Summary
Consegna di droga locale a ghiandole sottomandibolari è di interesse nella biologia della ghiandola salivaria comprensione e per lo sviluppo di nuove terapie. Vi presentiamo un protocollo di iniezione retroductal aggiornate e dettagliate, progettato per migliorare la precisione nella consegna e riproducibilità sperimentale. L'applicazione presentata qui è la consegna di nanoparticelle polimeriche.
Abstract
Due obiettivi comuni di terapeutica della ghiandola salivaria sono la prevenzione e la cura di disfunzione del tessuto seguendo uno autoimmuni o ferita di radiazione. Formulando localmente i composti bioattivi per le ghiandole salivari, le maggiori concentrazioni di tessuto possono essere raggiunto in modo sicuro contro l'amministrazione sistemica. Inoltre, fuori tessuto bersaglio effetti da extra-ghiandolare accumulo di materiale possono essere drasticamente ridotto. A questo proposito, iniezione di retroductal è un metodo ampiamente usato per lo studio sia della ghiandola salivaria biologia e fisiopatologia. Retroductal la somministrazione di fattori di crescita, cellule primarie, vettori adenovirali e farmaci piccola molecola ha dimostrata di sostenere la funzione della ghiandola nella regolazione della ferita. Precedentemente abbiamo indicato l'efficacia di una strategia di nanoparticelle-siRNA retroductally iniettato per mantenere la funzione della ghiandola dopo l'irradiazione. Qui, un metodo altamente efficace e riproducibile per amministrare i nanomateriali alla ghiandola sottomandibolare murina attraverso il dotto di Wharton è dettagliato (Figura 1). Descriviamo l'accesso alla cavità orale e delineare i passaggi necessari per dotto di Wharton cannulate, con ulteriori osservazioni che funge da controllo di qualità durante tutta la procedura.
Introduction
Disfunzione della ghiandola salivaria ha molte eziologie, compreso la sindrome di Sjögren, una perdita mediata autoimmune del tessuto secretivo funzionale e indotta da radiazioni hyposalivation (RIH), un comune sequella di testa e collo cancro radioterapia1. Perdita di funzione salivaria a causa di una delle due condizioni predispone gli individui ad infezione orale e sistemica, carie dentaria, disfunzione digestiva e della deglutizione, danno di discorso e depressione maggiore1,2,3. Di conseguenza, qualità della vita significativamente soffre, con interventi limitati alla palliazione dei sintomi piuttosto che curare4. Per studiare nuove terapie in vivo, è di interesse per l'amministrazione di composti bioattivi direttamente alla ghiandola salivare.
Iniezione di Retroductal è un metodo importante per fornire composti bioattivi direttamente per le ghiandole salivari e verificare l'efficacia nella malattia, ferita, o sotto l'omeostasi normale del tessuto. Sono tre ghiandole salivari maggiori parotide (PG), la sottomandibolare (SMG) e sublingual (SLG), tutti di cui vuoto nella cavità orale attraverso dotti escretori. L'anatomia della murino SMG consente accesso diretto attraverso l'incannulamento del dotto di Wharton, situato nel pavimento della bocca sotto la lingua5. Seguito all'inserimento di una canula, solvatato farmaci può essere somministrato direttamente al SMG. A seguito della consegna retroductal, diffusione extra-ghiandolare è limitato alla capsula di tessuto circostante che regola lo scambio di materiale con le circostanti strutture6. il SMG e le relative condutture sono strutturati allo stesso modo negli esseri umani e abitualmente si accede durante il SMG chirurgia e sialoendoscopy7. Negli esseri umani e topi, il PG è similarmente raggiungibile tramite dotto di Stensen nella mucosa orale8.
In modelli murini di RIH, SMG retroductal iniezione è stata usata per fornire terapie anche fattori di crescita, cellule primarie, vettori adenovirali, citochine e composti antiossidanti di modulare la risposta cellulare al danno e ridurre il risultante tessuto danno5,9,10,11,12,13,14,15,16. Il più notevole successo clinico dell'iniezione di retroductal è la somministrazione di vettore adenovirale alla diretta espressione di un canale di acqua (Acquaporina 1; AQP1) in pazienti dopo la radiazione per testa e collo cancro17.
In precedenza, abbiamo sviluppato e dimostrato l'efficacia di un sistema di nanoparticelle polimeriche-siRNA retroductally iniettato per proteggere la funzione della ghiandola salivaria da RIH11,18,19,20. Come un'estensione del nostro lavoro passato, qui, dimostriamo il nostro protocollo per l'iniezione di SMG retroductal utilizzando una nanoparticella fluorescente contrassegnata (NP) in grado di caricamento e di trasporto altrimenti scarsamente solubili farmaci21,22, 23.
Abbiamo sintetizzato il NP da un copolimero diblock composto da poli (stirolo-alt-idrazide anhydride)-b-poly(styrene) (PSMA) attraverso polimerizzazione per addizione reversibile catena frammentazione (zattera), come descritto in precedenza21. Attraverso cambio solvente, questi polimeri spontaneamente auto-assemblarsi in strutture NP micella con un idrofobo interni e idrofilo esterno21. La NPs sono etichettati con Texas-Red fluoroforo per consentire la verifica della consegna NP nelle ghiandole senza sacrificare l'animale. Animali immagini dal vivo e immunohistochemistry SMG è mostrato a 1 h e 1 giorno dopo l'iniezione.
Questo aggiornamento e protocollo di inserimento di una canula riproducibile dovrebbe consentire ad altri di raggiungere retroductal iniezione. Ci aspettiamo che questa raffinata tecnica diventerà fondamentale per gli studi in vivo e sviluppo terapeutico24,25.
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Protocol
Tutte le procedure in vivo descritte di seguito sono state approvate dal Comitato Università sulle risorse animali presso l'Università di Rochester, Rochester, NY.
1. preparazione
- Utilizzando tubi di 32G catetere intracranico con inserto in filo, tagliare 3 cm del tubo per formare un'estremità smussata, circa 45° rispetto all'asse maggiore. Confermare che il filo sia almeno 1 cm più lungo rispetto al tubo.
- Caricare 50 µ l di soluzione di nanoparticelle PSMA (Figura 1), o altro materiale di iniezione, in una siringa di Hamilton. Per ridurre la probabilità del barotrauma durante l'iniezione, collegare il tubo del catetere, con il mandrino rimosso, alla siringa ed espellere il volume morto.
- Ispezionare la soluzione di iniezione per assicurarsi che la nanoparticella è completamente solvatati per evitare l'ostruzione duttale dopo la somministrazione.
- Preparare la soluzione di atropina a 0,1 mg/mL.
Nota: Poiché l'atropina è sensibile alla luce e si degrada nel tempo, questa soluzione dovrebbe essere fatta il giorno dell'iniezione e al riparo dalla luce fino a quando somministrato.
2. accesso e visualizzazione Ductal punto di ingresso
- Pesare topi C57/BL6 utilizzando una bilancia analitica.
- Usando una siringa da 0,5 mL con ago 29 x ½", anestetizzare i topi con una soluzione salina sterile intraperitonealmente iniettato di 100 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina. Procedere con il passaggio seguente quando il mouse non risponde agli stimoli, che generalmente si verifica entro 5-10 min dopo l'iniezione.
Nota: Questa procedura può essere eseguita anche sotto isoflurano, ma richiederà un cono di naso personalizzato che consente l'accesso alla cavità orale. - Per prevenire la secchezza durante la procedura, applicare il lubrificante per gli occhi e posizionare il mouse in posizione prona su un palco personalizzato.
Nota: Per mantenere condizioni adeguate per fase intra-orale, strumenti dovrebbero essere disinfettati o sterilizzati prima di ogni utilizzo. - Aprire la cavità orale proteggendo gli incisivi maxillary sopra una trave metallica e utilizzare una fascia elastica per tendere verso il basso dietro gli incisivi mandibolari (Figura 2A).
- Allineare il mouse sotto il microscopio per dissezione in modo tale che la base della mascella è visualizzata.
- Utilizzare un retrattore in acciaio personalizzato, curvo per applicare tensione bilateralmente al mucosa orale per allargare la bocca.
- Per visualizzare i papillae sottomandibolari, afferrare e sollevare delicatamente la linguetta dal pavimento della bocca usando il forcipe smussato.
Nota: Le papille verranno visualizzato come due sporgenze pallidi sotto la lingua (Figura 2B). - Per facilitare la visualizzazione e l'ulteriore manipolazione all'interno della cavità orale, posizionare il cotone tra la lingua e la mucosa buccale.
3. inserimento di una canula ductal e posizionamento della linea
- Usando bene, pinzetta, afferrare tubo catetere con l'inserto di filo. Per un controllo manuale ottimale durante l'inserimento di una canula, allineare il tubo con la curvatura delle pinze (Figura 3A).
- Uso del microscopio per dissezione, spostare il forcipe e filo nel campo di vista.
Nota: Il cavo deve essere sporgenti dal tubo. - Applicare una leggera pressione nella base di una papilla sottomandibolare con il filo da incasso per produrre una piccola, superficiale, mucosa puntura (0,076 mm di diametro) che faciliterà il successivo ingresso del tubo del catetere (0,25 mm di diametro). Se si incontra resistenza, taglio smussati freschi suggerimenti su entrambi i tubi e inserto in filo con le forbici per dissezione tagliente.
- A seguito dell'entrata, ritirare il mandrino e, utilizzando il microscopio per dissezione, confermano la presenza di saliva al sito di puntura. Evitare movimenti improvvisi o forti (ritiro o inserimento) del mandrino che può causare sanguinamento o compromettere l'integrità ductal.
- Retrarre il mandrino all'interno della tubazione (Figura 3B).
- Per garantire che i tubi di iniezione rientrerà nel dotto di Wharton di apertura, inserire tubi contenenti il mandrino come una guida rigida nella puntura fatta in precedenza (Figura 2 C).
Nota: Se non eseguite rapidamente, gonfiore locale può impedire il re-inserimento. - Per evitare la contropressione da prolungata ostruzione duttale, ritirare il tubo. Ispezionare per verificare che un'apertura, visibile al microscopio, può essere visto nel papilla sottomandibolare. Caso di sanguinamento visibile, rimuovere il mandrino e tentare di nuovo a partire da punto 3.2 papillae sottomandibolari avversari.
- Senza spostare il mouse, somministrare l'iniezione intraperitoneale di soluzione di atropina 1 mg/kg, per ridurre la salivazione durante la procedura. Attendere 5-10 min.
- Afferrare l'estremità del tubo siringa e inserire l'orifizio utilizzando il microscopio per dissezione (Figura 3). Se si incontra resistenza, tagliare un'estremità smussata fresca alla tubazione e tentare nuovamente.
- Una volta che il tubo è posto all'interno della papilla sottomandibolare, far avanzare lentamente 3-5 mm nel condotto. Rilasciare il tubo dal forcipe.
- Per migliorare la tenuta tra il tubo e la papilla sottomandibolare, asciugare l'interfaccia tamponando delicatamente con una garza per 1 min.
- Verificare che la posizione del tubo non è spostata durante l'asciugatura.
4. iniezione
- Iniettare il materiale ad un tasso di 10 µ l/min Inspect per confermare che il mouse rimane sedato e non mostra segni di afflizione (Figura 2D).
Nota: Le iniezioni di 15-50 µ l sono ben tollerate. Iniezione di grandi volumi può causare barotrauma. - Dopo l'iniezione, mantenere la pressione di siringa per 5 min migliorare la ritenzione del materiale all'interno del dotto di Wharton e SMG (Figura 4). Ispezionare la papilla sottomandibolare periodicamente per assicurarsi che la tubazione non uscire l'orifizio ductal.
- Utilizzando una pinzetta, afferrare ed estrarre delicatamente il tubo da papillae sottomandibolari.
Nota: È normale osservare qualche uscita fluido dalle papille. - Rimuovere il riavvolgitore e cotone dalla cavità orale prima di spostare il mouse dal palco.
Nota: L'animale non deve essere lasciato incustodito fino a quando ha riacquistato coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale. Inoltre, assicurarsi che il mouse non si trova con altri topi fino a completamente recuperato.
5. Verifica e analisi
Nota: Un in vivo Imaging System (IVIS) può essere utilizzato per valutare il mantenimento delle nanoparticelle fluorescente identificate dopo l'iniezione (come mostrato in 1h e 24 h dopo l'iniezione nella Figura 5).
- Per visualizzare meglio il segnale fluorescente all'interno del SMG attraverso la pelle, rimuovere il pelo ventrale che ricopre il SMGs rasatura o utilizzando un depilatori chimico.
Nota: A seguito di eutanasia, SMG tessuto può anche essere raccolto, fisso (pernottamento in 4% paraformaldeide) e macchiato usando immunohistochemistry per confermare la persistenza di NP fluorescente contrassegnati un giorno dopo l'iniezione (Figura 6).
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Representative Results
Iniezione di Retroductal può essere utilizzato per amministrare NPs per il SMG murino (Figura 1). Qui, noi consegniamo 50 µ g PSMA NPs etichettato con Texas Red fluorophore.
Corretto posizionamento del mouse permette facile accesso e la visualizzazione del pavimento della bocca (Figura 2A-B). I papillae sottomandibolari sono identificati come due sporgenze carnose sotto la lingua. Dopo l'inserimento di una canula (Figura 2) e l'iniezione di atropina, siringa possa essere inserito in papillae sottomandibolari (Figura 2D).
Per facilitare l'inserimento di una canula, una piccola puntura nel papilla sottomandibolare in primo luogo viene effettuata utilizzando il mandrino di filo all'interno il tubo del catetere (Figura 3A). Una volta fatto questo, il mandrino dovrebbe essere retratti all'interno del tubo di servire come una guida rigida, mentre una maggiore apertura è fatto (Figura 3B). Il mandrino ha un diametro di 0,076 mm, mentre il tubo del catetere ha un diametro esterno di 0,25 mm. In seguito alla creazione di questa grande apertura, il catetere pre-caricato della tubazione, fissato alla siringa di iniezione, può poi guidato nell'orifizio duttale (Figura 3).
Dopo l'iniezione, si raccomanda che la siringa essere immobilizzato e iniezione pressione mantenuta. Se non viene applicata la pressione, consegna sarà successo, seppur con meno efficienza e riproducibilità. Questo è dimostrato da iniettare 50 µ l di colorante blu di toluidina 1% bilateralmente e osservando la macchiatura più debole nella ghiandola senza pressione mantenuta dopo l'iniezione (Figura 4).
Per verificare la consegna di NP, IVIS può essere utilizzato per rilevare il segnale fluorescente all'interno del mouse, che è lateralizzato all'amministrazione di post di regione iniettato 1 h (Figura 5). Questo approccio consente la conferma senza eutanasia il mouse e può essere continuato longitudinalmente fino a quando il segnale non è più rilevabile26,27.
Per confermare la persistenza di NP nella SMG 24 h dopo l'iniezione, ghiandole possono essere sezionati e visualizzati da formazione immagine di fluorescenza. Aqp5 e Krt5 IHC contrassegnare le cellule secretorie e ductal di SMG, rispettivamente e mostrare NPs in entrambi i comparti (Figura 6).
Figura 1 . Retrogrado iniezione schematico. A seguito di inserimento di una canula ductal e posizionamento della siringa, 50 µ l di soluzione polimerica di NP 1 mg/mL viene iniettato il SMG. Micrografo elettronico rappresentante trasmissione (TEM) Mostra monodisperse (indice di polidispersione = 0,2) popolazione NP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Retrogrado passaggi iniezione. (A) accedere alla cavità orale separando gli incisivi maxillary e mandibular. (B) visualizzare le papille (boxed) sotto la lingua al pavimento della bocca, che segnano il percorso del dotto di Wharton. (C) utilizzando un catetere con inserto in filo, incannulare delicatamente la base della papilla sottomandibolare. (D) a seguito di inserimento di una canula, il tubo del catetere può essere scambiato con siringa Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Efficace posizionamento del catetere e il mandrino per incannulamento del dotto di Wharton. (A) allineare il tubo con la curvatura delle pinze e tagliare un'estremità smussata sul tubo e filo per perforare inizialmente la papilla sublinguale. (B) retrarre il mandrino all'interno il tubo per fare una guida rigida per inserire il tubo all'interno della papilla sublinguale. (C) inserire il tubo del catetere (mandrino rimosso), Unito alla siringa di iniezione, all'interno dell'orifizio precedentemente fatta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Mantenimento di pressioni successive siringa iniezione migliora la ritenzione del materiale. A seguito di iniezioni di retroductal di 50 µ l di blu di toluidina 1%, pressione di siringa o è stata mantenuta per 5 min (diritto SMG - prima iniezione) o la siringa è stata ritirata immediatamente dopo l'iniezione (sinistra SMG - seconda iniezione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Conferma di retroductal NP consegna post iniezione. (A) In vivo Imaging System (IVIS) dimostra la lateralizzazione del segnale fluorescente rosso per il lato (sinistro) trattato dell'iniezione del mouse 1h post. (B) segnale di NP IVIS a 24 h è diminuito significativamente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Conferma di retroductal NP persistenza 24 h dopo l'iniezione. A, C. Controllo uninjected SMG macchiato per Aqp5 e Krt5, marcatura di cellule acinose e duttali secretive, rispettivamente. B, D. In retroductal NP iniettato SMG, Aqp5 e Krt5 macchie appaiono ghiandola normale morfologia e NPs preso in acini e dotti (scala bar: 75 µm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Retroductal iniezione è fondamentale per la consegna di droga localizzata alla ghiandola salivare. Questa tecnica ha applicazioni nella selezione di agenti terapeutici per condizioni tra cui la sindrome di Sjogren e RIH9,10,28. Consegna della droga diretta in SMG mediante iniezione di retroductal fornisce un vantaggio chiave rispetto alla somministrazione sistemica nelle sue potenzialità per ridurre gli effetti di fuori bersaglio, compreso l'attivazione immune11. La capacità di massimizzare la consegna di droga locale, senza accumulo nei tessuti circostanti può abilitare anche testing terapeutico in una vasta gamma di dose che potrebbe essere realizzato a livello sistemico.
Presentiamo questo protocollo, con qualità e risoluzione dei problemi controllare passaggi, come un metodo dettagliato e aggiornato per fornire polimerici nanomateriali attraverso il dotto di Wharton a murino SMG20. Ad esempio, uso corretto di una filo guida facilita il posizionamento di cannula. Inoltre, utilizzando il pulsante macchiare asciutto invece Colle cianoacrilati per tenere la cannula in posizione durante l'iniezione, il rischio di trauma mucoso è minimizzato. Questo metodo può essere utilizzato per il trattamento di topi con una gamma di compound e possa essere eseguito nel corso di più giorni con lo stesso mouse per valutare un timecourse di altre somministrazioni11.
Secrezione della ghiandola normale fornirà un meccanismo di clearance semplice e diretto per payload in eccesso, anche se questa strategia dovrebbe essere ottimizzata per applicazioni diverse da un'attenta selezione di sostanza iniettata e titolazione del dosaggio di atropina. In questo caso, NPs persistono nel SMG per almeno 24 h. Utilizzando dei criteri di rete in grado di caricamento di droga o simili nanomateriali, applicazioni future di questo lavoro includono superando il limite di solubilità che altrimenti impedirebbero test agenti idrofobi con retroductal iniezione20,21.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dal National Institute of Dental e Craniofacial Research (NIDCR) e il National Cancer Institute (NCI) dei National Institutes of Health, sotto Premio numero R56 DE025098, UG3 DE027695 e F30 CA206296. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Quest'opera fu appoggiata anche dalla NSF DMR 1206219 e l'innovazione di IADR in Oral Care Award (2016).
Vorremmo ringraziare Jayne Gavrity per la sua assistenza nell'esecuzione di esperimenti IVIS. Vorremmo ringraziare Karen Bentley per il suo ingresso e assistenza nell'esecuzione di EM. Vorremmo ringraziare Weng Pei-Lun per la sua assistenza con IHC. Vorremmo ringraziare Matthew Ingalls per la sua assistenza nella preparazione di figura. Vorremmo ringraziare Dr. Elaine Smolock ed Emily Wu per la lettura critica di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
References
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