Summary
重要な肝ドナー不足があるし、肝ドナーの条件が展開されています。常温体外肝灌流 (NEVLP) は評価し臓器の機能を変更しました。本研究は NEVLP のモデルラットを示します、保存肝傷害を軽減するために、ペグインターフェロン カタラーゼの機能をテストします。
Abstract
移植、肝移植の重要な不足があるし、応答ドナー条件が展開されています。その結果、常温体外肝灌流 (NEVLP) は、評価および器官の機能を変更する方法として導入されています。低体温と比較して多くの利点があり、保全傷害、評価、オルガンとオルガンの修理のためのプラットフォームとして生理学的条件下で正常臓器機能の回復を削減 subnormothermic 灌流を含む NEVLP、、改造、変更。マウスおよびブタの NEVLP モデルが記載されています。NEVLP のラット モデルの実証を行い, このモデルを使用して、重要なアプリケーションの 1 つを表示 — 肝出納に追加治療の分子の使用。カタラーゼは内因性活性酸素種 (ROS) のスカベン ジャーを目、脳、肺の虚血再灌流の減少が示されています。Peg 修飾操作は、内皮細胞にカタラーゼをターゲットに示されています。基本の出納にペグインターフェロン カタラーゼ (ペグ猫) を追加しましたここでは、保存肝傷害を軽減するためにできることを示したとします。齧歯動物 NEVLP モデルの利点はより大きい動物モデルと比較すると高価です。本研究の限界は、現在後灌流肝移植を含まないことです。したがって、臓器移植後の機能の予測は、確実に出来ません。しかし、ラット肝移植モデルはよく確立されて、確かにこのモデルと組み合わせて使用することができます。結論としては、ラットを用いた安価な簡単な容易に複製可能な NEVLP のモデルを示しています。このモデルのアプリケーションは、新規 perfusates と出納添加物、テスト機関評価のために設計されたソフトウェアならびに臓器を修復するように設計実験を含めることができます。
Introduction
約 7,000 の移植が行われる年1,2あたりと肝移植の順番待ちリストに 14,578 患者があります。この重要なドナー不足に対し、肝ドナーの条件を拡大しています。これらはしばしば限界器官または拡張条件ドナーと呼びます、主な移植臓器機能不全の遅延移植機能3、率の高い、標準的な基準移植よりも移植後あまりに実行すると予想 4,5,6。その結果、NEVLP は、評価および器官機能6,7を変更するメソッドとして導入されています。NEVLP のモデルラットを設計し、肝出納に分子添加剤のテスト – 重要な潜在的なアプリケーションの 1 つであるこのモデルを使用します。
マウス (ラット) の豚のモデルだけでなく、捨てられた人間の臓器6,8,9の NEVLP を評価されています。NEVLP の最初の人間の臨床試験の結果はまた、最近公開された10をされています。低体温機械灌流腎保存のための標準となっている明確に、どの肝機械灌流が発生する温度はまだ論争を呼びます。NEVLP は低体温と比較して多くの提案された利点と subnormothermic 血流。縮小保存傷害、オルガンのパフォーマンスを評価するために能力の生理学的条件下で、オルガンの修理、改造、および変更7,11のためのプラットフォームとしての正常臓器機能の回復が含まれます 12,13,14,15,16,17。
研究のかなりの数は、ブタの NEVLP モデルを使用して完了しています。人間の臓器やひと臨床試験使用を考慮したモデルが破棄されたときこれらのモデルは比較的高価な小さな動物 NEVLP モデルに比べて非常に高価です。重要なコンポーネント、実験コストが至る。比較的低コストで出納の 300 mL で 4 時間灌流を完了しております。また、ラットなどの小動物のコストは豚のコストと比較して非常に低いです。
ラットにおける NEVLP の他のモデルと比較してここに提示されたモデルは比較的簡単に実装、アプリケーションの広い範囲。灌流回路は、図 1に見ることができます。液は水ジャケット コンテナーである出納貯水池 (1) で起動します。出納はローラー ポンプ (2) 貯水池から引かれウインドケッセル (3) と (4) 肺に押されています。つとめては向流ガスの流量最大ガス交換を提供するために設定されます。出納し、加熱が進み、コイルを確認して灌流チェンバは、生理学的温度 (5) 内部と空気の泡が血流を防ぐためにバブル トラップ (6)、前のオルガン (7) 後オルガン (8) 許可する出納サンプル ポートサンプリング。至る門脈カニューレを介して肝臓に入ります。門脈カニューレは、データ収集ソフトウェアの値をチャートの圧力モニターにアタッチされます。液は下大静脈カニューレを介して肝臓を終了し、圧力・ イコライザ ・ ブロック (9) に流れ込みます。最後に、液はローラー ポンプを通って圧力ブロックからプル、貯水池に空に。このモデル門脈持続灌流が含まれていますと肝動脈およびそれぞれは別々 と追加回路を必要とするいくつかの他のモデルで使用されている透析に拍動流を残しますが、以前はできませんが示されています。必要な9,13。
治療上の分子の付加を出納、探検するには、酵素カタラーゼを選びました。カタラーゼは活性酸素18の効果を軽減するために細胞内部防衛機構の一部である内因性の活性酸素スカベン ジャーです。カタラーゼの発現は肝虚血再灌流傷害19で増加します。カタラーゼの実験的付加は、目、脳、肺20,21,22,23,24虚血再灌流の減少を実証されています。Peg 修飾操作は、内皮細胞25に内皮細胞とカタラーゼの吸収の援助にカタラーゼをターゲットに示されています。ペグ猫は、肝虚血再灌流傷害; を減らすに限られた有効性と全身投与されています。ただし、我々 を追加分離臓器灌流回路にペグ猫は改善につながる結果26,27,28であること仮定しました。私たちの基本の出納にペグ猫を追加ここでは、その能力を発揮し、保存肝傷害を軽減。
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Protocol
機関動物ケアのガイドラインに従ってすべての手順を行ったしてオハイオ州立大学 IACUC 委員会による承認を受けている国家研究評議会の人道的なケアと実験動物の使用 (IACUC) のためのガイド。
1. 初期設定
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次を組み合わせることにより灌流液を準備: 25% アルブミンの 86 mL、ウィリアムズのメディアの 184 mL、ペニシリン/ストレプトマイシン (10 U/mL 0.01 mg/mL とペニシリン ストレプトマイシン)、インスリン (50 U/L)、ヘパリン (0.01 U/mL)、L-グルタミン (0.292 g/L)、30 mL と300 mL の容量にヒドロコルチゾン (0.010 g/L)。基本液とペグ猫グループは、ペグ-猫の 625 U/mL を追加します。
- バッファーの pH 7.4 にトリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン (タム) を使用して、出納ソリューション。液 pH を確認するのに動脈血ガス マシンを使用します。
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回路 (図 1) を設定します。
- 暖かい風呂の水を有効にし、37 ° C に設定ウォーム アップに機関室を許可します。
- 貯水池に混合とバッファー液を注ぎ、循環を開始します。
注: この手順に記載されている出納は 1.1.1 の手順で準備されました。 - オキシジェネイティング ガス (95% 酸素および 5% 二酸化炭素) 線で肺を通じてフロー カウンターをオンにします。
- データ収集ソフトウェアをオンにし、クリックして「スタート」実験の期間を記録します。
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手術顕微鏡と手術室 (図 2) を設定します。
- 地球温暖化の委員会、電気焼灼と麻酔監視装置バイタル サイン (心拍率および酸素飽和度) などすべての機器を入れます。
注: 顕微鏡設定は顕微鏡の使用によって異なりますが、ユーザーの快適さに調整することができます。 - 液体イソフルラン吸入 (分子量 184.5 g/mol) のための 10 mL と 10 mL の麻酔注射器を埋めるし、麻酔単位に配置します。
- ヘパリン (50 U)、手術器具の 0.5 mL シリンジの位置、4-0 と 7-0 シルク縫合糸、滅菌綿棒、4 cm × 4 cm 不織布ガーゼ適切に (図 2)。
- 地球温暖化の委員会、電気焼灼と麻酔監視装置バイタル サイン (心拍率および酸素飽和度) などすべての機器を入れます。
- イソフルラン室を準備します。
2. 麻酔導入
- 次の個人保護用具 (PPE) を着用: サージカル マスク、手術用手袋、使い捨てガウン。
- ラットの重量を量る。
注: 我々 はラット 250-350 g の間を使用します。 - 酸素コンプレッサーとイソフルランを入れます。イソフルラン麻酔室に、圧迫されて後、ラットを置き、蓋を固定します。酸素 2 L/min と配信 6% イソフルランを用いた麻酔を誘導します。
注: 使用する特定の麻酔システムに使用される正確なイソフルラン投与量によって異なります。 - 動物の腹部毛.をクリップするのに電子のバリカンを使用します。
- イソフルラン麻酔室で動物を交換してください。
- 手術室にある麻酔ユニットをオンにします。
- 麻酔が完全に誘導されるときは、イソフルラン室からラットを削除します。つま先のピンチを使用して麻酔の深さを確認します。
3. 調達の手続
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16 G ポータル カフ (図 3) を準備します。
- 16 G 血管カテーテルから始まります。チューブの 7 mm のセクションをカットします。3.5 mm。 切開中間点で測定することによって 7 mm セクションの中間点を決定し、管の前方の半分を削除します。
- この今の平坦な部分を潰して、止血を使用します。リップを作成するのに血管カテーテルのもう一方の端を溶かすためには、ライターを使用します。炎に直接先端を配置しないでください、またはそれを発火させます。
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胆管カニューレを準備します。
- 27 G angiocath を取るし、カテーテルのみを残しての注入ポートを遮断します。27 G cannular チューブの 10 cm のセクションにこれを接続します。
- 麻酔鼻の円錐形の鼻とラットを置き、その四肢が固定化します。左後肢肢にモニターを接続し、バイタル サインを監視します。適切な麻酔深度を確認するつま先ピンチを実行します。4% イソフルレンで麻酔を継続 (計量動物 > 250 g)。
- 動物の腹部を 70% イソプロピル アルコールをスプレーします。乾燥することができます。滅菌ドレープを動物かぶせます。
- 正中切開、剣から恥骨を使用して鋭いハサミと肌 (図 4) を介して拡張することを確認します。優しく、腹膜を入力し、筋肉を切開します。この切開の下面で膀胱とこの切開の優れた面で肝臓を損傷しないように注意してください。
- 左と右肝下縁のレベルで十字架の形を横方向に切開を拡張します。
- 2% まで麻酔を回す (計量動物 > 250 g)。
- 湾曲した蚊クランプとリブ リトラクター (図 5) を使用してリブを使用して剣状突起を撤回します。
- カット鎌、横隔、および鋭いハサミで gastrohepatic 靭帯。
- 検索してタイオフ原点リークを防ぐためにできるだけ近くとして 7-0 縫合糸で横隔静脈。
- 滅菌湿らせた綿の先端アプリケータを用いたラットを骨抜きし、0.9% 生理食塩水入りで湿らせたガーゼで腸をラップします。小腸の血管を伸ばすように注意してください。
- 下大静脈 (IVC) 余分な組織を除去する上を解剖します。下大静脈の分岐部にだけ優れての背後にある解剖および後で使用 (図 6) 4-0 絹縫合糸のループを渡します。
- 右副腎静脈への露出を提供するために右の腎臓を撤回します。ガーゼで上方に肝臓の右葉を撤回します。できるだけ下大静脈に近い 7-0 シルク縫合糸で右副腎静脈を縛るし、ネクタイ (図 7) に遠位のそれを渡って焼灼します。
- 慎重に脾静脈を解剖、2 7-0 絹糸を使用してそれを縛るし、2 つの縫合糸の間を横切る。
- 縛るし、必要な場合、門脈に追加の長さの 7-0 絹糸を使用して追加の静脈を結紮します。
注: infrahepatic 下大静脈右副腎静脈と下の肝臓の間の小さな枝が時々 あります。 - 胃十二指腸動脈周囲の解剖、7-0 絹糸と胃十二指腸動脈を縛る、胃十二指腸動脈を結紮します。
- 肝動脈周囲を解剖し、その周りに (図 8) 7-0 絹糸ネクタイ。
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胆管を分析します。
- 胆汁の管の長さを確認します。胆管 7-0 絹糸を使用して遠位端を縛る。可能な限り近位胆管周囲 7-0 絹縫合糸のループを配置します。
- 小さなハサミでダクトの直径の半分の穴をカットし、近位胆管に 27 G カテーテルを配置します。ローマ サンダル ネクタイ縫合 (図 9) を使用して場所にカテーテルを結ぶ。
- 陰茎静脈または 27 G の針を使用して動物の下大静脈にヘパリン (50 U) の 0.5 mL を注入します。
注: 27 G インスリン注射器は、代わりにも使用できます。 - クランプし、4-0 絹糸使用前に下大静脈を縛る。
- 以前に配置したを使用して肝動脈 7-0 絹縫合糸を縛る。
- 顕微鏡下のクリップを使用して門脈をクランプします。22 G 血管カテーテルを用いた門脈を cannulate します。フラッシュ 60 ml の冷たい 1 mL のヘパリン (100 U) 肝臓までと 0.9% 生理食塩水入りの門脈はブランシュ (図 10)。
注: 肝臓はすぐに白くない場合は、滅菌綿の先端アプリケータでマッサージすることができます。 - Suprahepatic 下大静脈を公開し、できるだけ胸の高として横断します。
- 肝をとおり実行します。横隔膜の周りカット、肝動脈をカット、下大静脈をカット、門脈をカット、任意の追加の靭帯をカット、肝臓を取り出します。氷冷 0.9% 食塩 (図 11) の肝臓を配置します。
- 門脈 (図 12) に 16 G 血管カフを配置します。前のヴィヴォ常温肝灌流回路に肝臓を配置します。
4. Ex Vivo常温肝灌流
注: ここで使用される出納プロトコル手順 1.1.1 で準備されました。
- 門脈カニューレをかふ門脈 (図 13) に配置します。
- 門脈のカニューレの中に 2 mL/分を開始する回路を介して出納の流れを維持します。門脈圧のスパイクのモニターを見てください。血管が閉塞になるし、カニューレの位置の変更が必要な可能性があります。
- 7-0 絹糸を使用して液の逆流のため下大静脈カニューレで縫合します。
- 両方のカニューレは、したら、10-16 cmH2O の範囲で生理学的な圧力に到達するまでを 1 mL/分で流れを回します。
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前から 1 mL のサンプルを取り、後ポート 0、30、60、90、120、150、180、210、および灌流の 240 分。1 mL のサンプルを 0.5 mL サンプルが 2 つに分割します。
注: この mL は、プロトコル手順 4.5.1、0.5、0.5 mL プロトコル手順 4.5.2 で使用されます。- スナップは、液体窒素の極低温の管に、このサンプルの 0.5 mL を凍結します。
- 出納の残り 0.5 mL を使用して動脈血ガス分析を実行します。
- 各時点で血液ガス分析を実行した後 pH のレベルを調べるし、バッファー液の pH 7.4 に戻ります必要に応じて (0、30、60、90、120、150、180、210、および 240 分)。
- 4 時間で灌流の結論、灌流回路から肝臓を外します。肝臓を 0.5 g のセグメントに分割します。スナップは、液体窒素の極低温管肝組織を凍結します。
5. 後実験解析
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0、30、60、90、120、150、180、210、および商業の比色アッセイ キットを使用して 240 分で出納のアラニン アミノ基転移酵素 (ALT) のレベルを決定します。
- 簡単に言えば、60 分測定光学濃度値 570 で 37 ° C で反応ミックス試薬液をインキュベート nm マイクロ プレート リーダーを使用しました。
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換散バッファーの 100 μ L と肝組織の 0.5 グラムを均質化し、組織のアデノシン三リン酸 (ATP)、グルタチオン (GSH) およびマロンジアルデヒド (MDA) のライセートを分析します。
- 簡単に言えば、商業アッセイ キットを用いた肝組織試料の ATP レベルを測定します。サンプルを混ぜて反応バッファーと 30 分測定 570 の光学濃度は室温で孵化させなさい nm マイクロ プレート リーダーを使用しています。
- 商業アッセイ キットを用いた肝組織試料の GSH レベルを測定します。組織サンプルをアッセイ カクテルに混ぜてください。405-414 nm 光学密度値を測定します。
- 商業アッセイ キットを用いた肝組織試料の MDA 濃度を測定します。未定と 95 ° C、60 分遠心分離反応液に熱を持つサンプルをミックスし、上清を 96 ウェル プレートに転送します。532 の光学濃度を測定 nm。
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換散バッファーの 100 μ L と肝組織の 0.5 グラムを均質化し、組織の商業アッセイ キットを使用して相対的なカスパーゼ 3/7 活動のライセートを分析します。
- カスパーゼ 3 7 試薬アッセイバッファーで組織ライセートをミックスし、30 分間室温で孵化させなさい。
- よくマイクロ プレート リーダーを使用して各蛍光レベルを測定します。
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アポトーシス細胞死商業の in situ検出キットを使用して肝組織サンプルのレベルを決定します。
- 前治療 0.5 g 組織は 10 U/mL, プロテイナーゼ K 10 分でセクションし、60 分蛍光顕微鏡を用いた解析の実行の 37 ° C で反応混合物を孵化させなさい。
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Representative Results
グループごとの 3 つのラットのサンプル サイズが使用されました。Alt キーは 0、30、60、90、120、150、180、210、および灌流の 240 分で測定しました。学生のtを使いました-基本液と基本出納プラス各時点で PEG 猫のグループ間の結果を比較するテスト。基本出納および基本出納ペグ猫グループを比較すると、そこは大幅に少ない (p < 0.05) 基本出納プラス 240 分 (図 14 a)、210、180、150 でペグ猫グループの ALT です。
肝組織は、両方の基本液と基本液に加えてペグ猫グループから組織の損傷を分析するために調達されました。学生のtを使いました-基本出納および基本出納ペグ猫グループの間で結果を比較するテスト。組織 ATP 基本出納プラス基本液単独群と比較してペグ猫グループで維持されていた (図 14 b、 p < 0.05)。組織 MDA 生産された基本出納グループ基本出納プラス ペグ猫のグループよりも有意に高かった (図 14、 p < 0.05)。総 GSH が基本出納プラス基本液単独群と比較してペグ猫グループで維持されていた (図 14、 p < 0.05)。
アポトーシスを分析するには、肝組織カスパーゼ 3/7 活動はグループを比較しました。各ウェルで蛍光を測定しました。学生のtを使いました-基本出納および基本出納ペグ猫グループの間で結果を比較するテスト。基本出納プラス基本液単独群と比較してペグ猫グループでカスパーゼ 3/7 活性を有意に減少した (図 15 a、 p < 0.05)。グループ間のアポトーシスを比較に使用された遊離トランスフェラーゼ (TdT) dUTP ニック終わりラベリング (TUNEL) 染色します。アポトーシス細胞の割合は基本出納プラス基本による一人でグループと比較してペグ猫グループで大幅に少ない (図 15 b、 p < 0.05)。
図 1: 灌流回路。回路の部品が付いています。液は水ジャケット コンテナーである出納貯水池 (1) で起動します。出納はローラー ポンプ (2) 貯水池から引かれウインドケッセル (3) と (4) 肺に押されています。つとめては向流ガスの流量最大ガス交換を提供するために設定されます。液は、生理学的温度と空気の泡の灌流を防ぐためにバブル トラップ (6) であることを確認する灌流チャンバー内の加熱コイル (5) に進みます。中古オルガン (7) と (8) 後オルガンがあるサンプル ポートは、サンプリングする出納を許可します。至る門脈カニューレを介して肝臓に入ります。門脈カニューレは、圧力イコライザー (9) を調節する圧力モニターにアタッチされます。最後に、液はローラー ポンプを通って圧力ブロックからプル、貯水池に空に。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 手術室と手術器具セットアップします。手術顕微鏡 (1) は、ユーザーの拡大と適切な高さに調整必要があります。イソフルランは麻酔器 (2) にあらかじめロードすることができます。動物の鼻は、鼻の円錐形 (3) に配置されます。手術器具は広げて (4) を簡単にアクセスできる必要があります。近くに電気焼灼 (5) を持っていることは便利です。縫合糸 (6) カット済みでなければなりませんので、必要なときすぐに作品を得ることが、余分な利用 (7) をする必要があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 16 G 門脈カフを準備します。16 G 血管カテーテルから始まります。チューブの 7 mm のセクションをカットします。3.5 mm。 切開ここで測定することによって 7 mm セクションの中間点を決定し、管の前方の半分を削除します。この今の平坦な部分を潰して、止血を使用します。リップを作成するのに血管カテーテルのもう一方の端を書き込むにライターを使用します。炎に直接先端を配置しないでください、またはそれを発火させます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 正中切開します。正中切開、剣から (1) 恥骨 (2) 使用する鋭いハサミと皮膚や筋肉を介して拡張することを確認します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 十分な収縮を取得します。(1) リブ リトラクター (3, 4) を配置することによって曲線蚊クランプ (2) と肋骨を使用する剣状のプロセスを撤回します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 下大静脈 (IVC) 郭清。肝右腎を公開まで (1) と (2) 門脈を反転します。(3) 下大静脈の周りを分析し、将来の使用のための 7-0 縫合糸のループを配置します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 右副腎静脈結紮します。右副腎静脈に露出を提供する右の腎臓 (1) をリトラクトします。右副腎静脈を縛るし、それを横切る。湿らせたガーゼ (2) は、この演習の間に、肝臓を保護するために使用できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8: 肝動脈解離。周りを解剖し、(1) (2) 門脈をくぐって近く肝動脈周囲のネクタイを配置します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9: 胆管カニュレーション。Cannulate (1) 27 G 血管カテーテルを用いた胆管 (2) 27 G チューブ (3) に接続されています。これは血流中に胆汁を収集するのに役立ちます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: 肝臓フラッシュします。フラッシュ肝 (1) 60 cc 100 U と冷たい 0.9% 食塩 (1 mL) ヘパリン 16 G 血管カテーテル (2) を使用しての。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 11: 肝切除後。肝を実行し、冷たい生理食塩水で肝臓を配置します。胆管カニューレが外れないように注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 12: 門脈まがり。門脈内を検索します。クランプの上の静脈の数ミリ唇を残して静脈を保持する大型クランプ (1) を使用します。顕微鏡視下鉗子 (2、3) を使用して、門脈に 16 G 血管カフ (4) を配置します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 13: 門脈カフと優れた下大静脈カニュレーション。門脈カフ (1) と (2) 優れた IVC を cannulate します。胆管カニューレ (3) が外れないように細心の注意する必要があります。さらに、優れた IVC のねじれに注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 14: 基本液専用とベースによる組織損傷の解析、さらにペグ猫グループ (N = 3/グループ).エラーバーは標準偏差を表します。(A) アラニンのアミノ基転移酵素 (ALT) レベル。基本出納と基本液に加えてペグインターフェロン カタラーゼ (ペグ猫) グループ間の ALT のレベルを比較すると、そこは、大幅に少ない基本出納プラス 240 分、210、180、150 でペグ猫グループの ALT (p < 0.05)。(B) アデノシン三リン酸塩レベル。組織におけるアデノシン三リン酸 (ATP) が基本出納プラス基本液単独群と比較してペグ猫グループで維持された(p <0.05)。(C) マロンジアルデヒド レベル。組織マロンジアルデヒド (MDA) 生産された基本出納グループ基本出納プラス ペグ猫のグループよりも有意に高かった (p < 0.05)。(D) グルタチオンのレベル。総グルタチオン (GSH) は基本出納プラス基本液単独群と比較してペグ猫グループで維持された (p < 0.05)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 15: 基本液専用とベースによるアポトーシスの解析、さらにペグ猫グループ (N = 3/グループ).エラーバーは標準偏差を表します。(A) 基本出納プラス基本液単独群と比較してペグ猫グループでカスパーゼ 3/7 Activity.Caspase 3/7 活動を有意に減少した (p < 0.05)。(B) 遊離トランスフェラーゼ (TdT) dUTP ニック終わりラベリング (TUNEL) 染色。画像は、蛍光顕微鏡 X 4 を使用して撮影されました。アポトーシス細胞の割合が少ない基本液基本液と比較してペグ猫グループで (p < 0.05)。緑: アポトーシス細胞。青: 原子力。スケール バー = 1,000 μ m. TUNEL 陽性細胞は 4 ランダム微視的フィールドからセルをカウントすることによって定量化されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
移植肝移植の重要な不足があるし、応答でドナーの条件は拡張1,2,3,4,5をされています。ドナー不足の結果として、NEVLP は、評価および器官機能6,7を変更する方法として導入されています。我々 は、NEVLP のモデルラットを設計しています。さらに、我々 はその重要な潜在的なアプリケーションの 1 つであるこのモデルを使用している-肝出納に分子添加剤のテストします。基本の出納にペグ猫を追加しましたここでは、保存肝傷害を軽減するためにできることを示したとします。
重要なステップ
肝灌流回路が購入し、そのまま使用します。図 1の回路を視覚化できます。使用液の貯留層は、生理的温度で液を保つために使用される water-jacketed のコンテナーです。貯水池から励起し、ウインドケッセル室にプッシュ ローラーにより出納を引き抜きます。この部屋は、液の拍動流を湿らせより臓器に入るのため層流は、するのに役立ちます。ウインドケッセル後、肺に至る流れを部屋します。つとめては向ガスと液流の 95% の酸素を液に最大ガス交換を提供するために設定されています。液は、加熱コイル温度生理学的にまだあることを確認するに進みます。右の器官を防ぐ空気の泡の灌流前にバブル トラップ。液は、肝臓にバブル トラップから、門脈カニューレが注入されます。門脈カニューレは圧モニターのそれから小さな分岐。センサーに圧力損失がないのでセンサーに配管する必要があります流体空気ないと準備万端。オルガンをオキシジェネイティング後液は圧力イコライザーを下静脈カニューレを介して肝臓からフローします。回路または臓器の過剰圧力イコライザ ・ ブロックを防止します。最後に、液はローラー ポンプを通って圧力ブロックからプル、貯水池に空に。
各灌流を開始する前に回路の目視検査は、いかなる損害または回路部品やチューブに蓄積を識別するために行わなければなりません。細菌や回路上の他の物質の蓄積は、部品を交換または、掃除、可能であればする必要があります。次に、内部のコンポーネントを維持する中性洗剤溶液を洗浄する必要があります。圧力センサーを洗浄されているコンポーネントと圧ラインは脱イオン水と空気の泡のパージする必要があります。また、流れを読んで圧力が変化に適切に応答していることを確認するために定期的に調整必要があります。圧力センサーが適切に応答しない場合センサーに行のすべてのアイテムをチェックし、必要に応じて再調整する必要があります。灌流開始時、肝臓の血管は折れ目やツイスト回路に肝臓を接続するときになってないかどうかを確認する重要です。この問題が発生する場合即時圧力スパイクで見られる対数傾向のモニター。最も一般的なエラーは、不十分な位置のカニューレと門脈のキンクです。この問題を少し引き出し、門脈を矯正より自然な位置に船を移動することによって解決することができます。圧力モニターは、圧力と一貫性の向上でドロップでこの問題の解決を示します。次に、ポータル静脈カニューレに門脈カフを接続するとき船の臓器血流阻害がねじれになるにすることができます。カフを調整して、このエラーを修正する必要がありますすぐに戻ります低圧、レベルを一貫した流れで門脈圧の急激なスパイクになります。屈折またはツイスト下大静脈は、カニューレと容器の膨張からの流れによってすぐに識別できます。上大静脈でこれらのエラーの両方もなります増加圧力のしかし、門脈のトラブルとは異なりこの圧力器官で出るし、すぐに解決する必要があります。この問題は、10 分以内に解決する必要があります。 または実験をキャンセルする必要があります。実験のキャンセルのため即時の徴候は、器官で最初の 20 分以内クリアの浮腫を見ています。
肝臓やカニューレの接続の 1 つからのリークがある場合それは液タンクのレベルを監視することが重要になります。液が不足していると、空気が実験に致命的なことができます。ラインに空気を注入後、実験を一時停止し、再度チューブ造管ラインをプライムに不可能します。唯一の可能な補正は、注入された空気をキャプチャするバブル トラップです。
変更とトラブルシューティング
回路がフラッシュされると、肺は行に置くことができるし、回路がプライミングして、出納とし。正しく、肺から空気をパージ、数分を取ることができますが、空気塞栓症は、血流中に発生しないことを確認の重要なステップです。つとめては完全に出納バブル トラップを横に満たされる必要がありますとプライミング後は空気の泡をキャプチャします。この時点で出納肝臓穿刺の準備が整うまでの移動を保つために、1 または 2 mL/分の流れを回路の流れを設定必要があります。
門脈、肝臓の下大静脈を cannulating 後、圧力増加し、水平飛行してください。通常の生理学的な圧力にフローが増加すると記録された圧力は同様の段階的な方法で高める始めるべきです。必要な流れ (8-16 mmHg) が達成される圧力一定でなければなりません。私たちは目指し 10 mmHg の圧力、流れを調整します。10 mmHg の圧力に到達するため必要な流量は、器官によって異なる場合があります。出納の臓器からのわずかな漏れがある可能性がありますが、収集と貯留層に返されるこの出納ができます。
回路は、商工会議所と貯留層を維持するために、使い捨てチューブおよびポートを保持するすべての灌流後掃除する必要があります。すべての出納は、回路から削除する必要があります。回路は、300 mL の脱イオン水を最小限に抑えてすぐにフラッシュする必要があります。脱イオン水フラッシュ回路用チューブ外付け部品適切にクリーンアップする必要があります。外部コンポーネントは、洗い流したまたは軽く拭かし、乾いた空気で乾燥する必要があります。回路部品は壊れやすい、簡単に破損することができます。だからこそ、それを優しくきれいに非常に重要。内部回路は使用しないときは脱イオン水でアルカリ洗剤の 5% 溶液で保持されます。回路の洗剤は、チューブの寿命を延ばすバブル トラップなどの他のコンポーネントに蓄積を防ぐし、イコライザーを圧力するのに役立ちます。
各使用後徹底した洗浄と回路の保守回路で最も困難を防ぐことができます。これは詰まっているチューブやカニューレにつながることができます残留液の蓄積がないことを確認するのに役立ちます。回路部品とチューブを定期的に検査し、汚染または流れの制限がないかどうかを確認する各使用する前に必要に応じて交換してくださいください。
制限
この小動物 NEVLP モデルの制限は、現在後血移植を含まないことです。したがって、移植後肝移植機能を評価することが可能です。これは、今後の研究の重要な領域です。さらに、小動物の回路を利用した知識とスキルの両方が必要です。
既存のモデルに対する意義
ブタとネズミ (rat) モデル、subnormothermic、低体温、常温体外肝灌流の文献に記載されています。灌流温度に関する論争はまだ存在しますがその機械の灌流が温度9に関係なく肝移植の機能を向上させることが示されています。ここで提示した NEVLP モデルは単純な簡単に複製可能な低コストで、アプリケーションの広い範囲。このモデルは、透析または彼らは不要な9,13に示されているといくつかの他のモデルに含まれている肝動脈に拍動流には含まれません。また、NEVLP を使用して最初の人間の試験の結果による肝の保存の効果的な方法であることを-したがって、このモデルは前のヴィヴォ肝灌流10の将来のアプリケーションのテストに適しています。
将来のアプリケーション
NEVLP の将来のアプリケーションの様々 な文献で提案されている.捨てられた人間の臓器で、人間の肝臓をテストする前に動物モデルにおける系統的なテストをするこれらの必要があります。ここで紹介するモデルは、不要な手順を排除は容易に複製可能な低コスト、これらの小説の将来のアプリケーションのテストに最適です。このモデルの最も重要な潜在的なアプリケーションの 1 つである紹介 - 新規薬物による添加剤のテストします。他の提案されたアプリケーションは、破損した臓器の修復を含む steatotic 臓器移植、C 型肝炎ウイルスの抵抗性、間葉系幹細胞治療、遺伝子の改変による血液灌流の導入を許可する肝臓の脱脂免疫抑制剤11,31,32,33,34,35,36,37,38。
結論
結論としては、ラットを用いた安価で、簡単に複製可能な NEVLP のモデルを示しています。このモデルの使用は入念な準備、実践、そして知識が必要ですが、低コストで実装することができます。このモデルのアプリケーションは、代表の結果で示した、小説による添加剤のテストを含めることができます。このモデルの追加アプリケーションは、臓器評価、異なる perfusates および人工またはヘモグロビンによる酸素運搬体の臓器を修復するように設計エージェント用に設計されたテストのソフトウェアを含めることができます。
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Disclosures
すべての報告は、関連する開示があるないです。
Acknowledgments
この作品は、臓器移植、灌流、工学、オハイオ州立大学での再生の NIH T32AI 106704 01A1 と t. フレッシュ基金によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol - Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4x4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps - Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps - Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors - non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps - Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
References
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