Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

למדא בחר cII מערכת איתור מוטציה

Published: April 26, 2018 doi: 10.3791/57510
Automatic Translation
1, 1
1Department of Preventive Medicine, USC Keck School of Medicine, University of Southern California

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מפורט את assay מוטציה cII למדא בחר בתאים בתרבית של מכרסמים הטרנסגניים או החיות המקביל שטופלו עם סוכן כימי/פיזי של עניין. גישה זו כבר בשימוש נרחב לניסויים המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים.

Abstract

מספר מודלים בבעלי חיים מהונדס, מערכות זיהוי המוטציה פותחו לבדיקת המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים. אלה, העכברים הטרנסגניים, בחר למבדה (λ) cII מערכת איתור מוטציה יש כבר מועסקים לניסויים המוטגניות על ידי קבוצות מחקר רבות ברחבי העולם. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור למדא בחר cII מוטציה וזמינותו, אשר ניתן להחיל על תאים בתרבית של העכברים הטרנסגניים/חולדות או החיות המקביל שטופלו עם סוכן כימי/פיזי של עניין. הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: (1) בידוד של דנ א גנומי מתאי או איברים/רקמות חיות הטרנסגניים שטופלו חוץ גופית או ויוו, בהתאמה, תרכובת מבחן; (2) שחזור של וקטור הסעות למדא נושא גן כתב mutational (כלומר, cII transgene) של ה-DNA גנומי; (3) אריזה של הווקטורים שניצלו לתוך bacteriophages זיהומיות; (4) להדביק חיידקים המארח ו culturing בתנאים סלקטיבית כדי לאפשר הפצת מוטציות המושרה cII ; (5) הקלפים של cII-מוטציות ו- DNA רצף ניתוח כדי לקבוע את תדירות מוטציה cII ואת הספקטרום מוטציה, בהתאמה.

Introduction

מגוון רחב של מודלים בבעלי חיים מהונדס ומערכות איתור מוטציה פותחו לבדיקת המוטגניות של חומרים מסרטנים בתאי יונקים. אלה, העכברים הטרנסגניים Big Blue (המכונים להלן BB), בחר λ cII מערכת איתור מוטציה יש כבר מועסקים לניסויים המוטגניות על ידי קבוצה זו רבים אחרים מחקר קבוצות ברחבי העולם1,2, 3,4,5,6,7,8,9. במשך 16 השנים האחרונות, חקרנו את ההשפעות המוטגניות של סוכנים כימי ו/או גופניים שונים באמצעות בעלי חיים אלה הטרנסגניים או שלהם תרביות תאים עובריים פיברובלסט המקביל שטופלו תרכובת המבחן ולאחר לאחר מכן ניתח גן # מושגים בסיסיים, גנוטיפ של transgene cII מאת λ cII בחירה וזמינותו של רצפי DNA, בהתאמה10,11,12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. הגנום של בעלי חיים אלה הטרנסגניים מכיל bacteriophage λ הסעות וקטור (λLIZ) משולב על כרומוזום 4 כמו2,1,concatemer ראש זנב מרובת עותקים25. הווקטור הסעות λLIZ נושאת שני גנים כתב mutational, כלומר לצי של cII transgenes1,2,25,26,27, 28,29,30,31,32,33,34,35,36, 37,38,39,40,41,42,43,44,45 , 46 , 47. λ cII בחירה וזמינותו מבוססת על החזרתה של הווקטורים הסעות λLIZ של ה-DNA גנומי של תאים שמקורם איברים/רקמות חיות הטרנסגניים1,2,25 . הווקטורים הסעות λLIZ התאושש ארוזים ואז לתוך ראשי phage λ מסוגל להדביק מארח מחוון Escherichia coli. לאחר מכן, נגוע החיידקים גדלים בתנאים סלקטיבית כדי לאפשר את הניקוד וניתוח של מוטציות של cII transgene1,3.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט עבור וזמינותו בחר cII λ, אשר מורכב של בידוד של דנ א גנומי של תאים/איברים של חיות הטרנסגניים מטופלים במבחנה/ויוו עם החזרה במתחם, בדיקה של λLIZ מעבורת וקטורים מן ה-DNA גנומי, אריזה של הווקטורים לתוך phages λ זיהומיות, זיהום של החיידק המארח עם bacteriophages, זיהוי cII-המוטציות בתנאים סלקטיבית כדי לקבוע את תדירות מוטציה של cII , ו ניתוח רצף הדנ א להקים cII מוטציה הספקטרום. הפרוטוקול ניתן להחיל על העכבר הטרנסגניים/חולדה תא תרבויות מטופלים במבחנה עם סוכן כימי/פיזי של עניין, או רקמות/איברים מבעלי החיים המתאים שטופל ויוו עם בדיקה כימית/סוכן1, 2,4,48,49,50,51,52. מצגת סכמטי של λ cII בחירה וזמינותו מוצג באיור1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הדנ א בידוד מן העכבר מתחלקים Fibroblasts

הערה: העכבר הראשי fibroblasts עובריים הם מבודדים מעוברים שמקורם העכברים הטרנסגניים BB עם רקע גנטי C57BL/6, על פי פרוטוקול שפורסמו53. חומר המוצא עבור פרוטוקול זה מורכב עונה 1 פרק 106 עונה 1 פרק 107 תאים עובריים פיברובלסט שטופלו מבחן מתחם מול פקד. קציר וספירה של תאים אלה תוך שימוש בשיטות הרגילות מתוארים הפניות-10,-54,-55.

  1. הכנת מאגר של (0.3 M סוכרוז 60 מ מ אשלגן כלורי, 15 מ מ NaCl, 60 מ מ טריס-HCl, pH 8.0, spermidine 0.5 מ מ, 0.15 מ מ spermine, 2 מ מ EDTA), מאגר B (150 מ מ EDTA NaCl ו- 5 מ מ, pH 7.8) ומאגר C (20 מ מ טריס-HCl, pH 8.0 20 מ מ NaCl EDTA 20 מ מ, 1% מרחביות) מראש, ומשמרות בטמפרטורת החדר (RT) במשך שנה אחת עד54,55.
  2. Resuspend תאים במאגר 2 – 4 מ"ל A בשפופרת צנטרפוגה חרוט 15 מ"ל מאת pipetting שוב ושוב למעלה ולמטה שימוש רחב נשא 1,000 µL פיפטה עצה.
  3. הוסף אחד נפח (2 – 4 מ"ל) מאגר א המכיל 1% octylphenoxypolyethoxyethanol (למשל, Nonidet P40) באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית.
  4. דגירה הצינור על קרח למשך 5 דקות.
  5. Centrifuge את הצינור ב x 1000 g למשך 5 דקות ב- RT.
  6. למחוק את תגובת שיקוע ולשטוף את גלולה עם מאגר 10 – 15 מ ל באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית.
  7. Resuspend בגדר במאגר 2 – 4 מ ל B.
  8. הוסף אחד נפח (2 – 4 מ"ל) מאגר C המכיל 600 µg/mL proteinase K.
  9. דגירה הצינור עבור h 3-37 מעלות צלזיוס.
  10. להוסיף RNase A ריכוז סופי של 100 µg/mL.
  11. דגירה הצינור עבור h 1 נוספים 37 מעלות צלזיוס.
  12. הוספת פנול נפח (2 – 4 מ"ל) אחד (רווי ב 0.1 M טריס-HCl, pH 8.0):chloroform:isoamyl אלכוהול (vol 25:24:1/כרך).
    הערה: פנול יכול להוות סיכון בריאותי חמור, יש לטפל בזהירות מירבית. פנול קורוזיבית מאוד על העור, נספג בקלות דרך זה, ותערוכות תופעות אחרות. כאשר טיפול פנול, תמיד משתמש כפפה כפול, ללבוש מגן eyewear, ועובדים עם ברדס fume כימי.
  13. מערבבים היטב בעזרת היפוך הצינור עבור 5 דקות על שפופרת מסובב ב 4 º C.
  14. Centrifuge את הצינור ב x 1000 g למשך 5 דקות ב 4 º C.
  15. הסר את שלב מימית (שכבה עליונה) לרכבת התחתית החדשה באמצעות פיפטה סרולוגית זכוכית.
  16. חזור על מיצוי באלכוהול פנול: כלורופורם: isoamyl 1 עד 3 פעמים עד השלב מימית ברור הממשק הוא כבר לא עכורים.
  17. הוסף 1/10 נפח (200-400 µL) 3 מ' סודיום אצטט, pH 5.2.
  18. להוסיף 2.5 נפח (5 – 10 מ"ל) 100% אתנול (מקורר), להפוך את הצינור בעדינות ביד למשך 2-3 דקות.
  19. ברקע את ה-DNA עם קרס זכוכית, להעביר אותו צינור חדש המכיל 1 – 5 מ ל-70% אתנול ולשטוף אותו ביסודיות. לחלופין, centrifuge את הצינור במהירות גבוהה (3,500 x g) ב 4 ° C הצניפה הדנ א. ולשטוף אותו ביסודיות עם 1-5 מ ל 70% אתנול.
  20. Centrifuge את הצינור במהירות גבוהה (3,500 x גרם) ב- RT, להסיר את תגובת שיקוע, מילה נהדרת הדנ א למשך 10-15 דקות.
  21. להמיס את ה-DNA במאגר 10 – 100 µL TE (10 מ מ טריס-HCl, 1 מ"מ EDTA, pH 7.5), ולאחסן ב 4 ° C (עבור אחסון קצר של עד חודש) או ב-20 ° C (עבור מרשו אחסון). ריכוז אופטימלי עבור ה-DNA עבור וזמינותו בחר cII λ הוא 0.5-1.0 µg/µL (במאגר טה)56.

2. במבחנה התגובה אריזה

  1. לכל תגובה אריזה אחת, להוסיף ~ 5 µg הדנ א (נפח סופי: 8 – 12 µL, דנ א גנומי היה מבודד בסעיף 1 מן העכבר מתחלקים fibroblasts מטופלים במבחנה עם מבחן מתחם או שליטה) לרכבת התחתית microcentrifuge המכיל הראשון תערובת התגובה (~ 10 µL).
    הערה: בתוך הבית מוכן או λ זמינים מסחרית אריזה תמציות משמשים במעבדות שונות. באריזה מסחרית תמצית שהשתמשתי בקיט כאן56 (ראה את הטבלה של חומרים), צינורות אדומים הכיל את תערובת התגובה הראשונה (~ 10 µL) ו צינורות כחול הכיל את תערובת התגובה השנייה (µL ~ 70 לתגובות לפחות 5).
  2. דגירה הצינור במשך 90 דקות ב 30 º C.
  3. הוסף את אמצעי האחסון הדרושים (~ 12 µL) של המיקס התגובה השנייה ברכבת התחתית.
  4. דגירה של צינור 90 דקות נוספות ב 30 º C.
  5. להוסיף mL 1.1 מאגר SM ברכבת התחתית.
    הערה: 1 מ"ל של פתרון זה (כלומר, תערובת התגובה אריזה) ישמש לסינון λ cII-מוטציות. השארית ישמש עבור titering.
    1. הכנת מאגר SM על ידי ערבוב 5.8 גר' NaCl, 2.0 g MgSO4.7H2O, 50 מ ל 1 מ' טריס-HCl (pH 7.5), ו- 5 מ ל 2% (w/v) ג'לטין. להוסיף dH2O נפח סופי של 1 ליטר, תא לחץ במשך 30 דקות החנות בטמפרטורת החדר עד 1 שנה.
  6. מערבולת הצינור המכיל לדנ ארוזה 10 s ב RT (נמרצת vortexing).
  7. הדופק לסובב את הצינור microcentrifuge, חנות על הקרח עד מוכן לשימוש. אם המדגם לא הולך להשתמש בו בתוך באותו היום של אריזות, להוסיף 50 µL של כלורופורם לכל מיליליטר DNA ארוז לטעום, מערבולת בעדינות, ולאחסן ב 4 ° C עד 2 שבועות.

3. הכנת התרבות חיידקי e. coli G1250

  1. לפחות יומיים לפני ציפוי, לבצע כמה צלחות פס חיידקי Escherichia coli (e. coli) G1250 על TB1-kanamycin אגר צלחות.
    1. להכין פלטות אגר TB1-kanamycin כדלקמן. מערבבים 5.0 g אגר NaCl, g 10.0 קזאין peptone ו- 12.0 g. להוסיף 800 מ ל dH2O. להוסיף 1 מ ל 0.1% תיאמין הידרוכלוריד. להתאים את ה-pH אל 7.0 עם NaOH או HCl. הוסף dH2O לאמצעי הסופי של 1 ליטר.
    2. לערבב היטב אוטוקלב במשך 30 דקות אפשר להצטנן עד 55 מעלות צלזיוס. מוסיפים 50.0 mg Kanamycin ומערבבים. שופכים לתוך צלחות פטרי סטריליות 100-מ מ (20 – 25 מ לכל מנה). חנות צלחות ב 4 ° C עד שבועיים.
  2. דגירה הלוחות פס חיידקי בתוך חממה נייח-30 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות.
  3. יום אחד לפני ציפוי, לשלב 10 מ"ל של מדיום נוזלי TB1 עם 100 µL של 20% (w/v) מלטוז-1 מ' MgSO4 פתרון צינור חרוטי של בורג-קאפ סטרילי 50 מ.
    1. להכין את המדיום הנוזלי TB1 כדלקמן. Mix 5.0 g NaCl ו- 10.0 g קזאין peptone, ואז להוסיף 800 מ ל dH2O, 1 מ"ל 0.1% תיאמין הידרוכלוריד, ולהתאים את רמת ה-pH אל 7.0 עם NaOH או HCl. לאחר מכן להוסיף dH2O נפח סופי של 1 ליטר, לערבב היטב, החיטוי במשך 30 דקות החנות המדיום-RT עד שלושה חודשים.
    2. להכין 20% (w/v) מלטוז-1 מ' MgSO4 כדלקמן. מערבבים מלטוז 20.0 g ו- 24.6 g MgSO4. 7 שעות2O, לאחר מכן להוסיף dH2O נפח סופי של 100 מ. מסנן לחטא ולאחסן ב 4 ° C עד 6 חודשים.
  4. לחסן את המדיום הנוזלי עם מספר מושבות מהצלחת פס חיידקי שימוש סטרילי לחסן לולאה56.
  5. דגירה התרבות נוזלי לילה ב- 30 מעלות צלזיוס רועדות חממה עם טלטול נמרץ (250-300 סל ד).
  6. יום של ציפוי centrifuge צינור חרוטי המכיל התרבות נוזלי G1250 ב x 1,500 g 10 דקות ב RT כדי הצניפה תאי חיידקים.
  7. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 10 מ ל 10 מ מ MgSO4.
  8. למדוד את ספיגת של 1:10 דילול של התליה תא-גל 600 nm באמצעות של UV-Vis ספקטרופוטומטרים (למשל, 100 µL תא ההשעיה + 900 µL-10 מ מ- MgSO-4)56.
  9. לדלל התליה תא אל OD סופית600 של 0.5 עם 10 מ מ MgSO4. השעיית מוכן G1250 e. coli עם יתר600 = 0.5 הוא המכונה 'תרבות ציפוי G1250'.
  10. לאחסן את התרבות ציפוי G1250 על הקרח ולהשתמש תוך 1-2 h.

4. ציפוי דגימות ה-DNA ארוז

  1. לכל אחד ארוז. דנ א, להכין 16 סטרילי 14 x 100 מ מ2 למטה לסיבוב צינורות, פלטות אגר TB1 16. עשר מכל ערכה ישמש עבור הקרנה ו- 6 עבור titering (שלושה כייל נוגדנים 20) ושלושה עבור 100 כייל נוגדנים.
    1. להכין פלטות אגר TB1 כדלקמן. מיקס 5.0 g NaCl, 10.0 g קזאין peptone ו- g 12.0 אגר, לאחר מכן להוסיף 800 מ ל dH2O ו- 1 מ ל 0.1% תיאמין הידרוכלוריד. להתאים את ה-pH אל 7.0 עם NaOH או HCl, ולהוסיף dH2O נפח סופי של 1 ל'
    2. מערבבים היטב ומאפשרים אוטוקלב במשך 30 דקות לתערובת להצטנן עד 55 ° C, ואז ותשפכי לתוך צלחות פטרי סטריליות 100 מ מ (20 – 25 מ לכל מנה). חנות את הלוחיות ב 4 ° C עד שבועיים.
      הערה: פלטות אגר TB1 צריך להיות מוכן לפחות 24 שעות לפני השימוש.
  2. µL 200 aliquot של התרבות ציפוי G1250 לתוך כל שפופרת סיבוב המדרגה.
  3. עבור titering, לגרום לדילול מטריים לדנ הארוזה ומערבבים היטב על ידי vortexing (כלומר, 10 µL ארוז. דנ א + מאגר SM 990 µL).
  4. להוסיף כל אחד הצינורות כייל נוגדנים 20 שלוש µL 20 של דילול מטריים.
  5. להוסיף כל אחד שלושה צינורות כייל נוגדנים 100 µL 100 של דילול מטריים.
  6. להקרנה, להוסיף 100 µL של 'מדולל ' ארוזים. דנ א לכל אחד הצינורות ההקרנה עשר.
  7. לעבד את כל titering וצינורות הסינון (2 x 3 + 10 = 16 צינורות), כדלקמן: מערבבים היטב בעזרת vortexing במשך כ 10 s, ואז דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לאפשר המארח e. coli כדי לספוח את phages.
  8. להוסיף 2.5 מ ל TB1 מותכת שהוכן במיקרוגל מלמעלה אגר (מקורר עד 55 מעלות צלזיוס) כל כייל נוגדנים או הקרנת שפופרת, לערבב מיד על ידי vortexing (בעדינות), לשפוך לתוך כייל נוגדנים המתאימים או הקרנת פלטות אגר TB1.
    1. להכין אגר העליון TB1 כדלקמן. Mix 5.0 g NaCl, 10.0 g קזאין peptone ו- 7.0 g אגר, ואז להוסיף 800 מ ל dH2O. להוסיף 1 מ ל 0.1% תיאמין הידרוכלוריד ולאחר מכן להתאים את ה-pH אל 7.0 עם NaOH או HCl. לבסוף, להוסיף dH2O נפח סופי של 1 ליטר.
    2. מערבבים טוב, החיטוי עבור 20 – 25 דקות החנות בטמפרטורת החדר עד שלושה חודשים.
    3. לפני השימוש, להמיס אגר העליון TB1 מוכן למיקרוגל, מערבבים היטב, להתקרר עד 55 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים.
      הערה: החלק העליון TB1 מותכת ומצוננים מתווסף את התוכן של כל כייל נוגדנים או הקרנה שפופרת, לאחר ערבוב, ויוצקים לתוך כייל נוגדנים המתאימים או פלטות אגר הקרנה TB1.
  9. תן את הצלחות לעמוד למשך 15-30 דקות בטמפרטורת החדר, עם המכסה פתוחה כדי למנוע עיבוי.
  10. היפוך הלוחות, למקם את הצלחות ההקרנה עשר חממה נייח-24 ° C ו תקופת דגירה של h 46-48 (קרי, תנאים סלקטיבי) עם הלוחיות כייל נוגדנים 6 בחממה נייח-37 מעלות צלזיוס ואת תקופת דגירה של 24 שעות/לילה (קרי, תנאים לא בררניים).
    הערה: עבור אבטחת איכות ותקינה של תוצאות, פתרונות phage בקרה זמינים מסחרית המכיל תערובת של wildtype מוטציה cII בתדירות המוטציות ידועות מצופה לצד דגימות ה-DNA ארוז הינם כלולים בכל assay פועל56.

5. בחינת כייל של הקרנת לוחות כדי לקבוע את cII תדירות מוטציה

  1. בעקבות הדגירה h/לילה 24-37 מעלות צלזיוס, לספור מספר שלטי נוצר בכל אחד של שלוש צלחות 20 כייל נוגדנים, כייל נוגדנים 100 צלחות. כדי לזהות ביתר קלות את הפלאק, להחזיק את הצלחת ליד תיבת האור הלבן, על רקע כהה עם מכסה הסיר (ראה איור 2).
  2. הופכים את ממוצע (ממוצע) של מספר לוחות תפילה במניין כל קבוצה של 20 כייל נוגדנים צלחות וצלחות כייל נוגדנים 100 (triplicate, כל אחד).
  3. בחר את המספר הממוצע של הסט של צלחות כייל נוגדנים שנופל הקרוב ביותר בטווח של 50-200 הפלאק לכל סט צלחת.
  4. לחשב את המספר הכולל של הפלאק הוקרן הלוחות ההקרנה עשר כדלקמן:
    סה כ הפלאק מוקרן = (כלומר מספר שלטי בערכת שבחרת כייל נוגדנים צלחות ÷ מספר µL של דילול בשימוש לכל צלחת כייל שבחרת) x פקטור דילול x מספר µL של הארוזה. דנ א לכל הקרנות צלחת [µL 100/צלחת] x מספר הקרנת לוחות [10].
    הערה: לדוגמה, אם מספר שלטי לכל צלחת בערכת כייל נוגדנים 20 צלחות רשע הוא 128 והוא המספר המתאים בערכת כייל נוגדנים 100 צלחות 478, מספר 128 ייעשה שימוש לצורך חישוב המספר הכולל של הפלאק מוקרן , כדלקמן:
    (128 ÷ 20) x 100 [גורם לדילול] x 100 [µL/צלחת] x 10 [לוחות] = 640,000
    זה שווה כדי הכפלת המספר הממוצע של הפלאק 5,000 או 1,000, אם המספר הממוצע מבוסס על ספירת כייל נוגדנים 20 צלחות או כייל נוגדנים 100 צלחות, בהתאמה.
  5. בעקבות הדגירה h 46-48-24 מעלות צלזיוס, לספור את המספר הכולל של הפלאק שהוקמה ב הלוחות ההקרנה עשר (בצע את ההוראות שסופקו ב סעיף 5.1).
    הערה: תדירות מוטציה של cII מחושב על ידי חלוקת המספר הכולל של הפלאק שהוקמה ב הלוחות הקרנה על ידי המספר הכולל של הפלאק מוקרן. באמצעות הדוגמה שלעיל, אם המספר הכולל של הפלאק במניין הלוחות הקרנה עשרה נמצא 112, תדירות מוטציה cII דגימת ה-DNA הזה יהיה ÷ 640,000 = 17.5 x 10 112-5.

6. אימות של Putative λ cII מוטציות, הגברה PCR ו- DNA רצף

  1. ליבה הפלקיו המדובר עם טיפ pipet סטרילי, נשא רחב, לגרש אותו (על-ידי pipetting למעלה ולמטה) לתוך צינור microcentrifuge סטרילי המכיל 500 µL מאגר SM סטרילי.
  2. תקופת דגירה של פחות 2 h בטמפרטורת החדר, או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה, כדי לאפשר את החלקיקים phage elute של אגר חברו.
  3. צינור עגול-התחתון2 סטרילי 14 x 100 מ"מ, לערבב 200 µL של התרבות ציפוי G1250 עם µL 1 של הפתרון cored phage ולאחר תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT.
  4. צלחת המדגם באמצעות 2.5 מ של 55 מעלות צלזיוס מותכת TB1 העליון אגר, דגירה את הצלחת ב 24 ° C עבור h 46-48 (תנאי סלקטיבי), כפי שמתואר ב סעיפים 4.8 – 4.10.
  5. ברגע הפלאק משני יצרו, להשתמש טיפ פיפטה לבחור בקפידה λ מאומת מבודד היטב יחיד cII-פלאק מוטציה (להימנע מלגעת של אגר נמוכה יותר).
    הערה: Replating הפלאק מוטציה בשם cII משמשת לשתי מטרות: (i) יופיצ חפצי אמנות עשויים להיות לפעמים טועה עבור לוחות קטנים; (ii) הליבה agarose שנלקחו צלחת ההקרנה עשויים להכיל הלא-מוטציה phage(s) יחד עם phage מוטציה... לוחות משניים מן replating בצפיפות נמוכה תספק תבנית מוטציה מזוהמת PCR, חשפה רצף ה-DNA.
  6. להעביר את הפלקיו צינור microcentrifuge המכילה 25 µL מזוקק פעמיים מים על-ידי pipetting למעלה ולמטה.
  7. מקם את הצינור במים רותחים במשך 5 דקות.
  8. צנטריפוגה במהירות המרבית (18,000 x g) במשך 3 דקות ב- RT.
  9. להעביר מיד µL 10 של תגובת שיקוע צינור microcentrifuge המכיל 40 µL של mastermix ה-PCR שבה ריכוז סופי ריאגנטים הם מאגר ה-PCR של Taq x 1, 10 pmol כל של תחל ואחורה nmol 12.5 של כל dNTP , ו- 2.5 U של הדנ א. אנזימים.
    הערה: תחל ואחורה הם כדלקמן: 5'-CCACACCTATGGTGTATG-3' (עמדות-68 ל-50 יחסית cII להתחיל codon) ו- 5'-CCTCTGCCGAAGTTGAGTAT-3' (עמדות +345 כדי +365 ביחס codon התחלה cII ), בהתאמה.
  10. להגביר את התבנית באמצעות רכיבה על אופניים הפרמטרים הבאים: דנטורציה 3 דקות ב 95 מעלות צלזיוס, ואחריו מחזורים של 30 s ב 95 ° C, 1 דקות ב- 60 ° C, ו- 1 דקות ב- 72 מעלות צלזיוס, עם סיומת הסופי של 10 דקות-72 מעלות צלזיוס.
  11. לטהר את המוצר PCR 432 bp המכילים את הגן cII ולא איגוף אזורים באמצעות ערכות טיהור PCR זמינים מסחרית, על פי הוראות היצרן.
  12. לבצע רצפי DNA באמצעות הפלטפורמה המתאימה רצף, וניתוח רצפי דנ א וכתוצאה מכך לזהות מוטציות transgene cII (ראה להלן בהערה).
    הערה: זו בצורה הטובה ביותר מושגת על ידי יישור עם הרצף cII הפניה באמצעות תוכנה, כמו מבוסס-אינטרנט קפה T רצף יישור השרת. לקבלת הוראות כיצד להשתמש בתוכנית, בקר: http://tcoffee.crg.cat/

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בהתאם לנתונים הפצה, בדיקות פרמטרית או שאינם פרמטרי משמשים כדי לקבוע את המשמעות של הבדל בשכיחות מוטציה cII בין קבוצות הטיפול ושליטה (קרי, המושרה לעומת תדרים מוטציה ספונטנית) . השוואה של התדרים מוטציה המושרה cII קבוצות טיפול שונה נעשית על ידי שונים (pairwise) בדיקות סטטיסטיות, לפי הצורך. המבחן ההיפר-גיאומטרית של אדמס ו- Skopek משמש בדרך כלל כדי להשוות את ספקטרום מוטציה המושרה, ספונטני הכולל57, למרות בדיקות אחרות, כגון χ2 המבחן או השונות (ANOVA), יכול לשמש גם כדי להשוות את התדר של כל סוג ספציפי של מוטציה (למשל, המעבר, transversion, הוספה או מחיקה) בין ספקטרום מוטציה המושרה - ושליטה, או בין שונים מוטציה spectra שנגזרות כימיקלים שונים/סוכנים או מינונים שונים של אותו כימית/סוכן.

איור 3 היא אוסף של תדירות מוטציה נתונים ממחקרים שפורסמו שבו הראו כי היקף העלייה היחסית cII תדירות מוטציה בהעכבר מתחלקים fibroblasts שטופלו כימיקלים שונים ו/או physicalagents עשוי להשתנות מעט-לכמה hundred-fold, ה מוטגני 'עוצמה' של המתחם מבחן. קיפול-עליות משמעותיות מבחינה סטטיסטית תדירות מוטציה של cII מוצגים עבור העכבר מתחלקים fibroblasts שטופלו אקרילאמיד12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, טמוקסיפן18, חומצה אלפא-aminolevulinic (אלפא-ALA) בתוספת במינון נמוך אולטרה סגול בהיר A (UVA: λ > 320−400 ננומטר)15benzo (א) pyrene diol epoxide(B(a)PDE)19, equilethal במינון של UVA, UVB (λ = 2 80−320 ננומטר), ואת מדומה שמש UV (SSL) 21 (ראה איור 3).

איור 4 הוא הפגנה של 'הרצף-יחודיות' של מוטציות שבו אנחנו הראו את אינדוקציה של סוגים ספציפיים של מוטציה ב- transgene cII ב mouseembryonicfibroblasts מוקרן עם UVBrelativetocontrol23. הקשת מוטציה UVB-induced מאופיין על ידי עליות משמעותיות ב התדירות היחסית של מעברים C→T יחיד או טנדם-פירימידין dinucleotides.

Figure 1
איור 1: מצגת סכמטי של λ cII בחירה וזמינותו. וזמינותו מבוסס על האחזור של הווקטורים הסעות λLIZ, אשר מכילים את transgene cII כמו גן mutational כתב, מן ה-DNA גנומי של תאים בתרבית נגזר מכרסמים הטרנסגניים מטופלים במבחנה עם תרכובת מבחן או רקמות/איברים מבעלי החיים המתאים לטפל ויוו עם נבדק כימית/הסוכנת ( ו- B). הווקטורים שניצלו ארוזים לתוך ראשי phage λ שיכולים להדביק מארח המתאים e. coli (C ו- D). החיידק הנגועים גדלים ואז בתנאים סלקטיבית כדי לאפשר את הניקוד וניתוח של מוטציות cII transgene1,2,3,25, 52 (E). קביעת תדירות מוטציה המושרה cII והקמת הספקטרום מוטציה על ידי רצפי DNA מתוארים ב F ו- G. ספקטרום מוטציה המושרה, ספונטני הם דמיינו בתבניות שונות. להמחשה, אנחנו הדגישו תבנית שבו מוטציות המושרה cII יוקלדו מעל הרצף הפניה, ואילו מוטציות ספונטניות (בקרה) יוקלדו מתחת הרצף הפניה (H). הגובה של בסיס מוטציה מייצג תדירותו של מוטציות (כלומרגבוה יותר, את הבסיס של מוטציה בתדירות גבוהה יותר). מספרים מעל בסיס מוטציה להצביע על תדירות אחוז של מוטציות בגן את הבסיס הזה. בסיסים שנמחקו מסומנות בקו תחתון. בסיסים שנוספו מוצגים עם חץ. הספרות הבסיסים הפניה נוקלאוטיד עמדות. הנתונים הם מחקר שפורסם23. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ספירת לוחות לוחות כייל נוגדנים. כדי לזהות ביתר קלות את הפלאק, צלחות מתקיימים ליד תיבת האור הלבן, על רקע כהה בשלמותם הוסר. צלחת כייל נוגדנים 20 (א) וצלחת כייל נוגדנים 100 (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: מוטציה תדרים של transgene cII ב העכבר מתחלקים fibroblasts מטופלים עם כימיקלים שונים/סוכנים הפיזי לעומת פקדים או. הנתונים הם מחקרים שפורסמו על אקרילאמיד12, glycidamide14, aflatoxinB1(AFB1)22, טמוקסיפן18, אלפא-aminolevulinic חומצה (אלפא-ALA) וגם במינון נמוך של אור אולטרה סגול (UVA: λ > 320−400 ננומטר)15, benzo(a) pyrenediol epoxide (B(a)PDE)19, equilethal במינון של UVA, UVB (λ = 280−320 ננומטר), ואת מדומה שמש UV (SSL)21. כדי לעכל ביעילות טמוקסיפן תאי פיברובלסט עובריים בעכבר, השתמשנו מערכת ההפעלה-S9 (S9 mix) המורכב ההכנות Aroclor 1,254-induced חולדה הכבד ו קופקטור ריאגנטים22. כל ההבדלים בין מטופלים-דגימות הבקרה הם משמעותי סטטיסטית ב p < 0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: ספקטרום מוטציה של transgene cII ב העכבר מתחלקים fibroblasts מוקרן עם UVB יחסי שליטה. הנתונים הם מחקר שפורסם23. עמיתיהם מראה גדיל של כל מעברי (למשל, G→A ו- C→T), transversions (למשל, G→T, C→A או G→C, C→G) משולבים. תוספות: ההכנסה; דל: מחיקה. הקשת מוטציה UVB-induced מאופיין על ידי עליות משמעותיות ב התדירות היחסית של מעברים C→T יחיד או טנדם-פירימידין dinucleotides. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Λ cII בחירה וזמינותו משמש לצורך זיהוי של מוטציות transgene cII התאוששה הדנ א הגנומי של תאים שמקורם איברים/רקמות של BB מכרסמים3. הגנום של בעלי חיים אלה הטרנסגניים מכילה עותקים של וקטור הסעות λLIZ chromosomally משולב, אשר נושאת את cII טנדם (294 bp) ו לצי (1,080 bp) transgenes, כמו גנים כתב mutational1, 2 , 25. λ cII בחירה וזמינותו מבוסס על האחזור של הווקטורים הסעות λLIZ של ה-DNA גנומי של תאים/רקמות של החיות מהונדס, ואחריו אריזה של הווקטורים שניצלו לתוך ראשי phage λ שיכולים להדביק מארח המתאים E. coli. לאחר מכן, נגוע החיידקים גדלים בתנאים סלקטיבית כדי לאפשר את הניקוד וניתוח של מוטציות בגן transgene cII 1,(ראה איור 1)3. Λ cII בחירה וזמינותו כבר בשימוש נרחב לניסויים המוטגניות של מגוון רחב של כימיקלים ו/או סוכנים הפיזי (שבתוך הפניות2,49). וזמינותו הוחלה בהצלחה על העכבר הטרנסגניים/חולדה תא תרבויות מטופלים במבחנה עם כימיקלים שונים/סוכנים פיזי או ולאחר האברים/הרקמות של בעלי החיים המתאימים שטופלו ויוו בדיקה שונים כימיקלים/סוכנים4,5,6,7,8,9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 34 , 58 , 59 , 60 , 61 , 62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 , 74 , 75.

Λ cII בחירה וזמינותו בתאים בתרבית של מכרסמים הטרנסגניים שטופלו מייצג מורכב המבחן, במובנים רבים, אלטרנטיבה מעשית ויוו המוטגניות הניסויים בבעלי החיים המקביל שטופלו כימית/הסוכן שנבדקו 3. ככלל, הדגמים במבחנה מציעים יתרונות רבים על פני עמיתו שלהם ויוו חייתיים, כפי שהם הרבה פחות עבודה אינטנסיבית ויקרות, דורשים הרבה פחות זמן להסתיים, והכי חשוב, אינם לערב את השימוש בבעלי חיים50,2,, או52ישירה. במקביל, הדגמים במבחנה אולי לא באופן מלא מסכם את הדברים בכל היבטי מוטגנזה מכוונת בשל ההבדלים המאפיינים פרמוקוקינטיים ו pharmacodynamic של כימיקלים בין תאים בתרבית במבחנה חיות ניסוי אין ויוו 2 , 3. לדוגמה, כימיקלים אשר תוואי החשיפה היא שאיפת (למשל, סיגריה אלקטרונית או עשן הסיגריה vapor) ניתן לבצע רק לבצע במבחנה בדיקות תרביות תאים לאחר שהם עוברים המרה מגז או אדים טפסים נוזלי או מעובה, אשר מסבך את פרמקוקינטיקה שלהם. כמו כן, שלם או נעדר יכולת חילוף החומרים של תאים בתרבית במבחנה להמרת כימיקלים מסוימים מינים DNA-תגובתי לא מייצג נזק לדנ א מונע המוטגניות בעלי חיים שנחשפו ויוו לכימיקלים genotoxic2 ,3. למרות חיסרון זה עשויים להיות מתוגמלים בגין, על היקף בדרגות שונות, על ידי התוספת של הפעלה מטבולית חיצוני למערכת (קרי, S9 mix) ה במבחנה תא תרבות מודלים22.

יתר על כן, להקים את ההעתק של החיים האמיתיים חשיפה genotoxic כימיקלים/סוכנים מוגבל יותר במודלים במבחנה תא תרבות מאשר עם חיות ניסוי ויוו3. באופן כללי, בני אדם נחשפים מינונים כרונית של סוכנים genotoxic במשך תקופה של מספר שנים לפני כמה עשורים76,77,78. תוחלת החיים סופיים של תאים בתרבות, לעומת החיים ארוכים יחסית של מכרסמים (קרי, ימים/שבועות לעומת כמה שנים) גורם מידול של חשיפה genotoxins מאתגרת יותר דגמים לשעבר2, 3. בכל זאת, ניתוח המוטגניות עם במבחנה תא תרבות מודלים מספקים אינדיקציה ראשונית של הפוטנציאל genotoxic של חומר כימי מסוים / agent(s), ואת התוצאות יכול לשמש כמדריך לתכנן ניסויים 'מעודן' ויוו אשר כוללים מספר 'צמצום' של בעלי חיים2,3.

לסיכום, λ cII בחירה וזמינותו בתאים בתרבית של מכרסמים הטרנסגניים שטופלו מבחן מורכבים, או החיות המקביל שטופלו עם הסוכן/כימית שנבדקו, היא גישה יקר המוטגניות בדיקה. אנחנו משתמשים בהצלחה הגישה, כפי שיש קבוצות מחקר נוספות ברחבי העולם4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17,18,19, 20,21,22,23,24,34,58,59,60, 61,62,63,64,65,66,67,68,69, 70,71,72,73,74,75. לאחרונה, הרחבנו את היישומים של גישה זו על ידי פיתוח טכניקה חדשה שבה שינוי של λ cII בחירה וזמינותו יחד עם הדור הבא רצפי מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של מוטציות בזמן-, עלות, אופן העבודה אפקטיביות23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

ברצוננו להודות התרומות של כל עמיתיו ושותפיו ללימודים המקורי שלנו, אשר התוצאות כבר התייחסו בכתב היד (להמחשה). העבודה של המחברים נתמך על ידי מענקים הלאומית המכון של שיניים, מחקר ואסטתיים של מכוני הבריאות הלאומיים (1R01DE026043) ל AB ו מן האוניברסיטה של מחלת California Tobacco-Related מחקר לתוכנית AB ( TRDRP-26IR-0015) סטריט (TRDRP-25IP-0001). נותני החסות של המחקר שהיה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח נתונים, נתונים לפרשנות, כתיבת הדו ח, או ההחלטה להגיש לפרסום.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar MO Bio Laboratories, Inc. 12112-05 Bacteriological grade
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit Thermo Fisher Scientific 4337455 None
Casein Peptone Alfa Aesar H26557 None
Gelatine J. T. Baker 2124-01 Powder
Glycerol Fisher Scientific BP 229-1 / M-13750 None
LB Agar Fisher Scientific BP 9724-500 None
QIAquick PCR purification kit Qiagen 8104 50 PCR purification reactions
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific M-15756 None
Taq5000 DNA Polymerase  Qiagen 201207 None
Thiamine Hydrochloride Macron Fine Chemicals 2722-57 None
Transpack Packaging Extract Stratagene Corp., Acquired by BioReliance | Sigma-Aldrich Corp. 200223 50 packaging reactions
Tris Base Fisher Scientific BP 152-1 / EC 201-064-4 None
Trypton Biosciences RC-110 None

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  2. Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. Detailed review of transgenic rodent mutation assays. Mutat Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).
  3. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating human cancer etiology by DNA lesion footprinting and mutagenicity analysis. Carcinogenesis. 27 (8), 1526-1537 (2006).
  4. Watson, D. E., Cunningham, M. L., Tindall, K. R. Spontaneous and ENU-induced mutation spectra at the cII locus in Big Blue Rat2 embryonic fibroblasts. Mutagenesis. 13 (5), 487-497 (1998).
  5. Erexson, G. L., Watson, D. E., Tindall, K. R. Characterization of new transgenic Big Blue(R) mouse and rat primary fibroblast cell strains for use in molecular toxicology studies. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 90-96 (1999).
  6. Erexson, G. L., Tindall, K. R. Micronuclei and gene mutations in transgenic big Blue((R)) mouse and rat fibroblasts after exposure to the epoxide metabolites of 1, 3-butadiene. Mutat Res. 472 (1-2), 105-117 (2000).
  7. McDiarmid, H. M., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. 2-Amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4,5-b]pyridine (PhIP)-induced mutagenesis in cultured Big Blue rat mammary epithelial and fibroblast cells. Environ Mol Mutagen. 39 (2-3), 245-253 (2002).
  8. Papp-Szabo, E., Douglas, G. R., Coomber, B. L., Josephy, P. D. Mutagenicity of the oral carcinogen 4-nitroquinoline-1-oxide in cultured BigBlue rat tongue epithelial cells and fibroblasts. Mutat Res. 522 (1-2), 107-117 (2003).
  9. Guichard, Y., et al. In Vitro Study of Mutagenesis Induced by Crocidolite-Exposed Alveolar Macrophages NR8383 in Cocultured Big Blue Rat2 Embryonic Fibroblasts. J Toxicol. , 323828 (2010).
  10. Besaratinia, A., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Mutational signature of the proximate bladder carcinogen N-hydroxy-4-acetylaminobiphenyl: inconsistency with the p53 mutational spectrum in bladder cancer. Cancer Res. 62 (15), 4331-4338 (2002).
  11. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Enhancement of the mutagenicity of benzo(a)pyrene diol epoxide by a nonmutagenic dose of ultraviolet A radiation. Cancer Res. 63 (24), 8708-8716 (2003).
  12. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Weak yet distinct mutagenicity of acrylamide in mammalian cells. J Natl Cancer Inst. 95 (12), 889-896 (2003).
  13. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Biological consequences of 8-methoxypsoralen-photoinduced lesions: sequence-specificity of mutations and preponderance of T to C and T to a mutations. J Invest Dermatol. 123 (6), 1140-1146 (2004).
  14. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Genotoxicity of acrylamide and glycidamide. J Natl Cancer Inst. 96 (13), 1023-1029 (2004).
  15. Besaratinia, A., Bates, S. E., Synold, T. W., Pfeifer, G. P. Similar mutagenicity of photoactivated porphyrins and ultraviolet A radiation in mouse embryonic fibroblasts: involvement of oxidative DNA lesions in mutagenesis. Biochemistry. 43 (49), 15557-15566 (2004).
  16. Yoon, J. H., et al. DNA damage, repair, and mutation induction by (+)-Syn and (-)-anti-dibenzo[a,l]pyrene-11,12-diol-13,14-epoxides in mouse cells. Cancer Res. 64 (20), 7321-7328 (2004).
  17. Besaratinia, A., Synold, T. W., Xi, B., Pfeifer, G. P. G-to-T transversions and small tandem base deletions are the hallmark of mutations induced by ultraviolet a radiation in mammalian cells. Biochemistry. 43 (25), 8169-8177 (2004).
  18. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Investigating DNA adduct-targeted mutagenicity of tamoxifen: preferential formation of tamoxifen-DNA adducts in the human p53 gene in SV40 immortalized hepatocytes but not endometrial carcinoma cells. Biochemistry. 44 (23), 8418-8427 (2005).
  19. Kim, S. I., Pfeifer, G. P., Besaratinia, A. Lack of mutagenicity of acrolein-induced DNA adducts in mouse and human cells. Cancer Res. 67 (24), 11640-11647 (2007).
  20. Besaratinia, A., Kim, S. I., Bates, S. E., Pfeifer, G. P. Riboflavin activated by ultraviolet A1 irradiation induces oxidative DNA damage-mediated mutations inhibited by vitamin C. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (14), 5953-5958 (2007).
  21. Besaratinia, A., Kim, S. I., Pfeifer, G. P. Rapid repair of UVA-induced oxidized purines and persistence of UVB-induced dipyrimidine lesions determine the mutagenicity of sunlight in mouse cells. FASEB J. 22 (7), 2379-2392 (2008).
  22. Besaratinia, A., Kim, S. I., Hainaut, P., Pfeifer, G. P. In vitro recapitulating of TP53 mutagenesis in hepatocellular carcinoma associated with dietary aflatoxin B1 exposure. Gastroenterology. 137 (3), 1127-1137, 1137 e1121-1125 (2009).
  23. Besaratinia, A., et al. A high-throughput next-generation sequencing-based method for detecting the mutational fingerprint of carcinogens. Nucleic Acids Res. 40 (15), e116 (2012).
  24. Tommasi, S., Bates, S. E., Behar, R. Z., Talbot, P., Besaratinia, A. Limited mutagenicity of electronic cigarettes in mouse or human cells in vitro. Lung Cancer. 112, 41-46 (2017).
  25. Dycaico, M. J., et al. The use of shuttle vectors for mutation analysis in transgenic mice and rats. Mutat Res. 307 (2), 461-478 (1994).
  26. Davies, R., et al. Mutational spectra of tamoxifen-induced mutations in the livers of lacI transgenic rats. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 430-433 (1996).
  27. de Boer, J. G., et al. Spectrum of spontaneous mutations in liver tissue of lacI transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 30 (3), 273-286 (1997).
  28. de Boer, J. G., Mirsalis, J. C., Provost, G. S., Tindall, K. R., Glickman, B. W. Spectrum of mutations in kidney, stomach, and liver from lacI transgenic mice recovered after treatment with tris(2,3-dibromopropyl)phosphate. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 418-423 (1996).
  29. Dycaico, M. J., et al. Species-specific differences in hepatic mutant frequency and mutational spectrum among lambda/lacI transgenic rats and mice following exposure to aflatoxin B1. Carcinogenesis. 17 (11), 2347-2356 (1996).
  30. Skopek, T. R., Kort, K. L., Marino, D. R. Relative sensitivity of the endogenous hprt gene and lacI transgene in ENU-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 26 (1), 9-15 (1995).
  31. Skopek, T. R., et al. Mutagenic response of the endogenous hprt gene and lacI transgene in benzo[a]pyrene-treated Big Blue B6C3F1 mice. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 376-384 (1996).
  32. Erfle, H. L., et al. An efficient laboratory protocol for the sequencing of large numbers of lacI mutants recovered from Big Blue transgenic animals. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 393-396 (1996).
  33. Gu, M., Ahmed, A., Wei, C., Gorelick, N., Glickman, B. W. Development of a lambda-based complementation assay for the preliminary localization of lacI mutants from the Big Blue mouse: implications for a DNA-sequencing strategy. Mutat Res. 307 (2), 533-540 (1994).
  34. Harbach, P. R., Zimmer, D. M., Filipunas, A. L., Mattes, W. B., Aaron, C. S. Spontaneous mutation spectrum at the lambda cII locus in liver, lung, and spleen tissue of Big Blue transgenic mice. Environ Mol Mutagen. 33 (2), 132-143 (1999).
  35. Kohler, S. W., et al. Spectra of spontaneous and mutagen-induced mutations in the lacI gene in transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (18), 7958-7962 (1991).
  36. Mittelstaedt, R. A., et al. Comparison of the types of mutations induced by 7,12-dimethylbenz[a]anthracene in the lacI and hprt genes of Big Blue rats. Environ Mol Mutagen. 31 (2), 149-156 (1998).
  37. Monroe, J. J., Kort, K. L., Miller, J. E., Marino, D. R., Skopek, T. R. A comparative study of in vivo mutation assays: analysis of hprt, lacI, cII/cI and as mutational targets for N-nitroso-N-methylurea and benzo[a]pyrene in Big Blue mice. Mutat Res. 421 (1), 121-136 (1998).
  38. Morrison, V., Ashby, J. A preliminary evaluation of the performance of the Muta Mouse (lacZ) and Big Blue (lacI) transgenic mouse mutation assays. Mutagenesis. 9 (4), 367-375 (1994).
  39. Okonogi, H., et al. Agreement of mutational characteristics of heterocyclic amines in lacI of the Big Blue mouse with those in tumor related genes in rodents. Carcinogenesis. 18 (4), 745-748 (1997).
  40. Provost, G. S., Mirsalis, J. C., Rogers, B. J., Short, J. M. Mutagenic response to benzene and tris(2,3-dibromopropyl)-phosphate in the lambda lacI transgenic mouse mutation assay: a standardized approach to in vivo mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 342-347 (1996).
  41. Shane, B. S., et al. LacI mutation spectra following benzo[a]pyrene treatment of Big Blue mice. Carcinogenesis. 21 (4), 715-725 (2000).
  42. Shane, B. S., Lockhart, A. M., Winston, G. W., Tindall, K. R. Mutant frequency of lacI in transgenic mice following benzo[a]pyrene treatment and partial hepatectomy. Mutat Res. 377 (1), 1-11 (1997).
  43. Shephard, S. E., Sengstag, C., Lutz, W. K., Schlatter, C. Mutations in liver DNA of lacI transgenic mice (Big Blue) following subchronic exposure to 2-acetylaminofluorene. Mutat Res. 302 (2), 91-96 (1993).
  44. Stiegler, G. L., Stillwell, L. C. Big Blue transgenic mouse lacI mutation analysis. Environ Mol Mutagen. 22 (3), 127-129 (1993).
  45. Walker, V. E., et al. Frequency and spectrum of ethylnitrosourea-induced mutation at the hprt and lacI loci in splenic lymphocytes of exposed lacI transgenic mice. Cancer Res. 56 (20), 4654-4661 (1996).
  46. Young, R. R., Rogers, B. J., Provost, G. S., Short, J. M., Putman, D. L. Interlaboratory comparison: liver spontaneous mutant frequency from lambda/lacI transgenic mice (Big Blue) (II). Mutat Res. 327 (1-2), 67-73 (1995).
  47. Zimmer, D. M., Zhang, X. B., Harbach, P. R., Mayo, J. K., Aaron, C. S. Spontaneous and ethylnitrosourea-induced mutation fixation and molecular spectra at the lacI transgene in the Big Blue rat-2 embryo cell line. Environ Mol Mutagen. 28 (4), 325-333 (1996).
  48. Swiger, R. R., et al. The cII locus in the MutaMouse system. Environ Mol Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).
  49. Heddle, J. A., Martus, H. J., Douglas, G. R. Treatment and sampling protocols for transgenic mutation assays. Environ Mol Mutagen. 41 (1), 1-6 (2003).
  50. Thybaud, V., et al. In vivo transgenic mutation assays. Mutat Res. 540 (2), 141-151 (2003).
  51. Manjanatha, M. G., Cao, X., Shelton, S. D., Mittelstaedt, R. A., Heflich, R. H. In vivo cII, gpt, and Spi(-) gene mutation assays in transgenic mice and rats. Methods Mol Biol. 1044, 97-119 (2013).
  52. Swiger, R. R. Quantifying in vivo somatic mutations using transgenic mouse model systems. Methods Mol Biol. 1105, 271-282 (2014).
  53. Tommasi, S., Besaratinia, A., Wilczynski, S. P., Pfeifer, G. P. Loss of Rassf1a enhances p53-mediated tumor predisposition and accelerates progression to aneuploidy. Oncogene. 30 (6), 690-700 (2011).
  54. Saluz, H. P., Jost, J. P. A Laboratory Guide to Genomic Sequencing. , (1987).
  55. Wijnholds, J., Philipsen, J. N., Ab, G. Tissue-specific and steroid-dependent interaction of transcription factors with the oestrogen-inducible apoVLDL II promoter in vivo. EMBO J. 7 (9), 2757-2763 (1988).
  56. Agilent Technologies; Stratagene Products Division. λ Select-cII Mutation Detection System for Big Blue Rodents. INSTRUCTION MANUAL; Catalog #720120; Revision B.0. , Available from: https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/public/720120.pdf (2018).
  57. Adams, W. T., Skopek, T. R. Statistical test for the comparison of samples from mutational spectra. J Mol Biol. 194 (3), 391-396 (1987).
  58. Kim, S. I., Yoon, J. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. New experimental data linking secondhand smoke exposure to lung cancer in nonsmokers. FASEB J. 26 (5), 1845-1854 (2012).
  59. Yoon, J. I., Kim, S. I., Tommasi, S., Besaratinia, A. Organ specificity of the bladder carcinogen 4-aminobiphenyl in inducing DNA damage and mutation in mice. Cancer Prev Res (Phila). 5 (2), 299-308 (2012).
  60. Boyiri, T., et al. Mammary carcinogenesis and molecular analysis of in vivo cII gene mutations in the mammary tissue of female transgenic rats treated with the environmental pollutant 6-nitrochrysene. Carcinogenesis. 25 (4), 637-643 (2004).
  61. Chen, T., et al. Mutations induced by alpha-hydroxytamoxifen in the lacI and cII genes of Big Blue transgenic rats. Carcinogenesis. 23 (10), 1751-1757 (2002).
  62. Chen, T., et al. 4-Aminobiphenyl induces liver DNA adducts in both neonatal and adult mice but induces liver mutations only in neonatal mice. Int J Cancer. 117 (2), 182-187 (2005).
  63. Crabbe, R. A., Hill, K. A. Heart tissue of harlequin (hq)/Big Blue mice has elevated reactive oxygen species without significant impact on the frequency and nature of point mutations in nuclear DNA. Mutat Res. 691 (1-2), 64-71 (2010).
  64. Hernandez, L. G., Heddle, J. A. A carcinogenic western diet does not induce somatic mutations in various target tissues of transgenic C56BL/6 mice. Mutat Res. 570 (2), 185-196 (2005).
  65. Manjanatha, M. G., et al. Dose and temporal evaluation of ethylene oxide-induced mutagenicity in the lungs of male big blue mice following inhalation exposure to carcinogenic concentrations. Environ Mol Mutagen. 58 (3), 122-134 (2017).
  66. Manjanatha, M. G., et al. Evaluation of mutagenic mode of action in Big Blue mice fed methylphenidate for 24 weeks. Mutat Res. 680 (1-2), 43-48 (2009).
  67. McDaniel, L. P., et al. Mutagenicity and DNA adduct formation by aristolochic acid in the spleen of Big Blue(R) rats. Environ Mol Mutagen. 53 (5), 358-368 (2012).
  68. Mei, N., Heflich, R. H., Moore, M. M., Chen, T. Age-dependent sensitivity of Big Blue transgenic mice to the mutagenicity of N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) in liver. Mutat Res. 572 (1-2), 14-26 (2005).
  69. Mei, N., et al. The genotoxicity of acrylamide and glycidamide in big blue rats. Toxicol Sci. 115 (2), 412-421 (2010).
  70. Nay, S. L., Lee, D. H., Bates, S. E., O'Connor, T. R. Alkbh2 protects against lethality and mutation in primary mouse embryonic fibroblasts. DNA Repair (Amst). 11 (5), 502-510 (2012).
  71. Singh, V. K., Ganesh, L., Cunningham, M. L., Shane, B. S. Comparison of the mutant frequencies and mutation spectra of three non-genotoxic carcinogens, oxazepam, phenobarbital, and Wyeth 14,643, at the lambdacII locus in Big Blue transgenic mice. Biochem Pharmacol. 62 (6), 685-692 (2001).
  72. Stuart, G. R., et al. Interpretation of mutational spectra from different genes: analyses of PhIP-induced mutational specificity in the lacI and cII transgenes from colon of Big Blue rats. Mutat Res. 452 (1), 101-121 (2000).
  73. Terrell, A. N., et al. Mutagenicity of furan in female Big Blue B6C3F1 mice. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen. 770, 46-54 (2014).
  74. Thompson, C. M., et al. Assessment of the mutagenic potential of Cr(VI) in the oral mucosa of Big Blue(R) transgenic F344 rats. Environ Mol Mutagen. 56 (7), 621-628 (2015).
  75. Wang, J., Liu, X., Heflich, R. H., Chen, T. Time course of cII gene mutant manifestation in the liver, spleen, and bone marrow of N-ethyl-N-nitrosourea-treated Big Blue transgenic mice. Toxicol Sci. 82 (1), 124-128 (2004).
  76. LeBlanc, G. A., Bain, L. J. Chronic toxicity of environmental contaminants: sentinels and biomarkers. Environ Health Perspect. 105, Suppl 1. 65-80 (1997).
  77. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28 (11), 2253-2261 (2007).
  78. Besaratinia, A., Pfeifer, G. P. Second-hand smoke and human lung cancer. Lancet Oncol. 9 (7), 657-666 (2008).

Tags

אימונולוגיה זיהום בעיה 134 Bacteriophage cII Transgene מתחלקים Fibroblasts העכבר EMF מוטציה הסעות וקטור
למדא בחר <em>cII</em> מערכת איתור מוטציה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Besaratinia, A., Tommasi, S. The… More

Besaratinia, A., Tommasi, S. The Lambda Select cII Mutation Detection System. J. Vis. Exp. (134), e57510, doi:10.3791/57510 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter