Summary
यहां, हम murine त्वचा में एजेंटों को बढ़ावा देने पारगम्यता के intradermal प्रशासन द्वारा प्रेरित संवहनी रिसाव को मापने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । इस तकनीक को बढ़ावा देने या संवहनी रिसाव को बाधित या आणविक तंत्र है कि संवहनी पारगम्यता को विनियमित अध्ययन करने के लिए अणुओं की क्षमता का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
संवहनी endothelium के प्राथमिक समारोह हड्डीवाला जीवों में रक्त और शरीर के प्रत्येक ऊतक के बीच एक बाधा के रूप में सेवा करने के लिए, जिससे रक्त कोशिकाओं के लिए endothelium की पारगम्यता, प्लाज्मा अणुओं, और पानी के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है शारीरिक जरूरत है । कुछ रोगों में, साइटोकिंस और विकास कारकों जारी कर रहे है कि लक्ष्य endothelial बाधा क्षणिक नाड़ी पारगम्यता बढ़ाने के लिए; हालांकि, उनके लंबे समय तक उपस्थिति पुरानी संवहनी hyperpermeability और इस तरह ऊतक-हानिकारक सूजन का कारण हो सकता है । मीलों परख vivo तकनीक है कि शोधकर्ताओं संवहनी रिसाव की प्रॉक्सी माप के माध्यम से संवहनी hyperpermeability अध्ययन करने की अनुमति देता में एक है । यहां, हम कैसे माउस, जो सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया मॉडल जीव स्तनधारी फिजियोलॉजी और विकृति विज्ञान में अध्ययन करने के लिए है इस प्रक्रिया में प्रदर्शन करने पर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । प्रक्रिया इवांस ब्लू डाई के नसों में इंजेक्शन के लिए परिसंचारी एल्ब्युमिन लेबल के कई intradermal इंजेक्शन पारगम्यता उत्प्रेरण एजेंटों और वाहन नियंत्रण समाधान का विरोध करने में माउस की पार्श्वों के द्वारा पीछा शामिल है । नतीजतन, इवांस ब्लू डाई धीरे-dermis, जहां यह जमा हो जाती है और वाहन के लिए रिश्तेदार पारगम्यता उत्प्रेरण एजेंट द्वारा प्रेरित रिसाव के रूप में ठहराव के लिए निकाला जा सकता है में लीक । मीलों परख जंगली प्रकार या आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल में प्रदर्शन किया जा सकता है और दवा प्रशासन के साथ संयुक्त किया जा सकता है आणविक तंत्र है कि संवहनी पारगम्यता को विनियमित और एजेंटों की पहचान के अध्ययन के लिए/ hyperpermeability ।
Introduction
हृदय प्रणाली के प्राथमिक समारोह में सभी अंगों में परिसंचरण और ऊतकों के बीच गैसों, पोषक तत्वों, और अपशिष्ट उत्पादों के हस्तांतरण को सक्षम करने के लिए है । रक्त वाहिकाओं के अंग है बेसल पारगम्यता के विशेष स्तर ऐसे बाजारों की अनुमति1. उदाहरण के लिए, गुर्दे में रक्त वाहिकाओं अत्यधिक पारगंय हैं, whilst रक्त मस्तिष्क बाधा रूपों एक तंग, अत्यधिक अभेद्य इंटरफेस2,3,4. रक्त वाहिकाओं के भीतरी अस्तर फार्म endothelial कोशिकाओं परिसंचरण और अंतर्निहित ऊतकों और एक अंग विशेष तरीके से संवहनी पारगम्यता को विनियमित के बीच एक शारीरिक बाधा प्रदान करते हैं । हालांकि, कुछ उत्तेजनाओं endothelial बाधा के एक आंशिक टूट कारण बेसल स्तर1के ऊपर interstitium में संचलन से द्रव extravasation वृद्धि हुई है । इस तरह के hyperpermeability मनाया जाता है, उदाहरण के लिए, ऊतक आघात की साइटों पर, सूजन में, ट्यूमर में, पूति के दौरान, आंखों में neovascular रोग के साथ या मस्तिष्क और दिल, जब ऊतक ischemia एक स्ट्रोक या रोधगलन के कारण होता है, क्रमशः 5 , 6 , 7 , 8. जब लंबे समय तक ऊंचा, hyperpermeability सूजन की ओर जाता है, जो बारी में इस तरह के नेत्र रोग9में दृष्टि के नुकसान के रूप में ऊतक क्षति, का कारण बनता है । इस प्रकार, नाड़ी hyperpermeability प्रतिक्रिया मॉडलिंग तंत्र है कि वृद्धि endothelial पारगम्यता को समझने के लिए और इस को बाधित करने के लिए डिज़ाइन एजेंटों की प्रभावकारिता परीक्षण करने के लिए वांछनीय है.
मील परख एक अच्छी तरह से स्थापित, सामांयतः इस्तेमाल किया और अपेक्षाकृत सरल तकनीक है कि संवहनी hyperpermeability के एक किराए की माप के रूप में vivo में संवहनी रिसाव उपाय । हालांकि यह ध्यान में नहीं ले कारक है कि संवहनी रिसाव में वृद्धि हो सकती है endothelial बाधा विनियमन के स्वतंत्र रूप से, ऐसे रक्तचाप या रक्त प्रवाह के रूप में, मीलों परख आम तौर पर एक विश्वसनीय विधि का मूल्यांकन करने के लिए प्रदान करने के लिए सोचा है पदार्थों की पारगम्यता नियमन गतिविधि और संकेत मध्यस्थों कि उनकी गतिविधि को बढ़ावा देने की पहचान. तदनुसार, मील परख गया है कई अध्ययनों से अभिन्न है कि संवहनी hyperpermeability के मध्यस्थों की पहचान की है और उनके कार्रवाई के तंत्र10,11,12,13, 14,15, जैसे संवहनी endothelial वृद्धि कारक वीईजीएफ़-एक है कि मूल रूप से संवहनी पारगम्यता कारक के रूप में पहचाना गया था वीपीएफ16.
मूल रूप से मील और मील द्वारा विकसित गिनी सूअरों में संवहनी पारगम्यता का अध्ययन करने के लिए17, उनके परख बाद में चूहों का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जो अब स्पष्ट नाड़ी पारगम्यता के आणविक तंत्र को पसंद का मॉडल जीव आनुवंशिक हेरफेर करने के लिए उनके उत्तम उपयुक्तता के कारण विनियमन । संक्षेप में, इवांस ब्लू डाई नसों से वयस्क चूहों में इंजेक्शन है और 30 मिनट (चित्रा 1) के लिए प्रसारित करने की अनुमति दी । पारगम्यता-उत्प्रेरण एजेंटों बनाम वाहन नियंत्रण तो intradermally संवहनी रिसाव प्रेरित करने के लिए माउस की पार्श्वों का विरोध करने पर कई साइटों में इंजेक्शन रहे हैं (चित्रा 1). नतीजतन, एल्ब्युमिन-बाउंड इवांस ब्लू डाई extravasates और dermis (चित्रा 1) में जमा । humanely मुर्गियों माउस के बाद, इवांस ब्लू dermis से निकाला जाता है और संवहनी रिसाव का स्तर परीक्षण पदार्थ के अनुपात के रूप में गणना-वाहन-प्रेरित ऑप्टिकल घनत्व (चित्रा 2) के लिए ।
Protocol
सभी पशु काम ब्रिटेन गृह कार्यालय और संस्थागत पशु कल्याण और नैतिक समीक्षा शारीरिक (AWERB) दिशा निर्देशों के बाद किया गया ।
1. माउस तैयारी
नोट: वयस्क चूहों पर प्रयोग करने की उम्र से कम 8 सप्ताह, उम्र के 6 महीने के लिए प्रदर्शन. विभिंन जानवरों के बीच इस प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के लिए तकनीकी reproducibility और सुसंगत समय प्रदर्शित करने के लिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक सत्र के लिए 2 और अधिकतम 6 चूहों का उपयोग करें । आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों में एक पारगम्यता उत्प्रेरण पदार्थ पर एक उत्परिवर्तन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, आदर्श रूप में, प्रयोग के अनुसार 2 उत्परिवर्ती चूहों और 2 littermate नियंत्रण का उपयोग करें ।
- 24 एच संवहनी hyperpermeability उत्तेजक, anesthetize चूहों ऐसे isoflurane के रूप में एक उपयुक्त साँस लेना संवेदनाहारी का उपयोग करने से पहले. लेकन पलटा खो दिया है जब तक संज्ञाहरण प्रेरण के लिए 3% isoflurane का प्रयोग करें और माउस बाहरी उत्तेजनाओं के लिए अप्रतिसादी है । संज्ञाहरण रखरखाव के लिए १.५% isoflurane का प्रयोग करें (सुनिश्चित करें कि माउस लगातार श्वसन दर है) । संज्ञाहरण के तहत, ध्यान से एक बिजली की शेविंग के साथ प्रत्येक माउस के दोनों पार्श्वों दाढ़ी, त्वचा के लिए चोटों से परहेज ।
नोट: संज्ञाहरण जानवर को तनाव के कारण से बचने के लिए और शेविंग के दौरान आंदोलन को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है, जो त्वचा नुकसान में परिणाम हो सकता है । - अपने घर पिंजरे में मुंडा माउस लौटें । पुरुष चूहों के लिए, प्रत्येक पुरुष एक व्यक्ति पिंजरे में संज्ञाहरण वसूली के बाद लड़ने को रोकने के लिए जगह है और, इसलिए, त्वचा को नुकसान पहुँचाए. मादा चूहों के लिए, उंहें एक समूह में उनके घर पिंजरे में वापस ।
नोट: यदि एक लड़ व्यवहार पिंजरे में पुरुष चूहों के बीच में मनाया जाता है, प्रक्रिया से पहले, 3 दिनों के लिए व्यक्तिगत पिंजरों में उंहें प्रयोग से पहले अलग करने के लिए संभावित त्वचा को चंगा नुकसान की अनुमति । - चूहों की निगरानी जब तक वे चेतना की वसूली (आमतौर पर कुछ ही सेकंड के भीतर) और पिंजरे के चारों ओर कदम (आमतौर पर 1 मिनट के भीतर) ।
2. इवांस ब्लू डाई की नसों में इंजेक्शन
- एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में, हिस्टामिन अवरोध करनेवाला के अलग बाँझ समाधान तैयार pyrilamine maleate (4 µ g/µ l में ०.९% खारा) और इवांस ब्लू डाई (1% डब्ल्यू/वी में ०.९% खारा). एक 22 µm फिल्टर के माध्यम से समाधान गुजर द्वारा निष्फल ।
- एक बाँझ का प्रयोग करें 1 एमएल सिरिंज के साथ एक 30 जी सुई intraperitoneally इंजेक्षन करने के लिए प्रत्येक माउस के साथ 10 µ l pyrilamine maleate समाधान/ग्राम वजन (आंकड़ा 1a). इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए, सबसे पहले, माउस scruff और फिर यह झुकाव इतना है कि सिर जमीन के प्रति निर्देशित है और पेट ऊपर की ओर निर्देशित है । मूत्राशय से टकराने से बचने के लिए midline से दूर पेट के निचले चक्र में सुई ।
नोट: 8 सप्ताह और उंर के 6 महीने के बीच चूहों का वजन आमतौर पर 15 और 30 जी Pyrilamine maleate के बीच पर्वतमाला अंतर्जात हिस्टामिन, जो अंयथा एजेंट के स्वतंत्र रूप से संवहनी रिसाव को बढ़ावा देने के लिए परीक्षण किया जाएगा की रिहाई को बाधित करेगा । - vasodilation को बढ़ावा देने के लिए 10 मिनट के लिए एक ३७ डिग्री सेल्सियस गर्मी चैंबर में माउस प्लेस । वैकल्पिक रूप से, एक उपयुक्त गर्मी लैंप का उपयोग करने के लिए पूंछ पर ध्यान केंद्रित vasodilation को बढ़ावा देने के अगर एक गर्मी लैंप का उपयोग स्थानीय नैतिक दिशा निर्देशों द्वारा अनुमति दी है ।
- एक समय में एक माउस निरोधक को ले जाएं और इंजेक्शन क्षेत्र को साफ करने के लिए ७०% इथेनॉल के साथ पूंछ रगड़ और आगे vasodilation को बढ़ावा देने के ।
- पूंछ नस (आंकड़ा 1b) के माध्यम से नसों में १०० µ एल इवांस ब्लू डाई प्रशासन के लिए एक 30G सुई के साथ एक बाँझ 1 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग करें. तुरंत एक उंगली और खून बह रहा रोकने के अंगूठे के बीच पूंछ पकड़ कर इंजेक्शन साइट के लिए दबाव लागू होते हैं ।
नोट: पूंछ नस के दृश्य इंजेक्शन क्षेत्र के लिए लंप निर्देशन द्वारा सुधार किया जा सकता है । माउस पूंछ नस में नसों में इंजेक्शन प्रदर्शन पर आगे विस्तार से एक प्रकाशित प्रोटोकॉल18में पाया जा सकता है । - डाई 30 मिनट के लिए प्रसारित करने की अनुमति दें ।
3. संवहनी Hyperpermeability को उत्तेजित
- एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में बाँझ समाधान का उपयोग करना, एक एकाग्रता है कि अंतिम खुराक 20 µ एल की मात्रा में दिया जा करने की अनुमति देता करने के लिए ब्याज की पारगम्यता उत्प्रेरण एजेंट पतला
नोट: उदाहरण में 1चित्रा में दिखाया प्रयोग-चित्रा 2, VEGFA में २.५ एनजी/µ एल की एकाग्रता पर नाड़ी hyperpermeability को उत्तेजित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, ५० एनजी की कुल खुराक उपज, और पंजाबियों एक वाहन नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है । - ब्याज की पारगम्यता उत्प्रेरण एजेंट लोड और एक 31 जी सुई के साथ 2 अलग बाँझ ३०० µ l सीरिंज में वाहन नियंत्रण. तपसिल में समाधान के 20 µ l के साथ प्रत्येक माउस सुई करने के लिए पर्याप्त समाधान लोड (यानी, एजेंट और वाहन प्रति माउस के ६० µ एल तैयार, प्लस सुई के मृत मात्रा के लिए खाते के लिए अतिरिक्त मात्रा).
- Anesthetize पहले माउस isoflurane के साथ परीक्षण किया जा करने के लिए (3% संज्ञाहरण प्रेरण के लिए जब तक लेकन पलटा खो दिया है और माउस बाहरी उत्तेजनाओं के लिए अप्रतिसादी है, और संज्ञाहरण रखरखाव के लिए १.५%, सुनिश्चित करें कि माउस लगातार श्वसन दरों है बना).
- Intradermally (चित्रा 1C) माउस के पार्श्व में पारगम्यता को बढ़ावा देने के एजेंट के 20 µ एल इंजेक्षन. सुनिश्चित करें कि सुई त्वचा के लिए 15 डिग्री के कोण पर है । एक सफल इंजेक्शन इंगित करता है जो त्वचा के भीतर एक उठाया बुलबुला के गठन के लिए जाँच करें । दोहराएं 2 अतिरिक्त साइटों पर intradermal इंजेक्शन, एक से कम 1 सेमी के अलावा ।
- 2 पार्श्व बेनकाब और नियंत्रण वाहन समाधान के साथ दोहराने तपसिल इंजेक्शन के लिए माउस बारी । कागज पर रिकार्ड प्रत्येक इंजेक्शन साइट की स्थिति के लिए त्वचा के नमूनों के बाद संग्रह के लिए उनकी पहचान की सुविधा ।
नोट: इस स्तर पर सावधानी के साथ माउस त्वचा संभाल; उदाहरण के लिए, intradermal इंजेक्शन प्रदर्शन करते समय त्वचा चुटकी से बचें । - अपने घर पिंजरे में इंजेक्शन माउस लौटें और माउस की निगरानी जब तक यह चेतना ठीक (आमतौर पर कुछ सेकंड के भीतर) और पिंजरे के आसपास घूमती है ।
- Whilst पहले माउस ठीक करता है, तुरंत दूसरे माउस के साथ कदम ३.३ और ३.५ दोहराएं, और इतने पर (अप करने के लिए 6 सत्र प्रति अधिक से अधिक चूहों) । प्रत्येक माउस के लिए समय है जिस पर बाद में कदम करने के लिए आगे बढ़ने के लिए समायोजित करने के लिए इंजेक्शन था समय का एक रिकॉर्ड रखें ।
4. Dermis के भीतर संचित इवांस नीला का ठहराव
- ग्रीवा विस्थापन द्वारा प्रत्येक माउस चुनना 20 मिन इसके बाद intradermal इंजेक्शन मिला है, उसी क्रम को मनाएगा जिसमें चूहों को इंजेक्शन दिया गया.
नोट: संवहनी रिसाव की अवधि पारगम्यता उत्प्रेरण एजेंट उपयोग के अनुसार भिन्न हो सकते हैं, और, इसलिए, intradermal इंजेक्शन और मुर्गियों के बीच का समय अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. - अपनी पीठ पर प्रत्येक अख़बारों माउस प्लेस और एक काग बोर्ड पर अपने पैरों को पिन एक साफ ऊतक (1 d) के साथ लिपटे ।
- कुंद कैंची का उपयोग करना, मृत माउस की छाती को ऊपर के निचले पेट से लगभग 3-4 सेमी की एक ऊर्ध्वाधर चीरा । संदंश और एक स्केलपेल के साथ, दोनों पार्श्वों से दूर त्वचा को चिढ़ाने के लिए dermis और इवांस नीला संचय (चित्रा 1E) की साइटों के भीतर की ओर प्रकट करते हैं । नीचे ढीला त्वचा पिन और एक स्केलपेल के साथ रिसाव साइट के आसपास के क्षेत्रों से वसा को हटा दें । यदि आवश्यक हो, एक प्रतिनिधि तस्वीर लेने के लिए त्वचा में इवांस ब्लू रिसाव की भयावहता का प्रदर्शन ।
- संदंश और एक स्केलपेल का प्रयोग, उत्पाद शुल्क त्वचा पारगम्यता-उत्प्रेरण एजेंट या वाहन के साथ इंजेक्शन प्रत्येक साइट के लिए लीक इवांस ब्लू डाई शामिल क्षेत्रों.
नोट: उत्पाद करने के लिए ध्यान रखना इसी तरह त्वचा के क्षेत्रों आकार सुनिश्चित करें कि, बाद में कदम ४.७ पर, formamide मात्रा के एक समान भाग प्रत्येक त्वचा के नमूने के द्वारा adsorbed किया जाएगा, निकाले डाई को शेष formamide के एक समान मात्रा में पतला होने की अनुमति . इंजेक्शन नक्शा ३.५ कदम में दर्ज की मदद करेगा क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए उत्पाद है । - एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में एक नमूना प्लेस और तदनुसार यह लेबल, सुनिश्चित करें कि प्रत्येक नमूना ट्यूब के तल पर टिकी हुई है । अधिक उपयोग तक-20 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों की दुकान । यदि तुरंत संसाधन, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें ।
- एक ओवन में खुली ट्यूब या ५५ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक के कुआं में रखकर रातोंरात त्वचा के नमूने सूखी ।
- इवांस नीले रंग निकालने के लिए, एक धुएं हुड में नमूनों के लिए formamide के २५० µ एल जोड़, ट्यूबों बंद करें । सुनिश्चित करें कि त्वचा के नमूनों सभी formamide द्वारा कवर कर रहे है और एक ओवन या ५५ डिग्री सेल्सियस पर एक हीटिंग ब्लॉक में रातोंरात गर्मी ।
- ४० मिनट के लिए अधिक से अधिक गति (> 10, 000 एक्स जी) में एक benchtop केंद्रापसारक में नमूने केंद्रापसारक ।
- एक धुएं के हुड में, एक पारदर्शी, सपाट नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेट (चित्रा 2a) की एक अलग अच्छी तरह से प्रत्येक नमूने से डाई युक्त supernatant के १०० µ एल हस्तांतरण ।
- एक spectrophotometer पर ७४० एनएम के एक संदर्भ पढ़ने के साथ ६२० एनएम पर पीक इवांस नीले अवशोषण उपाय ।
नोट: ६२० एनएम इवांस नीले अवशोषण के शिखर है, whilst ७४० एनएम इवांस ब्लू द्वारा अवशोषित नहीं है और एक संदर्भ तरंग दैर्ध्य के रूप में कार्य करता है । - प्रत्येक माउस के लिए तकनीकी परिवर्तनशीलता (चित्रा b) के लिए खाते में एक ही एजेंट या वाहन के तपसिल इंजेक्शन के अवशोषक रीडिंग का औसत ।
- वाहन नियंत्रण बनाम पारगम्यता-उत्प्रेरण एजेंट से रीडिंग के अंतर की गणना (चित्रा 2c).
Representative Results
हम वीईजीएफ़ की क्षमता का आकलन करने के लिए मील परख का इस्तेमाल किया-एक नाड़ी wildtype C57 में वाहन नियंत्रण (पंजाब) के सापेक्ष रिसाव को प्रेरित/Bl6 चूहों । यहां, हम एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाने के wildtype चूहों का उपयोग कर 20 µ एल समाधान के intradermal इंजेक्शन से युक्त ५० वीईजीएफ़ के एनजी-एक पंजाब या वाहन पंजाबियों में ही । वीईजीएफ़ के साथ इंजेक्शन त्वचा के नमूनों में इवांस ब्लू डाई रिसाव में एक स्पष्ट वृद्धि-एक पंजाब की तुलना में सीटू में स्पष्ट था (चित्रा 1E) और formamide में डाई की निकासी के बाद (चित्रा 2a). कई प्रयोगों के ठहराव कि वीईजीएफ़ के एनजी ५०-एक काफी अकेले पंजाबियों (चित्रा 2 बी) से अधिक इवांस नीले रिसाव लाती है, एक औसत 3-संवहनी रिसाव में वाहन की तुलना में वृद्धि गुना (चित्रा 2c) के साथ ।
चित्रा 1: मील की परख में संवहनी रिसाव की प्रेरण । योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (शीर्ष पैनलों) और इसी छवियों (नीचे पैनल क्रमिक कदम के) जब माउस में मील परख प्रदर्शन । (क) Pyrilamine maleate intraperitoneally इंजेक्शन है अंतर्जात हिस्टामिन की रिहाई को रोकने के लिए 10 से 30 मिनट पहले (ख) १०० µ एल के नसों में इंजेक्शन 1% इवांस नीले माउस की पूंछ नस में. (ग) 30 मिनट बाद, संवहनी रिसाव एजेंट के intradermal इंजेक्शन द्वारा प्रेरित है (५० एनजी के वीईजीएफ़-A; हरे घेरे) बनाम वाहन नियंत्रण (पंजाब, सफेद हलकों)। (डी, ई) इवांस ब्लू संचय के स्थलों का उपयोग करने के लिए, माउस intradermal इंजेक्शन और दोनों पार्श्वों की त्वचा के बाद 20 मिनट के अख़बारों है विदारक और नीचे टिकी हुई है । आईएफसआई: intraperitoneal; i.v.: नसों में; आईडी: intradermal; स्केल बार्स, 1 सेमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: मील की परख में संवहनी रिसाव के ठहराव । (क) इवांस ब्लू डाई त्वचा के नमूनों में से formamide में निकाला जाता है 1 चित्रा में प्रत्येक intradermal इंजेक्शन से प्राप्त की और एक spectrophotometer के साथ अवशोषित पढ़ने के लिए एक ९६ अच्छी तरह से थाली में भरी हुई है । (ख, ग) (ख) दोनों पारगम्यता उत्प्रेरण एजेंट (वीईजीएफ़-A; गहरे हरे घेरे) और वाहन (पंजाब, ग्रे) के सामान्यीकृत अवशोषक मूल्यों (ऑप्टिकल घनत्व, आयुध डिपो) की साजिश रचने के द्वारा कई प्रयोगों से अवशोषक रीडिंग का चित्रमय प्रतिनिधित्व हलकों), या (ग) एजेंट बनाम वाहन के लिए आयुध डिपो में बदलें (त्रुटि सलाखों: SEM) । तपसिल पंजाबियों और वीईजीएफ़ के अवशोषक रीडिंग-एक नमूनों में दिखाया (एक) औसत और सफेद या हरे घेरे के रूप में (बी, सी) में दिखाया गया है, क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
Discussion
१९५२17में अपनी पहली विवरण के बाद से, मीलों परख संवहनी hyperpermeability के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक अपेक्षाकृत जल्दी, सरल, और विश्वसनीय विधि के साथ शोधकर्ताओं ने प्रदान की है । उदाहरण के लिए, मील परख के लिए क्षमता और/या विभिंन एजेंटों की शक्ति का परीक्षण करने के लिए प्रेरित hyperpermeability19,20,21 या hyperpermeability एजेंटों अवरुद्ध8 की प्रभावकारिता का परीक्षण किया गया है ,२२,२३. एक और उदाहरण के रूप में, एजेंटों कि संवहनी पारगम्यता प्रेरित आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों में परीक्षण किया गया है और उनके littermate नियंत्रण ligand प्रेरित hyperpermeability के लिए विशिष्ट रिसेप्टर्स और संकेत transducing प्रोटीन की आवश्यकताओं का निर्धारण करने के लिए प्रतिक्रियाएं10,11,12,13,14,15,20,23। मील परख के कई संशोधित संस्करण के बाद से इस्तेमाल किया गया है, उदाहरण के लिए इस्तेमाल किया अनुरेखक के संबंध में । इस प्रकार, इवांस ब्लू प्रतिदीप्ति के साथ कुछ अध्ययनों में प्रतिस्थापित किया गया है-विभिंन आकारों या 11 microspheres,13के dextrans लेबल ।
नाड़ी hyperpermeability तंत्र की जांच के लिए अंय परख पर मील परख के मुख्य लाभ यह है कि यह अपेक्षाकृत करने के लिए आसान है और महंगा उपकरण की आवश्यकता नहीं है । इसके अलावा, vivo तकनीक में एक के रूप में, इस परख मॉडल बरकरार रक्त वाहिकाओं के संदर्भ में संवहनी रिसाव, के रूप में इन विट्रो परख में के माध्यम से इस तरह के माध्यम से रिसाव को मापने के लिए विरोध अच्छी तरह से प्रवाह परख या ट्रांस endothelial विद्युत प्रतिरोध ( तीळ) परख, जो ध्यान, पूरी तरह से, endothelial monolayer पर । संवहनी hyperpermeability के vivo परख में वैकल्पिक मील परख hyperpermeability-उत्प्रेरण एजेंट के लिए एक अलग वितरण मार्ग का उपयोग करके या विभिंन स्थलों पर संवहनी रिसाव का विश्लेषण करके यहां वर्णित से अलग हो सकता है, के लिए एक एजेंट के प्रणालीगत प्रसव के द्वारा पूंछ फेफड़ों या श्वासनली11,13,15में संवहनी रिसाव परीक्षा के बाद नस के द्वारा उदाहरण । मील परख की एक सीमा है कि कुछ एजेंटों के intradermal इंजेक्शन, सिद्धांत रूप में, यह भी endothelial बाधा व्यवधान के अलावा रक्तचाप और प्रवाह को प्रभावित कर सकते है और इसलिए, नाड़ी पारगम्यता भी परोक्ष रूप से प्रभावित करते हैं । फिर भी, इस परख हाल ही में वीईजीएफ़ द्वारा प्रेरित संवहनी पारगम्यता को मापने के लिए दिखाया गया है-प्रणालीगत रक्तचाप15पर प्रभाव का एक स्वतंत्र. मील परख की एक और सीमा है कि विभिंन ऊतकों में संवहनी बिस्तरों अलग पारगम्यता को बढ़ावा देने के एजेंटों का जवाब हो सकता है, और परिणाम त्वचा में एक मील की दूरी पर परख के साथ प्राप्त कर सकते हैं, इसलिए, नहीं प्रतिनिधि हो सकता है, उदाहरण के लिए, क्या में होता है की फेफड़े या मस्तिष्क ।
पशु की उंर और वजन मील परख में मनाया रिसाव को प्रभावित कर सकते हैं । इन चरों के प्रभाव को कम करने के लिए, शोधकर्ताओं littermates का उपयोग करना चाहिए या इसी तरह आकार और वृद्ध चूहों नियंत्रण के रूप में. जब ब्याज की एक विशेष जीन के लिए माउस म्यूटेंट का आकलन, चूहों एक heterozygous बनाम heterozygous प्रजनन रणनीति और wildtype littermates नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल के माध्यम से उत्पंन किया जाना चाहिए । इसके अलावा, यह isoflurane के रूप में जल्दी प्रतिवर्ती गैस निश्चेतक, का उपयोग करने के लिए सलाह दी जाती है, वाहिकासंकीर्णन से बचने के लिए, जो कुछ संवेदनाहारी आंत्रेतर इंजेक्शन के माध्यम से प्रशासित दवा के लिए वर्णित किया गया है24,25. माउस पार्श्व पूंछ नस में इवांस ब्लू डाई के इंजेक्शन इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है और बहुत प्रयोग और डेटा की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं । इस प्रकार, शोधकर्ताओं पूंछ नस इंजेक्शन प्रदर्शन में सक्षम होना चाहिए और संभावना पहले अनुभव या अभ्यास की आवश्यकता होगी मील परख प्रयोग शुरू करने से पूर्व । वैकल्पिक रूप से, शोधकर्ताओं ने अन्य नसों में उपयोग कर सकते हैं के लिए इवांस नीले, जैसे रेट्रो कक्षीय इंजेक्शन अगर वे इसके साथ अनुभव कर रहे हैं. पारगम्यता को बढ़ावा देने के समाधान के Intradermal इंजेक्शन त्वचा के लिए एजेंट-स्वतंत्र क्षति पैदा कर सकता है । इसलिए, intradermal इंजेक्शन मात्रा में 20 µ एल से अधिक नहीं होना चाहिए, हमेशा हिस्टामिन अवरोधक की उपस्थिति में किया जाना चाहिए और वाहन नियंत्रण इंजेक्शन के लिए सामान्यीकृत.
मील परख कई शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है वीईजीएफ़ के घटकों का मूल्यांकन-एक संकेत मार्ग, उदाहरण के लिए, क्योंकि वीईजीएफ़-एक प्रेरित संवहनी पारगम्यता कैंसर रोगियों में जलोदर का कारण बनता है16 और दृष्टि-बिगड़ती सूजन कई neovascular में नेत्र रोग7. इस प्रकार, हम और दूसरों को मील परख का इस्तेमाल किया है वीईजीएफ़ की तुलना-चूहों कि आनुवंशिक रूप से वीईजीएफ़ के विशिष्ट घटकों की कमी को संशोधित किया गया है में एक प्रेरित संवहनी रिसाव-एक संकेतन झरना12,13,14, 15 , 20 , 23. इस दृष्टिकोण का उपयोग करके हमारे हाल के अध्ययन से पता चला कि मुख्य रोग वीईजीएफ़-एक isoform, VEGF165, VEGFR2 और NRP1, जिसमें NRP1 cytoplasmic डोमेन ABL कळेनासे-मध्यस्थता सक्रियण का एक जटिल के माध्यम से संकेतों के माध्यम से संकेत SRC परिवार kinases एक hyperpermeability प्रतिक्रिया पैदा करने के लिए14। VEGFA भी रक्त वाहिका विकास को बढ़ावा देता है और सकता है, इसलिए, चिकित्सकीय इस्तेमाल के लिए कोरोनरी ऊतकों को रक्त के प्रवाह को बहाल अगर अपनी hyperpermeability गतिविधियों को विशेष रूप से बाधित किया जा सकता है । अनुसंधान elucidating कि वीईजीएफ़ चलाने वाले आणविक तंत्र-संवहनी hyperpermeability की ओर संवहनी endothelial कोशिकाओं की प्रतिक्रियाओं, इसलिए, रास्ते कि चुनिंदा रोग वीईजीएफ़ को बाधित करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है की पहचान-एक प्रेरित शोफ रोगों में, जैसे कैंसर या कोरोनरी नेत्र रोग. मील परख निस्संदेह के लिए एक उपयोगी विधि को underpin इन और कार्यात्मक अध्ययन के कई अंय प्रकार के स्पष्ट आणविक नियामकों और संवहनी hyperpermeability के प्रभाव के लिए जारी रहेगा ।
Disclosures
लेखकों की घोषणा करना कोई परस्पर विरोधी हित नहीं है.
Acknowledgments
हम लौरा देंती, वेलेंटीना के सीनेटर और तकनीकी सहायता के लिए माउस पशुपालन और केमिली Charoy के साथ मदद के लिए नेत्र विज्ञान के UCL संस्थान में जैविक संसाधन इकाई के कर्मचारियों को धंयवाद । यह काम एक चिकित्सा अनुसंधान परिषद अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (श्री N011511/1) सी Ruhrberg और एक ब्रिटिश हार्ट फाउंडेशन J.T. अक्खड़पन के लिए पीएचडी के छात्र (FS/13/59/30649) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
| Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
| Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
| Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
| Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G | BD | 324826 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Mouse restrainer | |||
| Heat chamber | |||
| Hair clippers | |||
| Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
| Scalpal | |||
| Blunt scissor | |||
| Forceps | |||
| Eppendorf tubes | |||
| Heatblock | |||
| Cork board | |||
| Benchtop refrigerated centrifuge | |||
| Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |
References
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