Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um die vaskuläre Leckage induziert durch intradermale Verabreichung von Durchlässigkeit fördern Wirkstoffen in der murinen Haut zu messen. Diese Technik kann verwendet werden, um festzustellen, die Fähigkeit von Molekülen zu fördern bzw. hemmen vaskulären Leckage oder die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die vaskuläre Permeabilität zu regulieren.
Abstract
Die primäre Funktion des Gefäßendothels in vertebrate Organismen ist, dienen als eine Barriere zwischen Blut und jedes Gewebe des Körpers, wobei die Permeabilität des Endothels, Blutzellen und Plasma Makromoleküle Wasser entsprechend angepasst werden kann die physiologische Notwendigkeit. Bei bestimmten Krankheiten werden Zytokine und Wachstumsfaktoren freigesetzt, die auf die endotheliale Barriere um vaskulären Permeabilität vorübergehend zu erhöhen; jedoch kann ihre verlängerte Anwesenheit chronische vaskuläre Hyperpermeability und damit Gewebe beschädigen Ödeme verursachen. Meilen-Assay ist eine in Vivo -Technik, die Forscher, vaskuläre Hyperpermeability durch die Proxy-Messung der vaskulären Leckage zu studieren können. Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Durchführen dieses Verfahrens in der Maus ist die am weitesten verbreitete Modellorganismus Säugetier-Physiologie und Pathologie zu studieren. Das Verfahren beinhaltet die intravenöse Injektion von Evans blau färben, die zirkulierenden Albumin, gefolgt von mehreren intradermale Injektionen von Durchlässigkeit-induzierende Wirkstoffe und Fahrzeug-Control-Lösungen in gegnerischen Flanken der Maus zu kennzeichnen. Infolgedessen Lecks Evans blauen Farbstoff allmählich in die Dermis, wo es sammelt und zur Quantifizierung als Leckage induziert durch die Durchlässigkeit-induzierende Agent bezogen auf das Fahrzeug extrahiert werden kann. Meilen-Assay in Wildtyp durchgeführt werden kann oder genetisch veränderte Mausmodelle und sind kombinierbar mit Medikamentengabe Molekulare Mechanismen zu untersuchen, die vaskuläre Permeabilität zu regulieren und Agenten/Ziele in der Lage, Induktion oder Sperrung zu identifizieren Hyperpermeability.
Introduction
Die primäre Funktion des Herz-Kreislauf-Systems soll die Übertragung von Gasen, Nährstoffe und Abfallprodukte zwischen der Zirkulation und Gewebe in allen Organen zu ermöglichen. Blutgefäße haben organspezifischen basale Durchlässigkeit für solchen Austausch1zu ermöglichen. Zum Beispiel sind die Blutgefäße in der Niere hochpermeablen, während die Blut-Hirn-Schranke eine enge, sehr undurchdringliche Oberfläche2,3,4 bildet. Die Endothelzellen, die die innere Auskleidung der Blutgefäße bilden bieten eine physische Barriere zwischen dem Blutkreislauf und darunter liegende Gewebe und vaskulären Permeabilität in Organ-spezifische Weise zu regulieren. Jedoch führen bestimmte Reize eine partielle Aufschlüsselung der endotheliale Barriere um das Fluid Extravasation aus dem Kreislauf in das Interstitium über den basalen Ebenen1zu erhöhen. Solche Hyperpermeability ist zum Beispiel beobachtet, an Standorten von Gewebetrauma, bei Entzündungen, Tumoren, bei Sepsis, in Augen mit neovaskulären Krankheit oder im Gehirn und im Herzen, tritt Gewebe Ischämie durch einen Schlaganfall oder einen Herzinfarkt, bzw. 5 , 6 , 7 , 8. wenn chronisch erhöht, Hyperpermeability führt zu Ödem, wodurch wiederum Gewebeschäden, z. B. Verlust der Sehkraft im Auge Krankheit9. Modellierung der vaskulären Hyperpermeability Antwort ist also wünschenswert für das Verständnis der Mechanismen, die endotheliale Durchlässigkeit zu erhöhen und die Wirksamkeit der Wirkstoffe entwickelt, um dies zu hemmen zu testen.
Die Meilen-Assay ist eine gut etablierte, häufig verwendete und relativ einfache Technik, die vaskuläre Leckage in Vivo als Surrogat Maß für vaskuläre Hyperpermeability misst. Obwohl es nicht berücksichtigen ist Compoundierung Faktoren, die vaskuläre Leckage unabhängig von endotheliale Barriere Verordnung, wie Blutdruck oder Durchblutung, erhöhen können die Miles-Assay wird allgemein angenommen, ermöglichen eine zuverlässige Methode zur Bewertung der Durchlässigkeit-Modulation der Aktivität der Substanzen und identifizieren die Signalisierung Vermittler, die ihre Tätigkeit zu fördern. Dementsprechend die Miles-Assay wurde integraler Bestandteil zahlreicher Studien, die Mediatoren der vaskulären Hyperpermeability und ihre Mechanismen der Aktion10,11,12,13, identifiziert haben 14,15, z. B. den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor VEGF-A, wurde ursprünglich als der vaskulären Permeabilität Faktor VPF16identifiziert.
Ursprünglich entwickelt von Meilen und Meilen, vaskulären Permeabilität in Meerschweinchen17zu studieren, war ihre Assay nachträglich angepasst, mit Mäusen, die jetzt den Modellorganismus der Wahl, um die molekulare Mechanismen der vaskulären Permeabilität zu erhellen Verordnung aufgrund ihrer exquisiten Eignung zur Genmanipulation. Kurz, ist Evans blauen Farbstoff intravenös in Erwachsenen Mäusen injiziert und durfte für 30 Minuten (Abbildung 1) zirkulieren. Permeabilität-induzierende Wirkstoffe gegen Fahrzeugkontrolle werden dann mikrodialysemembranen an mehreren Standorten an gegenüberliegenden Flanken der Maus induzieren vaskulären Leck (Abbildung 1) injiziert. Folglich, gebundenen Sie Albumin-Evans blauer Farbstoff extravasates und reichert sich in der Dermis (Abbildung 1). Nach menschlich Keulung der Maus, ist Evans blau aus der Dermis und die Höhe der vaskulären Leck berechnet als Verhältnis der Test Substanz -, Fahrzeug-induzierte optische Dichte (Abbildung 2).
Protocol
Alle tierische Arbeit erfolgte nach UK Home Office und institutionellen Richtlinien für Tierschutz und ethische Bewertung Körper (AWERB).
1. Maus Vorbereitung
Hinweis: Führen Sie Experimente an Erwachsenen Mäusen von mindestens 8 Wochen alt, bis zu 6 Monate alt. Nachweis der technischen Reproduzierbarkeit und konsequente Timing für jeden Schritt dieses Verfahrens zwischen verschiedenen Tieren verwenden Sie mindestens 2 und maximal 6 Mäuse für jede experimentelle Sitzung. Um den Effekt einer Mutation auf einer Durchlässigkeit auslösende Substanz in gentechnisch veränderten Mäusen zu bewerten, im Idealfall verwenden Sie 2 mutierte Mäuse und 2 stellt Steuerelemente pro Experimente.
- 24 h vor dem anregenden vaskuläre Hyperpermeability betäuben Mäuse mit einem geeigneten einatmen wie Isoflurane Narkose. Verwenden Sie 3 % Isofluran für Anästhesie Induktion, bis der aufrichtenden Reflex verloren ist und die Maus auf äußere Reize reagiert. 1,5 % Isofluran für Anästhesie Pflege verwenden (stellen Sie sicher, dass die Maus verfügt über Konstante Atemfrequenz). Rasieren Sie unter Narkose sorgfältig beide Flanken des jede Maus mit einen elektrischen Rasierer, Vermeidung von Verletzungen der Haut.
Hinweis: Anästhesie wird verwendet, um zu vermeiden, verursacht Stress für das Tier und Bewegung während der Rasur, die Hautschäden führen können, zu minimieren. - Die rasierte Maus in seiner Heimat Käfig zurück. Für männliche Mäuse legen jedes Männchen in einen einzelnen Käfig nach Narkose Erholung verhindern kämpfen und somit die Haut zu beschädigen. Kehren sie bei weiblichen Mäusen in einer Gruppe an ihrem Hause Käfig.
Hinweis: Wenn eine Kampf Verhalten unter den männlichen Mäusen im Käfig beobachtet wird vor dem Eingriff, trennen Sie diese in einzelne Käfige für 3 Tage vor dem Test zu möglichen Hautschäden zu heilen zu lassen. - Überwachen Sie die Mäuse, bis sie Bewusstsein (in der Regel innerhalb weniger Sekunden) zu erholen und des Käfigs (in der Regel innerhalb von 1 min. bewegen).
(2) intravenöser Injektion von Evans blau färben
- Bereiten Sie in einem Laminar-Flow Kabinett separate sterile Lösungen von Histamin-Inhibitor Pyrilamine Maleat (4 µg/µL in 0,9 % Kochsalzlösung) und Evans blau färben (1 % w/V in 0,9 % Kochsalzlösung). Sterilisieren Sie, indem man die Lösungen durch ein 22 µm-Filter.
- Verwenden Sie eine sterile 1 mL Spritze mit einer 30 G-Nadel, um intraperitoneal jede Maus mit 10 µL Pyrilamine Maleat Lösung/Gramm Körpergewicht (Abbildung 1A) zu injizieren. Die Injektion, erste, Genick der Maus durchführen und dann zu kippen, so dass der Kopf sich auf den Boden richtet und der Bauch nach oben gerichtet ist. Spritzen Sie in die unteren Quadranten des Abdomens Weg von der Mittellinie zu vermeiden, dass die Blase.
Hinweis: Das Gewicht der Mäuse zwischen 8 Wochen und 6 Monate alt werden in der Regel bewegt sich zwischen 15 und 30 g. Pyrilamine Maleat der Freisetzung von endogenen Histamin zu hemmen, die ansonsten vaskulären Leckage unabhängig von den Agenten zu prüfenden fördern würde. - Platzieren Sie den Mauszeiger in einer Wärmekammer 37 ° C für 10 min Vasodilatation zu fördern. Alternativ können Sie eine passende Wärmelampe konzentrierte sich auf das Heck Vasodilatation zu fördern, wenn die Verwendung einer Wärmelampe durch die lokalen ethischen Richtlinien zulässig ist.
- Eine Maus zu einem Zeitpunkt zu einer Maus Restrainer und reiben Sie die Rute mit 70 % Ethanol, reinigen Sie die Injektion und Vasodilatation weiter zu fördern.
- Verwenden Sie eine sterile 1 mL Spritze mit einer 30G-Nadel 100 µL verwalten Evans blauen Farbstoff intravenös über die Rute Vene (Abbildung 1 b). Sofort Druck auf die Einstichstelle durch halten der Rute zwischen dem Finger und den Daumen, um Blutungen zu verhindern.
Hinweis: Visualisierung der Schweif Vene kann durch die Leitung der Lampenlicht zum Bereich Injektion verbessert werden. In einer veröffentlichten Protokoll18finden Sie weitere Einzelheiten zur Durchführung intravenöser Injektionen in die Vene Maus Schweif. - Lassen Sie den Farbstoff für 30 min zirkulieren.
3. stimulieren Sie vaskuläre Hyperpermeability
- Mit sterilen Lösungen in einem Laminar-Flow Kabinett, verdünnen des Durchlässigkeit-induzierende Agents von Interesse zu einer Konzentration, die die letzte Dosis in einem Volumen von 20 µL geliefert werden kann.
Hinweis: Im Beispiel Experiment gezeigt in der Abbildung 1-Abbildung 2, VEGFA verwendet wird, um vaskuläre Hyperpermeability in einer Konzentration von 2,5 ng/µL in PBS, stimulieren nachgeben einer Gesamtdosis von 50 ng und PBS eine Fahrzeugkontrolle dient als. - Laden Sie die Durchlässigkeit-induzierende Agent des Interesses und der Fahrzeugsteuerung in 2 separate sterile 300 µL Spritzen mit einer 31 G-Nadel. Laden Sie ausreichende Lösung für jede Maus mit 20 µL der Lösung in dreifacher Ausfertigung zu injizieren (d.h. bereiten 60 µL des Agenten und Fahrzeug pro Maus plus zusätzliches Volumen, um die Nadel Totvolumen zu berücksichtigen).
- Betäuben Sie die erste Maus mit Isofluran (3 % für die Induktion der Anästhesie bis aufrichtenden Reflex verloren geht und die Maus auf äußere Reize reagiert und 1,5 % für Anästhesie Pflege, um sicherzustellen, dass die Maus verfügt über Konstante Atemfrequenz) getestet werden.
- Mikrodialysemembranen Spritzen Sie 20 µL des Förderung der Durchlässigkeit Agenten in die Flanke der Maus (Abbildung 1). Stellen Sie sicher, dass die Nadel in einem Winkel von 15° auf der Haut ist. Überprüfen Sie für die Bildung einer erhöhten Blase innerhalb der Haut, die eine erfolgreiche Injektion angibt. Wiederholen Sie die intradermale Injektion 2 zusätzliche Standorte, eine mindestens 1 cm auseinander.
- Schalten Sie die Maus zu entlarven die 2. Flanke und dreifacher Injektionen mit der Kontrolllösung Fahrzeug zu wiederholen. Nehmen Sie Stellung der jede Injektionsstelle zu erleichtern die Identifikation für die anschließende Sammlung von Hautproben auf Papier auf.
Hinweis: Griff die Maus Haut mit Vorsicht in diesem Stadium; vermeiden Sie zum Beispiel die Haut kneifen, wenn intradermale Injektionen durchführen. - Zurückkehren Sie die injizierte Maus zu seinem Hause Käfig und überwachen Sie die Maus zu, bis es kommt wieder zu sich (in der Regel innerhalb von ein paar Sekunden) und bewegt sich um den Käfig.
- Während die ersten Maus erholt, sofort wiederholen Sie die Schritte 3.3 und 3.5 mit der zweiten Maus und so weiter (bis zu 6 Mäuse maximal pro Sitzung). Notieren Sie sich die Zeit, die jede Maus injiziert wurde, passen Sie die Zeit, um zum nächsten Schritt übergehen.
(4) Quantifizierung der kumulierten Evans blau innerhalb der Dermis
- Keulen Sie jede Maus durch zervikale Dislokation 20 min nach Erhalt die intradermale Injektionen, Beobachtung der gleichen Reihenfolge in der die Mäuse injiziert wurden.
Hinweis: Die Dauer der vaskulären Leckage kann je nach der Durchlässigkeit-induzierende Agent verwendet, und daher die Zeit zwischen intradermale Injektion und Keulung ggf. Optimierung. - Jeder Ort gekeult Maus auf seinen Rücken und Pin seine Füße auf einer Pinnwand mit einem sauberen Tuch (Abbildung 1) gewickelt.
- Mit einer stumpfen Schere, machen Sie einen vertikalen Schnitt von ca. 3-4 cm vom unteren Bauch bis an die Brust der Toten Maus. Necken Sie mit Pinzette und Skalpell entfernt die Haut von beiden Flanken, die innere Seite der Dermis und Standorte der Evans blau Akkumulation (Abbildung 1E) zu offenbaren. Festzunageln Sie, die lose Haut und entfernen Sie Fett aus den Regionen rund um die Leckage-Website mit einem Skalpell zu. Falls erforderlich, nehmen Sie ein repräsentatives Foto zeigen das Ausmaß der Evans blau Leckage in die Haut.
- Mit Pinzette und Skalpell, Verbrauchsteuern hautregionen bestehend aus der durchgesickerten Evans blauen Farbstoff für jeden Standort mit der Durchlässigkeit-induzierende Agent oder Fahrzeug injiziert.
Hinweis: Achten Sie darauf, die Verbrauchssteuer ähnlich großen Regionen der Haut um sicherzustellen, dass der nachfolgende Schritt 4.7 ein ähnlicher Teil der Formamid durch jede Hautprobe, so dass die extrahierten Farbstoff in einem ähnlichen Volumen des restlichen Formamid verdünnt werden adsorbiert werden wird . Die Injektion-Karte aufgezeichnet im Schritt 3.5 hilft definieren den Bereich herausgeschnitten werden. - Legen Sie jede Probe in ein 1,5 mL Röhrchen und es entsprechend gekennzeichnet, sicherstellen, dass jede Probe ruht auf den Boden des Röhrchens. Speichern Sie die Proben bei - 20 ° C bis zur weiteren Verwendung. Wenn sofort verarbeiten, folgen Sie den Schritten unten.
- Trocknen Sie die Hautproben über Nacht, indem offene Rohre in einem Ofen oder in den Brunnen der Heizblock bei 55 ° C.
- Evans blauen Farbstoff zu extrahieren, die Proben in einer Dampfhaube 250 µL deionisiertes Formamid hinzugefügt werden, schließen Sie die Rohre. Stellen Sie sicher die Hautproben unterliegen alle der Formamid und inkubieren Sie über Nacht in einem Ofen oder einem Heizblock bei 55 ° C.
- Zentrifugieren Sie Proben in einer Benchtop-Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit (> 10.000 x g) 40 min.
- Übertragen Sie in einer Dampfhaube 100 µL des Überstands Farbstoff-haltigen von jeder Probe in einen separaten Brunnen eine transparente, flacher Boden-96-Well-Platte (Abbildung 2A).
- Maßnahme Peak Evans blau Extinktion bei 620 nm mit einer Referenz-Lesung von 740 nm auf einem Spektrophotometer.
Hinweis: 620 nm ist der Höhepunkt von Evans blau Extinktion, während 740 nm wird nicht von Evans blau absorbiert und wirkt wie eine Referenzwellenlänge. - Durchschnitt der Extinktion Lesungen von dreifacher Injektionen von den gleichen Agenten oder Fahrzeug für jede Maus, um technische Variabilität (Abb. 2 b) zu berücksichtigen.
- Berechnen Sie die Falte Differenz Lesungen von Durchlässigkeit-induzierende Agent versus Fahrzeugkontrolle (Abbildung 2).
Representative Results
Wir verwendet den Miles-Test zur Beurteilung der Fähigkeit von VEGF-A, vaskuläre Leck relativ Fahrzeugkontrolle (PBS) in Wildtyp C57/Bl6 Mäusen zu induzieren. Hier zeigen wir eine repräsentative Experiment mit Wildtyp-Mäusen angeregt mit intradermale Injektion von 20 µL Lösung mit 50 ng von VEGF-A in PBS oder Fahrzeug PBS nur. Eine deutliche Zunahme der Evans blauen Farbstoff Undichtigkeit Hautproben injiziert mit VEGF-A im Vergleich zu PBS war offensichtlich in Situ (Abbildung 1E) und nach der Extraktion des Farbstoffes in Formamid (Abbildung 2A). Quantifizierung von mehreren Experimenten zeigt, dass 50 ng von VEGF-A induziert signifikant mehr Evans blau Leckage als PBS allein (Abb. 2 b), mit einer durchschnittlichen Zunahme 3-fach vaskulären Leckage im Vergleich zum Fahrzeug (Abbildung 2).
Abbildung 1: Induktion von vaskulären Leckage in der Miles-Assay. Schematische Darstellung (Paneele) und entsprechende Bilder (untere Verkleidungen) der sequentielle Schritte bei der Durchführung des Miles-Tests in der Maus. (A) Pyrilamine Maleat ist intraperitoneal zur Vermeidung der Freisetzung von endogenen Histamin 10 bis 30 Minuten vor der (B) intravenöse Injektion von 100 µl 1 % Evans blau in das Heck der Maus Vene injiziert. (C) 30 min später, vaskuläre Leckage wird induziert durch intradermale Injektion des Agenten (50 ng von VEGF-A; grüne Kreise) versus Fahrzeugkontrolle (PBS, weiße Kreise). (D, E) Die Maus ist für den Zugriff auf Websites der Evans blau Akkumulation gekeult 20 Minuten nach der intradermale Injektion und die Haut von beiden Flanken seziert und festgenagelt. i.p.: intraperitoneale; i.v.: intravenös; i.d.: intrakutane; Skalieren Sie Bars, 1 cm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Quantifizierung der vaskulären Leckage in der Miles-Assay. (A) Evans, den blauer Farbstoff in Formamid aus Hautproben jeder intradermale Injektion in Abbildung 1 entnommen und in eine 96-Well-Platte für Absorption mit einem Spektrophotometer lesen geladen extrahiert wird. (B, C) Grafische Darstellung der Extinktion Lesungen aus mehreren Experimenten durch Plotten entweder (B) die normalisierten Absorption Werte (optische Dichte, OD) der beiden Durchlässigkeit-induzierende Agent (VEGF-A; dunkle grüne Kreise) und Fahrzeug (PBS, grau (Kreise), oder (C) die Falte in OD für den Agenten gegen Fahrzeug verändern (Fehlerindikatoren: SEM). Die Extinktion Lesungen der dreifacher PBS und VEGF-A-Proben in (A) gezeigt werden gemittelt und in (B, C) als weiße oder grüne Kreise, bzw. angezeigt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Seit seiner Erstbeschreibung im Jahr 195217hat die Miles-Assay Forscher eine relativ schnelle, einfache und zuverlässige Methode zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der vaskulären Hyperpermeability gegeben. Zum Beispiel wurde die Miles-Assay zur testen die Fähigkeit und/oder Wirksamkeit von verschiedenen Agenten induzieren Hyperpermeability19,20,21 oder testen Sie die Wirksamkeit von Hyperpermeability blockierenden Agenten8 ,22,23. Ein weiteres Beispiel sind Agenten, die vaskuläre Permeabilität führen in genetisch veränderten Mäusen und ihren stellt Steuerelemente zur Ermittlung der Anforderungen an spezifische Rezeptoren und Proteine für Liganden-induzierte Hyperpermeability transducing Signal getestet worden Antworten10,11,12,13,14,15,20,23. Mehrere modifizierte Versionen des Miles Assays haben seit verwendet worden, zum Beispiel in Bezug auf die Tracer verwendet. So wurde Evans Blue in einigen Studien mit Fluoreszenz-markierten Dextrans verschiedener Größen oder Mikrosphären11,13ersetzt.
Der Hauptvorteil des Miles Assays gegenüber anderen Assays für vaskuläre Hyperpermeability Mechanismen zu untersuchen ist, dass es vergleichsweise einfach durchzuführen und keine teure Ausrüstung erfordert. Darüber hinaus als in Vivo Technik, dieser Assay Modelle vaskulären Leckage im Rahmen von intakten Blutgefäßen assays im Gegensatz zur Messung von Leckagen durch in-vitro- wie z. B. Trans Flussmittel Assays oder Trans endotheliale elektrischen Widerstand (gut TEER) Assays, die ausschließlich, auf die endotheliale monomolekularen Film konzentrieren. Die alternative in-Vivo -Assays der vaskulären Hyperpermeability abweichen von Miles Assays mithilfe eine abweichende Lieferanschrift Route für den Hyperpermeability-induzierende Agenten oder durch die Analyse von vaskulären Leckage an verschiedenen Standorten, für die hier beschriebenen Beispiel durch systemische Lieferung eines Agenten über die Rute Vene, gefolgt von vaskulären Leckage Prüfung in die Lunge oder Luftröhre11,13,15. Eine Einschränkung des Miles Tests ist, dass die intradermale Injektion von bestimmten Agenten kann im Prinzip auch Einfluss auf Blutdruck und fließen neben endotheliale Barriere Störung und, deshalb, auf vaskulären Permeabilität auch indirekt. Trotzdem dieser Assay vor kurzem wurde gezeigt, dass vaskuläre Permeabilität durch induzierte Messen VEGF-A unabhängig von Auswirkungen auf die systemischen Blutdruck15. Eine weitere Einschränkung des Miles-Assays ist, dass vaskuläre Betten in verschiedenen Geweben unterschiedlich zu Durchlässigkeit fördernde Mittel und Ergebnisse, die mit einem Miles-Assay in der Haut können daher nicht repräsentativ sein, zum Beispiel reagieren können der Vorgänge in der Lunge oder Gehirn.
Alter und Gewicht des Tieres beeinflussen die Leckage in der Miles-Assay beobachtet. Um die Wirkung dieser Variablen zu minimieren, Forscher verwenden wurfgeschwistern oder ähnlich Größe und Alter Mäuse als Kontrollen. Maus-Mutanten für ein bestimmtes Gen von Interesse zu beurteilen, sollten Mäuse durch eine heterozygote versus heterozygot Zucht Strategie und Wildtyp wurfgeschwistern verwendet als Steuerelemente generiert werden. Darüber hinaus ist es ratsam schnell reversibel Gas Anästhetika, wie Isoflurane, Vasokonstriktion, die für einige betäubende Medikament verabreicht über parenterale Injektionen24,25beschrieben worden ist, zu vermeiden. Die Injektion von Evans blauen Farbstoff in die Maus seitlich Heck Vene ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll und kann großen Einfluss auf die Qualität des Experiments und Daten. So Forscher müssen bei der Durchführung von Tail Vene Spritzen zuständig sein und wird wahrscheinlich brauchen Vorkenntnisse oder Praxis vor Beginn der Meilen assay experimentieren. Alternativ können Forscher andere intravenöse Strecken liefern Evans blau, wie Retro-Orbital-Injektion, wenn sie Erfahrung mit ihm haben. Intradermale Injektion der Förderung der Durchlässigkeit Lösungen Agent-unabhängige Schäden an der Haut verursachen können. Daher sollte intradermale Injektionen sollte nicht mehr als 20 µl Volumen, immer im Beisein der Histamin-Inhibitor durchgeführt und auf Fahrzeug-Kontrolle-Injektionen normalisiert.
Meilen-Assay wurde von vielen Forschern verwendet, um Komponenten der VEGF-A Signalweg, z. B. zu bewerten weil VEGF-A-induzierten vaskulären Permeabilität Aszites bei Krebs Patienten16 und Vision beeinträchtigen Ödem in mehreren neovaskulären verursacht Auge Krankheit7. So haben wir und andere die Miles-Assay verwendet VEGF-A induzierten vaskulären Leckage bei Mäusen zu vergleichen, die gentechnisch verändert wurden, um bestimmte Komponenten des VEGF-A Signalisierung Kaskade12,13,14, fehlt 15 , 20 , 23. unsere aktuelle Studie, die mit dieser Methode ergab, dass die wichtigsten pathologische VEGF-A-Isoform, VEGF165, durch einen Komplex von VEGFR2 und NRP1 signalisiert, in denen die NRP1 cytoplasmatische Domäne die ABL-Kinase-vermittelte Aktivierung des SRC Familie Kinasen fördert eine Hyperpermeability Antwort14hervorrufen. VEGFA fördert Wachstum von Blutgefäßen und könnte daher therapeutisch zur Blutfluss zu ischämischen Gewebe wiederherzustellen, wenn seine Hyperpermeability Tätigkeit spezifisch gehemmt werden könnte verwendet werden. Aufklärung der molekularen Mechanismen, die VEGF-A Antworten von vaskulären Endothelzellen in Richtung vaskuläre Hyperpermeability steuert Forschung könnte daher Wege identifiziert werden, die gezielt manipuliert werden können, um pathologische VEGF-A induzierte Ödeme hemmen bei Krankheiten wie Krebs oder ischämischen Augenkrankheit. Meilen-Assay wird zweifellos weiterhin eine hilfreiche Methode, um untermauern diese und viele andere Arten von funktionellen Untersuchungen zur molekularen Regulatoren und Effektoren der vaskulären Hyperpermeability aufzuklären.
Disclosures
Die Autoren haben keine widerstreitenden Interessen zu erklären.
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Laura Denti, Valentina Senatore und die Mitarbeiter des Referats biologische Ressourcen am UCL Institute of Ophthalmology für Hilfe bei Maus Haltung und Camille Charoy für den technischen Support. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Medical Research Council (MR/N011511/1), C. Ruhrberg und eine British Heart Foundation PhD-Zugehörigkeit, j.t. Brash (FS/13/59/30649) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pyrilamine maleate salt | Sigma-Aldrich | P5514-5G | Resuspend in PBS |
| Deionised Formamide | Sigma-Aldrich | S4117 | Use in fume cupboard |
| Microlance Needles 30g x 0.5" | BD | 305106 | |
| Sterile Plastipak 1ml Luer | BD | 309659 | |
| Sterile MicroFine syriinges 0.3 ml - 8 mm - 30G | BD | 324826 | |
| Evans blue | Sigma Aldrich | E2129 | |
| Mouse restrainer | |||
| Heat chamber | |||
| Hair clippers | |||
| Isoflurane | Merial | ap/drugs/220/96 | |
| Scalpal | |||
| Blunt scissor | |||
| Forceps | |||
| Eppendorf tubes | |||
| Heatblock | |||
| Cork board | |||
| Benchtop refrigerated centrifuge | |||
| Recombinant Vascular Endothelial Growth Factor 165 | Reliatech | M30-004 |
References
- Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis. Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).
- Engelhardt, B. Development of the blood-brain barrier. Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).
- Ruhrberg, C. Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF. Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).
- Risau, W.
- Strbian, D., et al. The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia. Neuroscience. 153, 175-181 (2008).
- Weis, S. M., Cheresh, D. A. Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability. Nature. 437, 497-504 (2005).
- Campochiaro, P. A. Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).
- Aman, J., et al. Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib. Circulation. , 126 (2012).
- Claesson-Welsh, L.
- Schulte, D., et al. Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability. Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).
- Heinolainen, K., et al. VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling. Circulation Research. 120, (2017).
- Eliceiri, B. P., et al. Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability. Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).
- Sun, Z. Y., et al. VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd. Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).
- Fantin, A., et al. VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation. Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).
- Li, X. J., et al. VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread. Nat Commun. 7, (2016).
- Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219, 983-985 (1983).
- Miles, A. A., Miles, E. M. Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs. J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability. Jove-J Vis Exp. , e50062 (2013).
- Roth, L., et al. Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation. Sci Signal. 9, (2016).
- Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor. Blood. 111, 2674-2680 (2008).
- Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration. P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).
- Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice. Circulation. 126, (2012).
- Chislock, E. M., Pendergast, A. M. Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice. PLoS ONE. 8, e85231 (2013).
- Busch, C. J., et al. Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice. Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).
- Sinclair, M. D. A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice. Can Vet J. 44, 885-897 (2003).
