanallı pipet ile örnek pipetting yavaş yavaş DNA kesme önlemek için 5 saniye bir span üzerinden bir PCR plaka sağlanması içine adım yapılır 1.4.4 generated damlacıkları yüklenmesi.
    6. Aşağıdaki koşullar kullanarak bir termal cycler 40 döngüleri için damlacıkları sinyal yükseltmek: 5 min 95 ° c; 30 40 döngüleri s 95 ° c, 1 dk. 63 ° c; 5 dk 4 ° c, 5 min 90 ° c; ve sonra 4 ° C'de basılı tutun
    7. DdPCR şablon damlacık okuyucu makine (Malzemeler tablo, madde 11) hazırlayın. Parametreler için belirtim Mutlak miktar ve kullanmak için emin olmak QX200 ddPCR Eva yeşil Supermix.
    8. DdPCR analiz işlemi tamamlandıktan sonra tüm örnekler üzerindeki aynı bölücü eşik ayarlamak emin olun.
    9. Konsantrasyon okuma QX200 damlacık okuyucudan aliquot moleküller için istediğiniz sayıyı içine sonraki adım tanıtmak için uygun birim kullanarak.
  5. Sıralama için kütüphanelerin PCR güçlendirme
    1. Aşağıdaki mastermix moleküller için istediğiniz sayıda adım 1.4.9 hazırlamak: Q5 Mastermix (Malzemeler tablo, madde 1), P5 astar 2.5 µL 25 µL (10 µM), 2,5 µL P7 astar (10 µM), DNA, 20-X µL GKD2O. X µL
    2. Aşağıdaki koşullar kullanarak bir termal cycler 1.5.1 adımda kitaplıklardan yükseltmek: 30 s 98 ° c; 10 20 döngüleri 98 ° c, 30 s s 63 ° c, 30 s 72 ° c; 2 dk 72 ° c; ve sonra 4 ° C'de basılı tutun
    3. Manyetik boncuklar (malzemeler tablo, madde 2) kitaplıklarıyla kadar temiz: PCR reaksiyon manyetik boncuklar değiştirilmiş bir 1: 0,75 oranı ekleyin (PCR reaksiyon birim: manyetik boncuk birim).
      1. 1.5.2. adımdaki 50 µL PCR ürünlerde manyetik boncuk çözüm 37,5 µL pipet.
      2. Karışımı bir 1,5 mL düşük bağlama tüp aktarın.
      3. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın.
      4. Karışımı oda sıcaklığında 5 min için standı bırakın.
      5. Tüp bir manyetik tutucu üzerine yerleştirin. 2 dakika oda sıcaklığında veya süpernatant kadar kuluçkaya açıktır.
      6. Süpernatant kaldırın.
      7. Boncuk 200 µL % 70 etanol ile yıkayın.
      8. 30 s. Kaldır etanol için kuluçkaya.
      9. Etanol yıkama bir kez adımları yineleyin.
      10. Boncuk kuruması.
      11. GKD2O. 20 µL ile elute
    4. DNA'ın bir aliquot amplicons boyutunu onaylamak için % 2 özel jel üzerinde çalıştırın.
    5. DNA (Malzemeler tablo, madde 3) ayrı ECS kütüphanelerin konsantrasyonu belirlemek için konsantrasyon ölçmek.
    6. Ekimolar tutarları kitaplıklarda havuz.
      Not: Örneğin, sekiz kitaplıklarıyla 4 milyon molekülleri ilâ 400 milyon okuma verir bir sıralama platformu kullanarak sıralama için başlayan bir ekimolar grup4 araştırmacılar havuz. Konservatif, bu hata düzeltme molekülleri başına ortalama on ham okuma kullanmak için tavsiye edilir. Bu 360 milyon okuyor alacağını (4 milyon molekülleri * 8 kitaplıkları * 10 okur hata düzeltme için). Kütüphane başına 4 milyon benzersiz molekülleri ile araştırmacılar bir teorik kötü fikir birliği 7042 x amplicon (4 milyon/568 amplicons gen panelinden) başına kapsama okumak almak için bekleyebilirsiniz.
    7. DNA (Malzemeler tablo, madde 3) havuzlu ECS kitaplığının konsantrasyonu belirlemek için konsantrasyon ölçmek.
    8. Havuza alınan ECS kütüphane yaklaşık 4'te göndermek nM.
    9. Illumina sıralama platformlara (MiSeq, HiSeq veya NextSeq) aşağıdaki sıralama ayarları sağlar: 2 x 144 eşleştirilmiş uç okur, 8 döngüleri Dizin 1 ve 16 döngüleri dizin 2.

2. Gene panelleri ile DNA'ın sıralama hatası düzeltildi

  1. Hibridizasyon oligos gen panelleri
    Not: Bu adımda, bir UMIs (Malzeme tablo, madde 17) dahil etmek için değiştirilmiş bir Illumina TruSight veya TruSeq protokolünü kullanarak sıralama kitaplıkları oluşturmak.
    1. Oligos üreticisinin protokol sonrası genomik parçası üzerine melez. Kullanım 250 ng DNA (veya istediğiniz herhangi bir miktarda malzeme başlayan).
    2. İlişkisiz oligos üreticisinin protokol sonrası kaldırın.
    3. Uzantısı-birleştirmesini gerçekleştirmek üreticisinin protokol sonrası.
      Not: Üreticinin iletişim kuralı değişiklikler aşağıda başlar.
  2. İ5 ve i7 bağdaştırıcıları PCR ile birleşme
    1. PCR mastermix uygun birim boyutu bir tüpün içine aşağıdaki reaktifler pipetting tarafından hazırlamak: 37,5 µL Q5 Mastermix (Malzemeler tablo, madde 1), 6 µL i7 bağdaştırıcıları (kullanım farklı i7 6 µL 10 µM 16N i5 bağdaştırıcıları (ayrıntılı olarak açıklandığı Yöntem 1, adım 1.2.2), bağdaştırıcılar çoğullama için ayrı örnekleri için) ve uzatma-ligasyonu çözüm adım 2.1.3 boncuk ile 22 µL.
      Not: Illumina tarafından sağlanan polimeraz mastermix Q5 Mastermix yerini alır. Q5 polimeraz yüksek sadakat ve daha az tanıtıldı hataları ile genomik parçası güçlendirir.
    2. Aşağıdaki parametreleri kullanarak bir termal cycler üzerinde PCR programını çalıştırın: 30 s 98 ° c, 4-6 döngüleri 10 98 ° c, 30 s s 66 ° c, 30 s 72 ° c; 2 dk 72 ° C ve 4 ° C'de sonra tutun
      Not: Devir sayısı panel boyutuna bağlıdır. 500-600 Çift oligos paneliyle PCR 6 döngüleri gerektirir, ancak bizim deneyim, bir 4-döngüsü PCR gen paneli gen belirli oligos, 1500 farklı çift varsa yeterli olur.
    3. PCR reaksiyonları ile manyetik boncuklar (malzemeler tablo, madde 2) kadar temiz: manyetik boncuklar PCR reaksiyon değiştirilmiş bir 1 PCR reaksiyon ekleyin: 0,75 manyetik boncuk oranı:
      1. 75 µL PCR ürünlerinin adım 2.2.2 içine manyetik boncuk çözüm 56.25 µL pipet.
      2. Karışımı bir 1,5 mL düşük bağlama tüp aktarın.
      3. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın.
      4. Karışımı oda sıcaklığında 5 min için standı bırakın.
      5. Tüp bir manyetik tutucu üzerine yerleştirin. 2 dakika oda sıcaklığında veya süpernatant kadar kuluçkaya açıktır.
      6. Süpernatant kaldırın.
      7. Boncuk 200 µL % 70 etanol ile yıkayın.
      8. 30 s. Kaldır etanol için kuluçkaya.
      9. Etanol yıkama bir kez adımları yineleyin.
      10. Boncuk kuruması.
      11. GKD2O. 20 µL ile elute
  3. Kütüphaneler QX200 ddPCR platformu kullanarak ölçmek.
    1. Yöntem 1. adımda 1.4 izleyin.
      Not: 4 milyon molekülleri örnek kütüphane4 temsilcisi sonuç (Şekil 2) başına 7,042 benzersiz olarak dizili molekülleri (4 milyon 568 gene özgü oligos tarafından bölünmüş) teorik ortalaması elde etmek için normalleştirilmiş.
  4. Sıralama için kitaplıklarına normalleştirmek ve yükseltmek.
    1. Aşağıdaki mastermix 50 µL toplam son PCR için kullanarak moleküller için istediğiniz sayıyı yükseltmek: Q5 Mastermix, P5 astar 2 µL 25 µL (1 µM), 2 µL P7 astar (1 µM) ve DNA moleküllerinin 21 µL.
    2. PCR programı aşağıdaki parametresini kullanarak bir termal cycler üzerinde Çalıştır: 30 s 98 ° c; 10 16 döngüleri 98 ° c, 30 s s 66 ° c, 30 s 72 ° c; 2 dk 72 ° c; ve sonra 4 ° C'de basılı tutun
    3. Yukarı temiz manyetik boncuklar (Malzemeler tablo, madde 2) kullanarak sıralama kütüphaneler: PCR reaksiyon manyetik boncuklar için değiştirilmiş bir 1 PCR reaksiyon ekleyin: 0,75 manyetik boncuk oranı:
      1. 2.4.2. adımdaki 50 µL PCR ürünlerde manyetik boncuk çözüm 37,5 µL pipet.
      2. Karışımı bir 1,5 mL düşük bağlama tüp aktarın.
      3. Yukarı ve aşağı en az 10 kez pipetting tarafından iyice karıştırın.
      4. Karışımı oda sıcaklığında 5 min için standı bırakın.
      5. Tüp bir manyetik tutucu üzerine yerleştirin. 2 dakika oda sıcaklığında veya süpernatant kadar kuluçkaya açıktır.
      6. Süpernatant kaldırın.
      7. Boncuk 200 µL % 70 etanol ile yıkayın.
      8. 30 s. Kaldır etanol için kuluçkaya.
      9. Etanol yıkama bir kez adımları yineleyin.
      10. Boncuk kuruması.
      11. GKD2O. 20 µL ile elute
    4. Bir aliquot eluted DNA'ın çalıştırmak (~ 3 µL) amplicons boyutunu onaylamak için % 2 özel jel üzerinde.
    5. DNA (Malzemeler tablo, madde 3) ayrı ECS kütüphanelerin konsantrasyonu belirlemek için konsantrasyon ölçmek.
    6. Ekimolar tutarları kitaplıklarda havuz. 1.5.6 Yöntem 1 adıma bakın. ve ayrıca tartışma havuzu oluşturma hakkında daha fazla bilgi.
    7. Havuza alınan ECS kütüphane yaklaşık 4'te göndermek nM.
    8. Illumina sıralama platformlara (MiSeq, HiSeq veya NextSeq) aşağıdaki sıralama ayarları sağlar: 2 x 144 eşleştirilmiş uç okur, 8 döngüleri Dizin 1 ve 16 döngüleri dizin 2.
  5. ECS Bioinformatic işleme ve analiz
    1. Örnek demultiplexed okuma Sequencer'ı elde etmek veya i7 bağdaştırıcısı dizileri bioinformatically ile özel bir komut dosyası kullanarak farklı örnekleri içine çiğ sıra okur sayısı azaltma gerçekleştirir.
    2. Oligo dizileri gene panelinden kaldırmak için demultiplexed her okuma ilk 30 nükleotit kapalı döşeme.
    3. Okuma aileler oluşturmak için aynı UMIs bir başka paylaşmak okuma hizalayın.
      Not: Araştırmacılar MAGERI13 gibi UMI kullanan yazılımlar okuma aileler ayıklamak için kullanabilirsiniz. Hamming hiçbir mesafe bu deneyde UMI dizisi içinde yöntemi özgüllüğü artırmak için izin verildi.
    4. De-çoğaltma ve hata düzeltme aşağıda önerilen parametreleri kullanarak gerçekleştirin.
      1. Kullanım ≥5 çiftler halinde aynı aile okuyun okuyun. En az üç okuma çift önerilir.
      2. Nükleotit her pozisyonda aynı okuma ailesindeki tüm okuma arasında karşılaştırmak ve en az % 90 bir fikir birliği nükleotit oluşturmak için belirli nükleotit okuma arasında uyumluluk. % 90'ı anlaşma daha az bir varsa N nükleotit pozisyon için ara.
      3. Var fikir birliği okuma atmak > N. çağrıldığını fikir birliği nükleotit sayısı yüzde 10'u
    5. Tüm muhafaza fikir birliği okuma araştırmacı tercih edilen aligner(s) Bowtie2 ve BWA gibi kullanarak yerel olarak hg19 ya da hg38 insan başvuru genom için hizalayın.
    6. İşlem parametrelerini kullanarak Mpileup ile okuma hizalı – BQ0 – d uygun zincirleme kaza çıktı VAF ne olursa olsun emin olmak için kapsama eşikleri kaldırmak için 10,000,000,000,000.
    7. Pozisyonları kapsama okumak az 1000 x fikir birliği ile filtre.
      Not: Araştırmacı her nükleotit pozisyon için asgari sigorta kapsamı keyfi belirler, bu en az 500 x uzlaşma kapsamı aşağı akım analizi için okumak için tavsiye edilir.
    8. Binom dağılımı tek nükleotid türevleri (SNPs) aramak için adım 2.5.7 aşağıdaki parametrelerle tutulan verileri kullanın. Binom hayatinizda genomik pozisyon özgü hata modeli üzerinde temel alır. Genomik her pozisyon bağımsız olarak dışarı hata oranları belirli pozisyon için tüm örneklerin özetleme sonra modellenmiştir. Aşağıdaki örnekte:
      Olasılık nükleotit profilinin belirli bir genomik pozisyonda, p
      ∑ Varyant RF2 ∑ toplam RFs
      26/255505 =
      0.000101759 =
      Binom olasılığı 24 varyantın RFs 35911 toplam RFs, Pdışında (X ≥ x) örnek K
      1 - binomial(24, 35911, 0.000101759) =
      2.26485E =-13
      Not: genomik her pozisyon için sorgulanan olurdu üç olası mutational değişiklikler (Örneğin,A > T, A > C, A > G), ve her biri arka plan yapısı olarak temsil edilir. Bonferroni düzeltme sonra arka plandan farklı somatik olaylar korunur. Tablo 1' de gösterilen örnekte, yapılan testler sayısı 11, dolayısıyla düzeltilmiş bir Bonferroni p-değeri ≤0.00454545 (0,05/11) bir olay olarak istatistiksel olarak önemli aramak için gerekli oldu.
    9. Somatik olayları her iki çoğaltır aynı örnek bulunması için gerekli olan; Aksi takdirde, onları yanlış pozitif görür.

Table 1
Tablo 1: pozisyon özgü binom hata modeli oluşturmak için yol gösteren örnek.

3. hata düzeltilmiş sıralama RNA'ın

  1. Mutasyonlar DNA düzeyinde değerlendirilmesi yanı sıra, ECS nadir veya düşük bereket transkript RNA düzeyinde tespit etmek için çeşitli hedeflenen RNA sıralama panelleri ile entegre. ECS kapalı QIAGEN RNA sıralama panelleri ile birleştirerek, tutanaklar ile normalleştirme temizlik gen karşı gerek olmadan on kopya olarak az gen ifade dijital miktar gösterdi. Hata düzeltme için gerekli UMIs paneline entegre edilmiştir.
    1. Toplam RNA ayıklama (Malzemeler tablo, öğe 20) gerçekleştirin.
    2. ECS-RNA Kütüphane hazırlık üreticisinin Protokolü (Malzemeler tablo, madde 19) göre yerine getirir.
    3. Biyoinformatik boru hattı adım 2.5.1–2.5.6 göre gerçekleştirin. Yöntem 2 önceki bölümde özetlenen. 2.5.6 adımdan sonra gene başına hizalanmış fikir birliği okuma sayısı gen uzunluğu normalleştirme için gerek kalmadan gen ifade düzeyini temsil eder.

Representative Results

Targeted Error-corrected sıralama ile DNA'ın, mutant hasta DNA ticari genomik DNA'sında sulandrarak prensibi deneyi bir kanıtı gerçekleştirdiniz. Hasta bir mutasyon GATA1 vardı (chrX:48650264, C > G) orijinal VAF 0.19 ile. Şekil 1 ' de ECS 1:10,000 tek nükleotid varyant için bir seviye için nicel olduğunu ispat.

Figure 1
Şekil 1: ECS 1:10,000 seviyeye nicel GATA1 SNV gösteren seyreltme dizi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Biz de ECS-DNA güvenilir içinde yetişkin akut miyeloid lösemi (AML) sağlıklı yaşlı bireylerin4yerleştirilmiştir genlerinde klonal mutasyonlar nadir algılar gösterir. Biz 20 sağlıklı bireyler hemşirenin sağlık kabaca ~ 10 yıl arayla banked çalışmada buffy ceket örnekleri aldı. Biz bu örnekler üzerinde ECS-DNA paneli iletişim kuralı uygulanır. Bu deneme için Illumina TruSight Myeloid sıralama 568 amplicons (https://www.illumina.com/products/by-type/clinical-research-products/trusight-myeloid.html gen listesi hakkında daha fazla bilgi) oluşan Panel uyarlanmış ve sıralı 20 bireylerin 80 kitaplıkları (2 koleksiyon farklı zaman noktalarda bağımsız birim zamanda başına 2 çoğaltır işaret ederek) 47,7 milyon eşleştirilmiş uç okuma ortalama ve ortalama 3.4 milyon hata düzeltilmiş oluşturulan Illumina NextSeq platformu kullanarak her kütüphane4için fikir birliği serileri. Kütüphane başına ortalama nükleotit kapsama yaklaşık 6.000 x (3.4 milyon 568 tarafından bölünmüş) yapıldı. Her örnek için bir pozisyon özgü hata profil aynı örnekten olmayan sıralı kitaplıklarını kullanma inşa. En az bir koleksiyon zaman noktası her iki çoğaltır içinde mevcut 109 klonal somatik mutasyon bulduk. Bu mutasyonlar VAF 0,0003-0.1451 değişen var. Biz bilinen kozmik temsilcilikleri ile 21 mutasyonlar seçili ve ddPCR kullanarak bir ya da iki koleksiyon zaman noktalarının tüm 21 mutasyonların doğrulanmış (n = 34, Şekil 2, Genç ve ark. 20164den uyarlanmıştır).

Figure 2
Şekil 2: ECS tarafından tanımlanan mutasyonlar ddPCR ile son derece uyumlu VAFs üzerinden doğrulanmadı. (n = 34, Genç ve ark. 20164modifiye). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

ECS-RNA protokolünü kullanarak hata düzeltilmiş ifade düzeyi ile ilgili çeşitli kanserler (QIAseq insan kanser Transcriptome Masası'ndan uyarlama) ve biz ile ilişkili olduğu bilinen 416 genler oluşur QIAseq kimya kullanarak bir gen panel özelleştirilmiş belirli bir gen ( ek malzeme 1gen listesinde) en sık ifade exon güçlendirilmiş. Biz Kütüphane ortalama 8.3 milyon okur verdi eşleştirilmiş uç biçiminde Illumina MiSeq platformu kullanarak kitaplıkları sıralı ve 0.417 milyon hata düzeltilmiş fikir birliği dizileri ortalama yakalamak başardı. Biz gösterdi ki düşük bereket transkript ifade düzeyini (< 1.000 transkript sayısı 50 ng toplam RNA) çoğaltır arasında son derece tekrarlanabilir (veri noktası n = 300, Şekil 3). DdPCR (ifade değişen ölçüde altı seçili genler) doğrulanması bu genlerin ifade düzeyini doğru şekilde normalleştirme için gerek kalmadan ECS protokolü tarafından ele geçirilen gösterdi.

Figure 3
Şekil 3: Top, transkript korelasyon sayar ECS-RNA tarafından aynı örnek çoğaltır arasında (n = 300). Alt, sayıları ECS tarafından tespit ddPCR tarafından doğrulanmadı transkript (n = 6). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Burada, biz mutasyonlar farklı hastalıklarda düşük VAFs ile çalışmaya kolayca uygulanabilir sıralama hatası düzeltildi protokol paketi olan göstermek. Hata düzeltme, ham okuma seçeneğini etkinleştirin UMIs birleşme sıralama önce her molekül ile en önemli faktör olduğunu. Yöntem tanımlamak burada araştırmacılar için piyasada bulunan gen panelleri ve kendi kendine tasarlanmış gene özgü oligos özelleştirilmiş UMIs dahil etmek izin verir.

Standart NGS protokol nedeniyle sıralama hata oranı % 2'in altında VAF ile mutasyonlar algılanmasını önler ve bu NGS uygulama nadir türevleri algılanması çok önemli nerede çalışmalarda sınırlar. Standart NGS hata oranı engellemeyi tarafından ECS hassas bu ham çeşitleri tespiti sağlar. Örneğin, Bu mutasyonlar ilk (Bu nedenle düşük VAF sahip) ortaya çıkan zaman patojenik mutasyon tespiti hastalığı14,15erken müdahale bilgi vermeleri zorunludur. Lösemi araştırma, çok az kalıntı tespiti hastalığı (rezidüel lösemi hücreleri tedavi sonrası) risk stratifikasyon bilgilendirir ve tedavi seçenekleri ikili akış sitometrik değerlendirmeler cant bir şekilde bilgilendirmek için kullanılabilir. Buna ek olarak, ECS dolaşımdaki tümör nükleik asit algılamaya ve varlığı/olmaması için hem de birincil özellikleridir belirli mutasyonların varyant yük değerlendirmek tarafından solid tümör hastalarda metastatik potansiyeli değerlendirmek için geçerlidir tümör16.

Tablo 1' de gösterildiği gibi türevlerini aramak için konum özgü hata binom dağılımı tabanlı modeli kullanarak güç büyük ölçüde sıralı kitaplıkları sayısı gibi yanı sıra hata model oluşturmak için kullanılan sıralama derinliği bağlıdır. Hata modeli sağlamlık daha yüksek sayıda örnekleri ve daha fazla sıralama derinliği artar. Her örnek için bir hata profili oluşturmak için Ortalama hata düzeltilmiş örnek başına 3000 x okuma kapsamını ile en az 10 sıralı örnekleri kullanmak için tavsiye edilir. Pozisyon özel yaklaşım benzer MAGERI, ancak tüm altı farklı ikame türler için bir toplama hata oranı kullanarak yerine (A > C/T > G, A > G/T > C, A > T/T > A, C > A/G > T, C > G/G > C C > T/G > A)13, her konumda bağımsız olarak her ikame modeli. Örneğin, bir hata oranı c > T belirli bir genomik pozisyonda başka bir konumdan farklı. Gibi bir sıralama vadede gözlenen temel ikame oranı çalıştırmak diğerinden farklı olabilir bizim yaklaşım bir sıralama toplu etkisi de dikkate alır. Bu nedenle özellikle farklı sıralama çalıştırır örnekleri model oluşturmak için havuza zaman her pozisyon için tüm yerine koyma türleri modellemek önemlidir.

Ne zaman bir ECS deney tasarımı önemli bir göz istediğiniz algılama eşik var. NGS çalışmaların onlar kolayca genler/hedefleri açısından faiz, algılama eşiği (sıralama derinliği tarafından dikte) ve sorgulanan sayisi ölçeklendirilebilir güzelliktir. Araştırmacılar 0,0001 bir algılama eşiği ile iki amplicons nadir mutasyonlar bulmak istiyorsanız, örneğin, onlar sonuna kadar 75 örnekleri 15 milyon okuma çıkarır MiSeq V2 Kimya'yı kullanarak çalışacak tek bir sıralama havuz (2 amplicons * 10.000 molekülleri * 10 okur hata düzeltme için * 75 örnekleri 15 milyon sıralama okuma =). Araştırmacılar, sıralama veya algılama eşik ayarlamak için çalıştırmak tek bir sıralama içinde havuza alınan örnek sayısına içine gidip moleküllerin bu sayı değişebilir. Çalışmalarımız, biz 0.0001 VAF (1:10, 000) ile bir algılama eşiği mutasyonlar bulmaya yönelik Illumina gen panelini kullanarak. Biz düzenli olarak 250 kullanmak yeterli molekülleri yukarıda belirtilen algılama eşik ulaşmak için yakalanır emin olmak için DNA başlatma ng. Araştırmacılar daha düşük miktarda DNA ile başlatmak için tercih (50 ng önerilir) istenen algılama sınırı ise > 0,001 VAF.

UMIs i5 dizinler eklenir gibi sıralama ayarları buna göre değiştirilmesi gerekir. Örneğin, 16 N UMIs kullandık ve sıralama ayarlarını 2 x 144 eşleştirilmiş son okuma, Dizin 1 8 döngüleri ve 16 döngüleri dizin 2 dizin 2 her zamanki 8 döngüleri karşı vardı. Dizin 2 döngüsü artış döngüsü okur için ayrılan toplam sayısı bir düşüş eşitlenmektedir. Araştırmacılar 12N UMIs10,17kullanmayı seçerseniz, dizin 2 12 döngüleri ayarlarının değiştirilmesi gerekir.

Bu UMI tabanlı sıralama yöntemi sıralama hatalarını düzeltmek için optimize edilmiştir. Suboptimal PCR jackpotting ile ilgili olan tüm amplifikasyon tabanlı yöntemi için bir sorun olduğunu kalır. Biz sonrası sıralama ve post-Biyoinformatik doğrulama ddPCR kullanarak gerçekleştirilen ve neredeyse herhangi bir yanlış pozitif PCR jackpotting nedeniyle tespit. Bununla birlikte, araştırmacılar düşük amplifikasyon hataları emin olmak için yüksek sadakat polimeraz kullanarak deneyler yapmak önerilir.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Katılımcılar çocuk Onkoloji grubu AAML1531 çalışma ve hemşirelerin sağlık eğitim hasta numuneleri şeklinde katkılarından dolayı teşekkür ediyoruz. Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri (UM1 CA186107, RO1 CA49449 ve RO1 CA149445), çocukların Discovery Enstitüsü Washington Üniversitesi ve St. Louis Çocuk Hastanesi (MC-II-2015-461) ve Eli Seth Matthews Lösemi Vakfı tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 High Fidelity Hot Start Master Mix New England BioLabs M0492S
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63880
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102
Truseq Custom Amplicon Index Kit Illumina FC-130-1003
UMI i5 adapter sequences Integrated DNA Technologies -
NEBNext Ultra End Repair/dA-Tailing Module New England BioLabs E7442S
NEBNext Ultra II Ligation Module New England BioLabs E7595S
QX200 ddPCR EvaGreen Supermix Bio-Rad 1864034
QX200 Droplet Generation Oil for EvaGreen Bio-Rad 1864005
QX200 Droplet Digital PCR System Bio-Rad 1864001
ddPCR 96-Well Plates Bio-Rad 12001925
DG8 Cartridges for QX200/QX100 Droplet Generator Bio-Rad 1864008
DG8 Gaskets for QX200/QX100 Droplet Generator Bio-Rad 1863009
Bioanalyzer Agilent Genomics G2939BA
TapeStation Agilent Genomics G2991AA
TruSight Myeloid Sequencing Panel Illumina FC-130-1010
Bowtie 2 Johns Hopkins University -
Customized QIAseq Targeted RNA Panel Qiagen -
Rneasy Plus Mini Kit (50) Qiagen 74134

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoang, M. L., et al. Genome-wide quantification of rare somatic mutations in normal tissues using massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113, 9846-9851 (2016).
  2. O'Roak, B. J., et al. Sporadic autism exomes reveal a highly interconnected protein network of de novo mutations. Nature. 485, 246-250 (2012).
  3. Young, A. L., et al. Quantifying ultra-rare pre-leukemic clones via targeted error-corrected sequencing. Leukemia. 29 (7), 1608-1611 (2015).
  4. Young, A. L., Challen, G. A., Birmann, B. M., Druley, T. E. Clonal hematopoiesis harbouring AML-associated mutations is ubiquitous in healthy adults. NatureCommunications. 7, 12484 (2016).
  5. Patel, J. P., et al. Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 366, 1079-1089 (2012).
  6. Shendure, J., Ji, H. Next-generation DNA sequencing. Nature Biotechnology. 26 (10), 1135-1145 (2008).
  7. Kohlmann, A., et al. Monitoring of residual disease by next-generation deep-sequencing of RUNX1 mutations can identify acute myeloid leukemia patients with resistant disease. Leukemia. 28, 129-137 (2014).
  8. Luthra, R., et al. Next-generation sequencing-based multigene mutational screening for acute myeloid leukemia using MiSeq: applicability for diagnostics and disease monitoring. Haematologica. 99, 465-473 (2014).
  9. Kinde, I., Wu, J., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (23), 9530-9535 (2011).
  10. Schmitt, M., et al. Detection of ultra-rare mutations by next-generation sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 109 (36), 14508-14513 (2012).
  11. Vander Heiden, J. A., et al. pRESTO: a toolkit for processing high-throughput sequencing raw reads of lymphocyte receptor repertoires. Bioinformatics. 30 (13), 1930-1932 (2014).
  12. Newman, A. M., et al. Integrated digital error suppression for improved detection of circulating tumor DNA. NatureBiotechnology. 34, 547-555 (2016).
  13. Shugay, M., et al. MAGERI: Computational pipeline for molecular-barcoded targeted resequencing. PLOSComputationalBiology. 13 (5), e1005480 (2017).
  14. Wong, T. N., et al. Role of TP53 mutations in the origin and evolution of therapy-related acute myeloid leukaemia. Nature. 518, 552-555 (2014).
  15. Krimmel, J. D., et al. Ultra-deep sequencing detects ovarian cancer cells in peritoneal fluid and reveals somatic TP53 mutations in noncancerous tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 113 (21), 6005-6010 (2016).
  16. Phallen, J., et al. Direct detection of early-stage cancers using circulating tumor DNA. ScienceTranslationalMedicine. 9, eaan2415 (2017).
  17. Egorov, E. S., et al. Quantitative profiling of immune repertoires for minor lymphocyte counts using unique molecular identifiers. The Journal of Immunology. 194 (12), 6155-6163 (2015).

Tags

Genetik sayı 138 nadiren de olsa algılama sıralama hatası düzeltildi biyoinformatik genomik erken teşhis moleküler etiketleme
Nadiren de olsa algılama hatası düzeltildi DNA ve RNA sıralama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wong, W. H., Tong, R. S., Young, A.… More

Wong, W. H., Tong, R. S., Young, A. L., Druley, T. E. Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing. J. Vis. Exp. (138), e57509, doi:10.3791/57509 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter