Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

نموذج حيوانات صغيرة من نضح الكبد نورموثيرميك السابقين فيفو

Published: June 27, 2018 doi: 10.3791/57541
Automatic Translation
1,2, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 3, 4, 2, 1,3, 1,2
1Collaboration for Organ Perfusion, Protection, Engineering and Regeneration (COPPER) Lab, Division of Transplant, Department of Surgery, Comprehensive Transplant Center, Ohio State University Wexner Medical Center, 2Department of Surgery, Division of Transplant, Ohio State University Wexner Medical Center, 3Department of Surgery, Division of CardioThoracic Surgery, Ohio State University Wexner Medical Center, 4Department of Medicine, Ohio State University Wexner Medical Center

Summary

وهناك نقص كبير من المانحين كبد، وجرى توسيع نطاق معايير المانحين الكبد. وقد وضعت نورموثيرميك السابقين فيفو الكبد التروية (نيفلب) لتقييم وتعديل وظيفة الجهاز. يوضح نموذج الفئران من نيفلب هذه الدراسة واختبارات قدرة سي-الكاتالاز، للتخفيف من حدة الضرر الحفاظ على الكبد.

Abstract

هناك نقص كبير في الكبد اللوجرافتس المتاحة لزرع الأعضاء، وردا على ذلك تم توسيع معايير المانحين. نتيجة لذلك أدخلت نورموثيرميك السابقين فيفو الكبد التروية (نيفلب) كوسيلة لتقييم وتعديل وظيفة الجهاز. نيفلب مزايا كثيرة بالمقارنة مع باردا ونضح سوبنورموثيرميك بما في ذلك خفض الحفاظ على الإصابة، استعادة وظيفة الجهاز العادي في ظل الظروف الفسيولوجية، تقييم لأداء الجهاز، ومنطلقا لإصلاح الجهاز ، يعيد البناء، والتعديل. وقد وصف نماذج نيفلب مورين والخنزير على حد سواء. إظهار نموذج الفئران من نيفلب، واستخدام هذا النموذج لعرض إحدى التطبيقات الهامة – استخدام جزيء العلاجية إضافة إلى بيرفوساتي الكبد. كاتالاز الكسح أنواع (روس) أكسجين تفاعلية ذاتية وأظهرت انخفاض الاسكيمية-ضخه في العين والمخ، والرئة. لقد ثبت بيجيليشن لاستهداف كاتالاز إلى البطانة. هنا، لقد أضفنا سي-كاتالاز (شماعة-CAT) إلى بيرفوساتي قاعدة وأثبت قدرته على التخفيف من حدة الضرر الحفاظ على الكبد. ميزة لنموذجنا نيفلب القوارض أنها غير مكلفة بالمقارنة مع النماذج الحيوانية الكبيرة. حد من هذه الدراسة أن ذلك لا يشمل حاليا التروية بعد زرع الكبد. ولذلك، لا يمكن جعل التنبؤ بمهمة زرع ما بعد على وجه اليقين. ومع ذلك، نموذج عملية زرع كبد الفئران هي راسخة والتأكيد يمكن استخدامها بالاقتران مع هذا النموذج. وفي الختام، لقد أظهرنا طراز نيفلب بسيطة وغير مكلفة، يمكن تكرارها بسهولة باستخدام الفئران. يمكن أن تتضمن تطبيقات لهذا النموذج اختبار perfusates الرواية والمضافات بيرفوساتي والبرمجيات المصممة لتقييم جهاز اختبار وتجارب تهدف إلى إصلاح الأجهزة.

Introduction

وهناك 14,578 المرضى على قائمة الانتظار لزرع الكبد وزرع حوالي 7,000 تتم كل سنة1،2. ردا على هذا النقص كبير من المانحين، اتسع نطاق معايير المانحين الكبد؛ هذه هي غالباً ما يشار إلى أجهزة هامشية أو المعايير الموسعة من الجهات المانحة، ومن المتوقع أن أداء أقل بعد زرع الأعضاء من allografts المعايير القياسية، مع ارتفاع معدلات الخلل الأساسي الابتزاز والفساد تأخر الدالة3، 4،،من56. نتيجة لذلك بدأ نيفلب كوسيلة لتقييم وتعديل الجهاز وظيفة6،7. لدينا تصميم نموذج الفئران من نيفلب ويستخدم هذا النموذج لشرح أحد تطبيقاتها المحتملة الهامة – اختبار المضافات جزيء رواية للكبد بيرفوساتي.

وقد تم تقييم نيفلب في الفئران (فأر) ونماذج الخنزير، وكذلك في الأعضاء البشرية المهملة6،،من89. أيضا في الآونة الأخيرة كانت نتائج التجارب البشرية الأولى من نيفلب نشرت10. على الرغم من نضح آلة باردا أصبح من الواضح القياسية للمحافظة على الكلي، درجة الحرارة في الجهاز الكبد الذي ينبغي أن يحدث نضح لا تزال مثيرة للجدل. وقد نيفلب العديد من المزايا المقترحة بالمقارنة مع باردا ونضح سوبنورموثيرميك. وتشمل هذه المحافظة على انخفاض الإصابة، استعادة وظيفة الجهاز العادي في الظروف الفسيولوجية، القدرة على تقييم أداء الجهاز، ومنطلقا لإصلاح الجهاز ويعيد البناء والتعديل7،11، 12،13،،من1415،،من1617.

أنجز عدد كبير من الدراسات استخدام الخنزير نيفلب النماذج. على الرغم من أن هذه النماذج غير مكلفة نسبيا عند النظر في نماذج استخدام تجاهل الأعضاء البشرية أو التجارب السريرية البشرية، مكلفة للغاية بالمقارنة مع نموذجنا نيفلب الحيوانات الصغيرة. عنصرا هاما لكل تجربة هي التكلفة بيرفوساتي. أننا قادرون على إكمال نضح ح 4 مع 300 مل من بيرفوساتي بتكلفة منخفضة نسبيا. بالإضافة إلى ذلك، تكلفة الحيوانات الصغيرة بما في ذلك الفئران منخفض جداً بالمقارنة مع تكلفة الخنازير.

بالمقارنة مع نماذج أخرى من نيفلب في الفئران، هو بسيط نسبيا لتنفيذ النموذج المعروض هنا وطائفة واسعة من التطبيقات. حلبة نضح يتبين في الشكل 1. ويبدأ بيرفوساتي في خزان بيرفوساتي (1)، الذي يعتبر بمثابة حاوية تغلف مياه. يتم سحبها من الخزان بمضخة اسطوانة (2) بيرفوساتي ودفعت إلى ويندكيسيل (3)، ومن ثم مكساج (4). يتم تعيين مكساج للغاز كونتيركورينت وتدفق بيرفوساتي لتوفير تبادل الغازات كحد أقصى. لفائف بيرفوساتي ثم العائدات لتدفئة (5) داخل قاعة نضح للتأكد من أنه في درجة حرارة الفسيولوجي، وفخ فقاعة (6) لمنع التروية لفقاعات الهواء هناك الجهاز السابق (7) والجهاز بعد (8) المنافذ العينة، والتي تسمح بيرفوساتي أن يكون عينات. ثم يدخل بيرفوساتي في الكبد عن طريق الوريد البابي القنية. قنية الوريد البابي موصولة إلى جهاز ضغط المخططات القيم على برامج جمع البيانات. ثم بيرفوساتي خروج الكبد من خلال قنية IVC ويتدفق إلى كتلة ضغط التعادل (9). وأخيراً، بيرفوساتي انسحب من كتلة الضغط مرة أخرى عن طريق المضخة الدوارة وإفراغ خزان. هذا النموذج يتضمن التروية المستمرة الوريد البابي ويترك تدفق نابض بالشريان الكبدي والغسيل الكلوي المستخدمة في بعض النماذج الأخرى، كل منها يتطلب دارة منفصلة وإضافية، ولكن أثبتت سابقا أن لا تكون مطلوب9،13.

استكشاف إضافة جزيء العلاجية الرواية إلى بيرفوساتي، اخترنا في إنزيم الكاتالاز. الكاتلاز هو الكاسح روس ذاتية التي جزء من إليه الدفاع الخلايا الداخلية التخفيف من آثار روس18. يتم زيادة التعبير كاتالاز في الاسكيمية كبدي ضخه إصابة19. قد تجلى التجريبية إضافة كاتالاز إنقاص الاسكيمية-ضخه في العين والمخ، والرئة20،،من2122،،من2324. لقد ثبت بيجيليشن لاستهداف كاتالاز إلى البطانة والمساعدة في امتصاص كاتالاز إلى خلايا بطانية25. القط شماعة تدير عناصره مع فعالية محدودة في الحد من الإصابات الكبدية الاسكيمية-الاكسجينيه؛ ومع ذلك، افترضنا أن إضافة شماعة-القط إلى حلبة نضح جهاز معزولة أن يؤدي إلى تحسين النتائج26،،من2728. هنا، نحن إضافة الوتد-القط أن لدينا قاعدة بيرفوساتي وإثبات قدرته التخفيف من الضرر الحفاظ على الكبد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وأجريت جميع الإجراءات وفقا للمبادئ التوجيهية "رعاية الحيوان المؤسسية" والمجلس الوطني للبحوث دليل "الرعاية الإنسانية" واستخدام الحيوانات المختبرية (IACUC) وخضع لموافقة اللجنة IACUC جامعة الدولة في ولاية أوهايو.

1-الإعداد الأولى

  1. إعداد الحل التروية بالجمع بين ما يلي: 86 مل الزلال 25%، 184 مل من الإعلام وليمز، 30 مل البنسلين/ستربتوميسين (U/mL 0.01 ملغ/مل والبنسلين والستربتوميسين 10)، والإنسولين (50 U/L)، الهيبارين (0.01 U/mL)، ل الجلوتامين (0.292 غرام/لتر)، و الهيدروكورتيزون (0.010 غرام/لتر) إلى إجمالي حجم 300 مل. مجموعة القط شماعة وقاعدة بيرفوساتي، إضافة 625 يو/مليلتر شماعة-لجنة مناهضة التعذيب.
    1. المخزن المؤقت الحل بيرفوساتي باستخدام أمينوميثاني تريس (هيدروكسيميثيل) (لثام) على درجة الحموضة 7.4. استخدام جهاز غازات دم الشرياني للتأكد من درجة الحموضة بيرفوساتي.
  2. إعداد الدائرة (الشكل 1).
    1. تشغيل حمام المياه الدافئة وتعيينها إلى 37 درجة مئوية. تسمح الدائرة الجهاز الدفء.
    2. صب بيرفوساتي مختلطة ومخزنة في الخزان وبدء التداول.
      ملاحظة: أعد بيرفوساتي المذكورة في هذه الخطوة بخطوة 1.1.1.
    3. قم بتشغيل غاز الأكسجين (95% أكسجين و 5% ثاني أكسيد الكربون) لمواجهة التدفق من خلال مكساج في الخط.
    4. قم بتشغيل برامج جمع البيانات وانقر فوق "ابدأ" لتسجيل طوال فترة التجربة.
  3. إعداد المجهر الجراحي وغرفة العمليات (الشكل 2).
    1. قم بتشغيل جميع المعدات بما في ذلك المجلس الاحترار، اليكتروكاوتيري، والتخدير والعلامات الحيوية (القلب الأكسجين ومعدل التشبع) معدات الرصد.
      ملاحظة: الإعدادات مجهر يختلف استناداً إلى المجهر المستخدمة ويمكن تعديلها للراحة للمستخدم.
    2. ملء محقنة التخدير 10 مل مع 10 مل من السائل إيسوفلوراني لاستنشاق (الوزن الجزيئي 184.5 g/mol) ووضع في وحدة التخدير.
    3. ضع حقنه 0.5 مل من الهيبارين (50 ش)، الأدوات الجراحية، 4-0 و 7-0 الحرير خياطة، ومسحات القطن المعقمة، والإسفنج شاش 4 × 4 سم غير منسوجة على النحو المناسب (الشكل 2).
  4. إعداد قاعة إيسوفلوراني.

2-تنظيم دورات تعريفية للتخدير

  1. ارتداء معدات الوقاية الشخصية التالية (معدات الوقاية الشخصية): قناع الجراحية، والقفازات الجراحية، والمتاح بثوب.
  2. وزن الفئران.
    ملاحظة: نحن نستخدم الفئران سبراغ داولي بين 250 – 350 غ.
  3. قم بتشغيل ضاغط الأكسجين وإيسوفلوراني. ضع الفئران، بعد يتم وزنه، في قاعة إيسوفلوراني، وتأمين الغطاء. حمل التخدير استخدام 6% isoflurane تسليمها مع 2 لتر في الدقيقة للأوكسجين.
    ملاحظة: جرعة isoflurane الدقيقة المستخدمة سيعتمد على نظام التخدير المحددة قيد الاستخدام.
  4. استخدام مقص الإلكترونية لقص الشعر البطن للحيوان.
  5. استبدال الحيوان في قاعة إيسوفلوراني.
  6. قم بتشغيل وحدة التخدير الموجود في غرفة العمليات.
  7. إزالة الفئران من قاعة isoflurane عندما فعل التخدير الكامل. تأكيد عمق التخدير استخدام قرصه أخمص القدمين.

3-الإجراء المشتريات

  1. تعد صفعة ز 16 المدخل (الشكل 3).
    1. تبدأ مع أنجيوكاثيتير ز 16. قص مقطع 7 ملم من الأنابيب. تحديد نقطة الوسط للقسم 7 ملم بقياس 3.5 مم. إينسيسي في نقطة الوسط وإزالة في النصف الأمامي من الأنبوب.
    2. استخدام هيموستات لسحق هذا الجزء الآن شقة. استخدام أخف لإذابة الطرف الآخر من أنجيوكاثيتير لإنشاء lip. لا تضع هذه المعلومة مباشرة في اللهب أو أنها سوف تشعل.
  2. إعداد قنية القناة الصفراوية.
    1. أن أنجيوكاث ز 27 وقطع المنفذ حقن ترك القسطرة فقط. قم بتوصيل هذا مقطع 10 سم من أنابيب كانولار ز 27.
  3. موقف الفئران مع انفها في مخروط الآنف التخدير، وأن الأطراف الأربعة معطلة. رصد العلامات الحيوية عن طريق إرفاق جهاز العرض إلى أقصى اليسار هند. أداء قرصه تو لتأكيد عمق المناسبة للتخدير. يستمر التخدير في إيسوفلوراني 4% (للحيوانات التي تزن > 250 غرام).
  4. رذاذ البطن للحيوان مع كحول الأيزوبروبيل 70%. السماح لتجف. ضع ثني عقيمة على الحيوان.
  5. جعل خط الوسط شق من الرهابه إلى العانة باستخدام حادة مقص وتوسيع نطاقها من خلال الجلد (الشكل 4). بلطف أدخل الصفاق والعضلات جداً. العناية لتفادي تلف المثانة في الجانب السفلي من هذا الشق والكبد في الجانب متفوقة في هذا الشق.
  6. تمديد شق أفقياً إلى اليسار واليمين شكل صليب على مستوى الحدود السفلي للكبد.
  7. إيقاف التخدير وصولاً إلى 2% (للحيوانات وزنها > 250 غرام).
  8. التراجع عن عملية الرهابه استخدام المشبك البعوض منحنى والاضلاع باستخدام الكامشات الضلع (الشكل 5).
  9. قص فالسيفورم، فرنك، والأربطة جاستروهيباتيك مع مقص حاد.
  10. تحديد موقع والتعادل خارج الوريد فرنك مع 7-0 خياطة كالقرب من أصله قدر الإمكان للحيلولة دون تسرب.
  11. افيسسيراتي الفئران باستخدام قضيب نصيحة القطن ترطب عقيمة والتفاف الأمعاء في شاش مبلل مع المحلول الملحي العادي 0.9 في المائة. الحرص على عدم تمدد المفرج الأمعاء.
  12. تشريح عبر الأجوف فينا أدنى (IVC) لإزالة الأنسجة الزائدة. تشريح وراء IVC متفوقة فقط التشعب وتمرير حلقة من 4-0 خياطة الحرير لاستخدامها في وقت لاحق (الشكل 6).
  13. سحب الكلي حق تقديم التعرض لهذا السياق حق الغدة الكظرية. التراجع عن الفص الأيمن للكبد ﻷسلحته مع شاش. التعادل قبالة على المنوال حق الغدة الكظرية مع خياطة حرير 7-0 مقربة من IVC قدر الإمكان وكوي عبرها القاصي للتعادل (الشكل 7).
  14. عناية تشريح خارج هذا السياق الطحال والتعادل هو إيقاف استخدام اثنين من خيوط الحرير 7-0 وتتخلل من بين خيوط اثنين.
  15. التعادل قبالة وسد الأوردة إضافية باستخدام خياطة الحرير 7-0 لطول إضافية في الوريد البابي، إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: في بعض الأحيان هناك فروع صغيرة من إينفراهيباتيك IVC بين الوريد حق الغدة الكظرية والكبد أقل شأنا.
  16. تشريح حول قصور الشريان والتعادل خارج قصور الشريان مع 7-0 خياطة حرير، واضطر قصور الشريان.
  17. تشريح حول الشريان الكبدي ومن ثم ضع تعادل 7-0 خياطة حرير حوله (الشكل 8).
  18. تشريح من القناة الصفراوية.
    1. تحقق من طول القناة الصفراوية. التعادل قبالة الصفراوية في نهاية البعيدة باستخدام خياطة حرير 7-0. وضع حلقة من 7-0 خياطة الحرير حول الصفراوية بروكسيمالي قدر الإمكان.
    2. قطع حفرة هو نصف القطر من القناة مع مقص صغير ووضع قسطرة ز 27 في القناة الصفراوية بروكسيمالي. التعادل القسطرة في مكانها باستخدام خياطة ربطه عنق صندل روماني (الشكل 9).
  19. حقن 0.5 مل الهيبارين (50 ش) في الوريد القضيب أو IVC الحيوان باستخدام إبرة ز 27.
    ملاحظة: حقنه الأنسولين ز 27 يمكن أيضا استخدامها بدلاً من ذلك.
  20. المشبك وربطه عنق قبالة IVC الموضوعة سابقا باستخدام خياطة الحرير 4-0.
  21. التعادل خارج الشريان الكبدي الموضوعة سابقا باستخدام خياطة الحرير 7-0.
  22. المشبك خارج الوريد البابي باستخدام مقطع ميكروسورجيكال. كانولاتي الوريد البابي باستخدام أنجيوكاثيتير ز 22. تدفق الوريد البابي مع 60 مل من البرد 0.9% المحلول الملحي العادي مع الهيبارين 1 مل (100 ش) حتى الكبد blanches (الشكل 10).
    ملاحظة: إذا كان لا بلانش الكبد فورا يمكن مدلك مع قضيب تطبيق نصيحة القطن المعقمة.
  23. كشف سوبراهيباتيك IVC وتتقاطع كارتفاع في الصدر قدر الإمكان.
  24. أداء ظهرت النحو التالي. قص حول الحجاب الحاجز وقطع الشريان الكبدي، قص IVC، قطع الوريد البابي، قطع أي أربطة إضافية، وإخراج الكبد. وضع الكبد في الجليد الباردة المالحة الطبيعي 0.9% (الشكل 11).
  25. مكان ز 16 الكفة الأوعية الدموية في الوريد البابي (الشكل 12). مكان الكبد على حلبة نضح الكبد نورموثيرميك السابقين فيفو .

4-نضح الكبد نورموثيرميك السابقين فيفو

ملاحظة: أعد البروتوكول خطوة 1.1.1 بيرفوساتي المستخدمة هنا.

  1. وضع قنية الوريد البابي في الوريد البابي مقيد (الشكل 13).
  2. أثناء وضع قنية الوريد البابي، الحفاظ على تدفق بيرفوساتي من خلال الدائرة في 2 مل/دقيقة للبدء. مشاهدة الشاشة لأي ارتفاع في ضغط الوريد البابي؛ قد يشير هذا إلى قد أصبحت تغطي السفينة، وهناك حاجة لإعادة وضع القنية.
  3. خياطة في قنية IVC لعودة تدفق بيرفوساتي استخدام خياطة حرير 7-0.
  4. مرة كلا cannulas في المكان، البدء في تحويل التدفق في 1 مل/دقيقة حتى يتم التوصل إلى ضغط فسيولوجية في النطاق من 10 – 16 غروهارلم2س.
  5. تأخذ عينة 1 مل من قبل وبعد الموانئ في 0 و 30، 60، 90، 120، 150، 180، 210 و 240 دقيقة من نضح. تقسيم العينة 1 مل عينتين 0.5 مل.
    ملاحظة: 0.5 مل من هذا ستستخدم في البروتوكول خطوة 4.5.1، و 0.5 مل ستستخدم في البروتوكول خطوة 4.5.2.
    1. انجذاب تجميد 0.5 مل من هذه العينة في أنابيب التبريد بالنتروجين السائل.
    2. قم بتشغيل تحليل غاز دم الشرياني باستخدام مل 0.5 المتبقية من بيرفوساتي.
    3. بعد تشغيل تحليل غاز الدم في كل وقت نقطة (0، 30، 60، 90، 120، 150، 180، 210 و 240 دقيقة) النظر في مستويات الأس الهيدروجيني والمخزن المؤقت في بيرفوساتي حسب الحاجة للعودة إلى درجة الحموضة 7.4.
  6. في ختام ح 4 من نضح، قطع الكبد الدارة التروية. تقسيم الكبد إلى شرائح ز 0.5. الأداة الإضافية تجميد نسيج الكبد في أنابيب التبريد بالنتروجين السائل.

5-تجربة ما بعد التحليل

  1. تحديد ألانين أمينوترانسفيراسي المستوى (ALT) في بيرفوساتي في 0 و 30، 60، 90، 120، 150، 180، 210 و 240 دقيقة باستخدام مجموعة أدوات مقايسة اللونية تجارية.
    1. وباختصار، احتضان بيرفوساتي مع الكواشف ميكس رد فعل على 37 درجة مئوية عن 60 دقيقة قياس قيم الكثافة البصرية في 570 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
  2. مجانسة ز 0.5 من أنسجة الكبد مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل وتحليل الأنسجة الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) والجلوتاثيون (المدفع جريازيف) malondialdehyde (نجمة داود الحمراء).
    1. وباختصار، قياس مستويات ATP لعينات أنسجة الكبد باستخدام مجموعة أدوات تحليل تجاري. خلط العينة برد فعل المخزن المؤقت واحتضان في درجة حرارة الغرفة عن 30 دقيقة قياس الكثافة الضوئية في 570 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية.
    2. قياس مستويات المدفع جريازيف عينات أنسجة الكبد باستخدام مجموعة أدوات تحليل تجاري. مزيج من عينات الأنسجة مع الكوكتيل المقايسة. قياس قيم الكثافة البصرية في 405 – 414 نيوتن متر.
    3. قياس مستويات MDA عينات أنسجة الكبد باستخدام مجموعة أدوات تحليل تجاري. خلط العينات مع القابلات التقليديات والحرارة إلى 95 درجة مئوية عن 60 دقيقة الطرد المركزي مادة التفاعل ونقل المادة طافية على صفيحة 96-جيدا. قياس الكثافة الضوئية في 532 نانومتر.
  3. مجانسة ز 0.5 من أنسجة الكبد مع 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل وتحليل الأنسجة لنشاط caspase-3/7 النسبي باستخدام مجموعة أدوات تحليل تجاري.
    1. مزيج من الأنسجة ليستي مع المخزن المؤقت المقايسة كاشف caspase-3-7 واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    2. قياس مستوى الأسفار في كل استخدام قارئ ميكروسكوبية جيدا.
  4. تحديد مستوى أبوبتوتيك الخلايا في عينات أنسجة الكبد استخدام عدة الكشف عن وفاة تجارية في الموقع .
    1. قبل علاج 0.5 ز الأنسجة الجزأين مع بروتيناز U/mL 10 ك لمدة 10 دقائق وثم احتضان مع خليط رد الفعل عند 37 درجة مئوية للحد الأدنى 60 إجراء التحليل استخدام مجهر فلوري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم استخدام حجم عينة من الفئران الثلاثة كل مجموعة. وتم قياس ALT في 0 و 30، 60، 90، 120، 150، 180، 210 و 240 دقيقة من نضح. كنا الطالب t-الاختبارات لمقارنة النتائج بين قاعدة بيرفوساتي وقاعدة بيرفوساتي، بالإضافة إلى مجموعات القط شماعة عند كل نقطة في الوقت. مقارنة بيرفوساتي قاعدة وقاعدة بيرفوساتي، بالإضافة إلى مجموعات شماعة لاتفاقية مناهضة التعذيب، وهناك أقل بكثير (p < 0.05) ALT في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعة الوتد-القط على 150 و 180، 210 و 240 دقيقة (الرقم 14A).

تم شراء أنسجة الكبد من أجل تحليل تلف الأنسجة من كل قاعدة بيرفوساتي وقاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعات شماعة-القط. كنا الطالب t-الاختبارات لمقارنة النتائج بين قاعدة بيرفوساتي وقاعدة بيرفوساتي، بالإضافة إلى مجموعات شماعة لاتفاقية مناهضة التعذيب. وأبقى على الأنسجة ATP في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعة الوتد-القط بالمقارنة مع مجموعة وحدها بيرفوساتي قاعدة (الرقم 14B، ف < 0.05). إنتاج جمعية نجمة داود الحمراء الأنسجة كان أعلى بكثير في المجموعة بيرفوساتي قاعدة من المجموعة في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى الربط بين القط (الشكل 14، ف < 0.05). مجموع المدفع جريازيف أبقى في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعة الوتد-القط بالمقارنة مع مجموعة وحدها بيرفوساتي قاعدة (الشكل 14، ف < 0.05).

لتحليل المبرمج، تمت مقارنة النشاط caspase 3/7 أنسجة الكبد بين الجماعات. وتم قياس الأسفار في كل بئر. كنا الطالب t-الاختبارات لمقارنة النتائج بين قاعدة بيرفوساتي وقاعدة بيرفوساتي، بالإضافة إلى مجموعات شماعة لاتفاقية مناهضة التعذيب. النشاط Caspase 3/7 قد تناقص بصورة كبيرة في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعة الوتد-القط بالمقارنة مع المجموعة الأساسية بيرفوساتي وحدها (الرقم 15 ألف، ف < 0.05). المحطة الطرفية ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز (TdT) dUTP تلطيخ نك-نهاية الوسم (TUNEL) كان يستخدم لمقارنة المبرمج بين الجماعات. النسبة المئوية للخلايا أبوبتوتيك كان أقل بشكل ملحوظ في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعة الوتد-القط بالمقارنة مع مجموعة وحدة قاعدة بيرفوساتي (الرقم 15 باء، ف < 0.05).

Figure 1
رقم 1: دارة التروية. تتم تسمية مكونات الدائرة. ويبدأ بيرفوساتي في خزان بيرفوساتي (1)، الذي يعتبر بمثابة حاوية تغلف مياه. يتم سحبها من الخزان بمضخة اسطوانة (2) بيرفوساتي ودفعت إلى ويندكيسيل (3)، ومن ثم مكساج (4). يتم تعيين مكساج للغاز كونتيركورينت وتدفق بيرفوساتي لتوفير تبادل الغازات كحد أقصى. ثم تشرع بيرفوساتي لفائف تدفئة (5) داخل قاعة نضح للتأكد من أنها في درجة حرارة الفسيولوجي، وفخ فقاعة (6) لمنع التروية لفقاعات الهواء. هناك جهاز ما قبل (7) وبعد انتهاء الجهاز (8) المنافذ العينة، والتي تسمح بيرفوساتي أخذ عينات. ثم يدخل بيرفوساتي في الكبد عن طريق الوريد البابي القنية. قنية الوريد البابي موصولة إلى جهاز ضغط، الذي ينظم الضغط التعادل (9). وأخيراً، بيرفوساتي انسحب من كتلة الضغط مرة أخرى عن طريق المضخة الدوارة وإفراغ خزان. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: غرفة العمليات وإعداد الأدوات الجراحية. مجهر جراحي (1) ينبغي أن تعدل للطول المناسب والتكبير للمستخدم. يمكن تحميل Isoflurane مسبقاً في جهاز التخدير (2). يتم وضع آنف الحيوان في مخروط الآنف (3). ينبغي وضع الأدوات الجراحية بحيث يمكن الوصول إليها بسهولة (4). وقد اليكتروكوتيري (5) القريبة من المفيد. خياطة الجروح (6) ينبغي قبل قطع وبالقطع يمكن الحصول بسرعة عند الحاجة، وينبغي أن تكون إضافية متوفرة (7). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: إعداد الكفة الوريد البابي 16 ز. تبدأ مع أنجيوكاثيتير ز 16. قص مقطع 7 ملم من الأنابيب. تحديد نقطة الوسط للقسم 7 ملم بقياس 3.5 مم. إينسيسي هنا وإزالة في النصف الأمامي من الأنبوب. استخدام هيموستات لسحق هذا الجزء الآن شقة. استخدم أخف لحرق على الطرف الآخر من أنجيوكاثيتير لإنشاء lip. لا تضع هذه المعلومة مباشرة في اللهب أو أنها سوف تشعل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: شق خط الوسط- جعل خط الوسط شق من الرهابه (1) إلى العانة (2) استخدام حادة مقص وتوسيع نطاق عن طريق الجلد والعضلات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: الحصول على تراجع كافية. التراجع عن عملية الرهابه (1) باستخدام المشبك البعوض منحنى (2) وفي الضلع بوضع الكامشات الضلع (3، 4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: تشريح أدنى الوريد الأجوف (IVC). الوجه الكبد يصل إلى فضح الكلي الحق (1) والوريد البابي (2). تشريح حول IVC (3) ووضع حلقة خياطة 7-0 لاستخدامها في المستقبل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
رقم 7: ربط الوريد حق الغدة الكظرية. التراجع عن الحق الكلي (1) تقديم التعرض في هذا السياق حق الغدة الكظرية. التعادل خارج هذا السياق حق الغدة الكظرية وقطع عبرها. شاش ترطب (2) يمكن استخدامها لحماية الكبد أثناء هذه المناورة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
الشكل 8: تشريح الشريان الكبدي. تشريح حولها ويضع ربطه عنق حول الشريان الكبدي (1) القرب من حيث يمر تحت الوريد البابي (2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 9
الشكل 9: القناة الصفراوية كانوليشن. كانولاتي الصفراوية (1) باستخدام أنجيوكاثيتير ز 27 (2) متصل بالانبوب ز 27 (3). وهذا سيساعد على جمع الصفراء أثناء التروية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 10
رقم 10: الكبد دافق. مسح الكبد (1) مع 60 سم مكعب من البرد 0.9% المحلول الملحي العادي مع 100 يو (1 مل) الهيبارين استخدام أنجيوكاثيتير ز 16 (2). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 11
رقم 11: بعد ظهرت- أداء ظهرت ومكان الكبد في المياه المالحة الباردة. الحرص على عدم إزاحة قنية القناة الصفراوية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 12
الشكل 12: الوريد البابي كوفينج. قم بتحديد موقع الوريد البابي. استخدام المشبك كبير (1) أن تصمد على المنوال ترك عدة ملليمتر-شفة المنوال أعلاه المشبك. استخدام الملقط ميكروسورجيكال (2، 3) لوضع الكفة ز 16 الأوعية الدموية (4) في الوريد البابي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 13
الشكل 13: الكفة الوريد البابي ومتفوقة IVC كانوليشن. كانولاتي الكفة الوريد البابي (1) ومتفوقة IVC (2). ويجب إيلاء عناية كبيرة ليس لإزاحة قنية القناة الصفراوية (3). بالإضافة إلى ذلك، الحرص على عدم تحريف IVC متفوقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 14
الشكل 14: تحليل لتلف الأنسجة في قاعدة بيرفوساتي بيرفوساتي فقط وقاعدة بالإضافة إلى مجموعات شماعة-القط (N = 3/المجموعة). أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. (أ) مستويات ألانين aminotransferase (ALT). مقارنة مستويات البديل بين قاعدة بيرفوساتي وقاعدة بيرفوساتي، بالإضافة إلى مجموعة سي-كاتالاز (شماعة-القط)، هناك أقل بشكل ملحوظ ALT في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعة الوتد-القط على 150 و 180، 210 و 240 دقيقة (ف < 0.05). (ب) مستويات أدينوسين ثلاثي الفوسفات. الأنسجة الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) وأبقى في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعة الوتد-القط بالمقارنة مع مجموعة وحدها بيرفوساتي قاعدة (ف <0.05). (ج) مستويات مالونديالديهيدي. إنتاج malondialdehyde (نجمة داود الحمراء) الأنسجة كان أعلى بكثير في المجموعة بيرفوساتي قاعدة من المجموعة في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى الربط بين القط (ف < 0.05). (د) مستويات الجلوتاثيون. وأبقى على مجموع الجلوتاثيون (المدفع جريازيف) في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعة الوتد-القط بالمقارنة مع المجموعة الأساسية بيرفوساتي وحدها (ف < 0.05). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 15
الشكل 15: تحليل للمبرمج في قاعدة بيرفوساتي بيرفوساتي فقط وقاعدة بالإضافة إلى مجموعات شماعة-القط (N = 3/المجموعة). أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري. (أ) النشاط Activity.Caspase Caspase-3/7 3/7 قد تناقص بصورة كبيرة في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعة الوتد-القط بالمقارنة مع المجموعة الأساسية بيرفوساتي وحدها (ف < 0.05). (ب) محطة ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز (TdT) dUTP نك-نهاية الوسم (TUNEL) تلطيخ. أخذت الصور باستخدام 4 × مجهر فلوري. النسبة المئوية للخلايا أبوبتوتيك كان أقل بشكل ملحوظ في قاعدة بيرفوساتي بالإضافة إلى مجموعة الوتد-القط بالمقارنة مع قاعدة بيرفوساتي (ف < 0.05). الأخضر: أبوبتوتيك الخلايا. الأزرق: النووي. تغيير حجم أشرطة = 1,000 ميكرومتر. TUNEL إيجابية تم قياس كمية الخلايا قبل عد الخلايا من 4 حقول مجهرية عشوائي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هناك نقص كبير في الكبد اللوجرافتس المتاحة للزرع واستجابة معايير المانحين الموسعة1،2،3،،من45. وقد أدخلت نيفلب نتيجة للنقص في الجهات المانحة، كوسيلة لتقييم وتعديل الجهاز وظيفة6،7. لقد قمنا بتصميم نموذج الفئران من نيفلب. وعلاوة على ذلك، وقد استخدمنا هذا النموذج لإثبات واحدة من تطبيقاتها المحتملة الهامة – اختبار المضافات جزيء رواية للكبد بيرفوساتي. هنا، يمكننا إضافة شماعة-القط إلى بيرفوساتي قاعدة وأثبت قدرته على التخفيف من حدة الضرر الحفاظ على الكبد.

خطوات حاسمة

الدائرة نضح الكبد تم شراؤها واستخدامها دون تعديل. يمكن تصور الدائرة في الشكل 1. خزان بيرفوساتي المستخدمة هي حاوية واتيرجاكيتيد التي تستخدم للحفاظ بيرفوساتي في درجة حرارة الفسيولوجية. من الخزان هو سحب بيرفوساتي باسطوانة ضخ ودفعت إلى دائرة ويندكيسيل. ويساعد هذه الدائرة كبح تدفق نابض بيرفوساتي وجعله أكثر الصفحي للدخول إلى الجهاز. وبعد ويندكيسيل الدائرة تدفقات بيرفوساتي إلى مكساج. يتم تعيين مكساج لتدفق الغاز وبيرفوساتي كونتيركورينت توفير تبادل الغازات كحد أقصى بيرفوساتي مع الأكسجين 95%. ثم تشرع بيرفوساتي لفائف تدفئة التأكد من أنها لا تزال في درجة حرارة الفسيولوجية. فخ فقاعة حق قبل الجهاز يمنع التروية فقاعات الهواء. ثم يتم ضخ بيرفوساتي الخروج من فخ فقاعة ومن خلال قنية الوريد البابي في الكبد. وقد قنية الوريد البابي فرع صغير الخروج منه لمراقبة ضغط. ينبغي أن تستعد الأنبوب إلى جهاز استشعار مع سائل الهواء لا حتى لا يكون هناك أي فقدان للضغط من أجل الاستشعار. بعد أوكسيجيناتينج الجهاز، تدفقات بيرفوساتي الخروج من الكبد من خلال قنية الوريد السفلي للتعادل ضغط. كتلة التعادل الضغط يساعد على منع على ذات الدائرة أو الجهاز. وأخيراً، بيرفوساتي انسحب من كتلة الضغط مرة أخرى عن طريق المضخة الدوارة وإفراغ خزان.

قبل بداية كل نضح ينبغي إجراء الفحص البصري للدائرة لتحديد أي ضرر أو تراكم على مكونات الدارة أو الأنابيب. إذا كان هناك تراكم بكتيريا أو مواد أخرى على الحلبة، ينبغي استبدال أجزاء أو تنظيفها، إذا كان ذلك ممكناً. بعد ذلك، يجب أن تشطف الحل المنظفات الحفاظ على المكونات الداخلية. والمكونات هي أن تشطف استشعار الضغط وخط الضغط ينبغي إزالة أي فقاعات الهواء مع المياه. أيضا، ينبغي أن تعدل تدفق على فترات منتظمة للتأكد من ضغط القراءة هو الاستجابة على النحو المناسب للتغييرات. إذا كان جهاز استشعار الضغط لا يستجيب على نحو ملائم، ينبغي التحقق من كافة العناصر الموجودة في السطر إلى أجهزة الاستشعار وتقويم إذا لزم الأمر. في بداية نضح أنها حاسمة للتأكد من أن لا تصبح أوعية الكبد متلوي أو ملتوية عند الاتصال الكبد إلى الدائرة. إذا كان هذا قد حدث هناك ارتفاع ضغط المباشر سيتضح على جهاز العرض في اتجاه لوغاريتمي. الخطأ الأكثر شيوعاً شبك في الوريد البابي مع قنية وضع ضعيف. يمكن حل هذه المشكلة عن طريق تحريك السفينة إلى موقف أكثر طبيعية بسحبه قليلاً خارجاً واستقامة الوريد البابي. مراقب ضغط يشير إلى حل هذه المشكلة مع حدوث انخفاض في الضغط، وتحسين الاتساق. بعد ذلك، عند الاتصال الكفة الوريد البابي بالوريد البابي القنية السفينة يمكن تصبح الملتوية نضح المعوقة للجهاز. تعديل الكفة، وتصحيح هذا الخطأ سيؤدي إلى ارتفاع مفاجئ في ضغط الوريد البابي الذي ينبغي ثم العودة فورا إلى ضغط أقل ومستوى قبالة في تدفق متسقة. يمكن التعرف IVC متلوي أو الملتوية بسرعة بأنه لا يوجد تدفق من القنية وانتفاخ السفينة. كل من هذه الأخطاء في الأجوف فينا أيضا سيؤدي زيادة ضغط، لكن خلافا لمتاعب الوريد البابي هذا الضغط يمارس على الجهاز ويجب أن تحل بسرعة. هذه القضية يجب أن تحل داخل 10 دقيقة أو يجب إلغاء التجربة. إشارة فورية لإلغاء هذه التجربة هو رؤية واضحة وذمة في الجهاز خلال 20 دقيقة الأولى.

إذا كان هناك تسرب من الكبد أو من أحد الاتصالات قنية سيكون من المهم رصد مستوى الخزان بيرفوساتي. ينفد من بيرفوساتي وضخ الهواء يمكن أن تكون كارثية للتجربة. حالما يتم ضخ الهواء في الخطوط أنه لا يمكن وقفه التجربة وإعادة رئيس الوزراء خطوط الأنابيب. تصحيح الوحيد الممكن لفخ فقاعة لالتقاط الهواء المحقون.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

مرة واحدة يتم مسح الدارة يمكن وضعها مكساج في الخط وثم يمكن أن تجهز الدائرة مع بيرفوساتي. صحيح تطهير الجو من مكساج يمكن أن يستغرق بضعة دقائق لكن هو خطوة حاسمة في التأكد من أنه لم يتم إنشاء انسداد جوية في وسط نضح. بعد هو معبي مكساج تماما مع بيرفوساتي فخ فقاعة ينبغي أن تملأ بعد ذلك إلى التقاط أي فقاعات الهواء التي تشكل. عند هذه النقطة يجب تعيين تدفق الدائرة إلى تدفق 1 أو 2 مل/دقيقة للحفاظ على بيرفوساتي تحريك حتى الكبد مستعدة ل cannulation.

بعد كانولاتينج IVC من الكبد والوريد البابي، ينبغي زيادة الضغط والمستوى ثم إيقاف تشغيل. كما يتم زيادة تدفق إلى ضغط فسيولوجية طبيعية ينبغي أن تبدأ الضغوط المسجلة زيادة بطريقة متدرجة مماثلة. بمجرد تحقق تدفق المطلوب (8 – 16 مم زئبق) الضغط ينبغي أن يظل ثابتاً إلى حد ما. نحن نهدف لضغط من 10 مم زئبق، وضبط التدفق تبعاً لذلك. تدفق المطلوبة للوصول إلى ضغط من 10 ملم زئبقي قد تختلف حسب الجهاز. قد يكون هناك تسرب طفيف بيرفوساتي من الجهاز ولكن يمكن أن تكون هذه بيرفوساتي جمع وعاد إلى الخزان.

يجب تنظيف الحلبة بعد كل نضح الإبقاء على الدائرة والخزان والحفاظ على المتاح من الأنابيب ومنافذ. يجب إزالة جميع بيرفوساتي من الدائرة. يجب مسح الدارة فورا مع الحد أدنى من 300 مل مياه. بينما المياه الإحمرار أنابيب دارة يجب تنظيف الأجزاء الخارجية على نحو ملائم. يجب أن تشطف قبالة المكونات الخارجية أو مسحت بلطف إلى أسفل ويسمح للهواء الجاف. مكونات الدائرة هشة ويمكن أن تتلف بسهولة. ولذلك من الأهمية القصوى لتنظيفه بلطف. ينبغي الحفاظ على الدائرة الداخلية في حل 5% من المنظفات القلوية في المياه عندما لا تكون قيد الاستعمال. المنظفات في الحلبة يساعد على إطالة عمر الأنابيب ومنع تراكم على مكونات أخرى، مثل فخ فقاعة والضغط على التعادل.

يمكن منع معظم الصعوبات مع الدائرة بالتنظيف والصيانة للدائرة شامل بعد كل استعمال. وهذا يساعد على ضمان وجود لا تراكم بيرفوساتي المتبقية يمكن أن يؤدي إلى انسداد الأنابيب أو cannulas. ينبغي تفتيشها بانتظام واستبدال حسب الحاجة قبل كل استخدام للتأكد من أن ليس هناك أي تلوث أو تقييد تدفق مكونات الدائرة والأنابيب.

القيود

حد من هذا الطراز نيفلب الحيوانات الصغيرة أنها لا تشمل حاليا نضح ما بعد زرع الأعضاء. ولذلك من المستحيل تقييم وظيفة الكبد الاختلاس بعد زرع الأعضاء. وهذا مجال هام للبحوث في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك، تستخدم الدائرة الحيوانية الصغيرة يتطلب المعرفة والمهارة.

أهمية فيما يتعلق بالنماذج الموجودة

الخنزير ومورين (فأر) نماذج من نضح باردا، وسوبنورموثيرميك، ونورموثيرميك السابقين فيفو الكبد وقد وصفت في الكتابات. على الرغم من أن الخلاف ما زال قائما فيما يتعلق بدرجة الحرارة التروية قد تبين أن نضح هذا الجهاز يمكن تحسين وظيفة الكبد الطعوم بغض النظر عن درجة الحرارة9. نموذج نيفلب المقدمة هنا بسيطة وقابلة للتكرار بسهولة وتكلفة منخفضة، ولديها مجموعة واسعة من التطبيقات. لا يتضمن هذا النموذج الغسيل الكلوي أو تدفق نابض للشريان الكبدي، التي ترد في بعض النماذج الأخرى، كما أنها أظهرت أن لا لزوم لها9،13. وعلاوة على ذلك، أظهرت نتائج التجارب البشرية الأولى التي تستخدم نيفلب هذا ليكون وسيلة فعالة للحفاظ على الكبد، ولذلك، هذا النموذج المثالي لاختبار التطبيقات المستقبلية السابقين فيفو نضح الكبد10.

التطبيقات المستقبلية

وقد اقترحت مجموعة متنوعة من التطبيقات المستقبلية نيفلب في الأدب. كل من هذه سوف تحتاج إلى اختبار منهجي في نماذج حيوانية قبل الاختبار في الأعضاء البشرية المهملة، ومن ثم في كبد الإنسان. النموذج المعروض هنا مثالي لاختبار هذه التطبيقات المستقبلية الرواية كما قابلة للتكرار بسهولة، ويلغي الخطوات دخيلة، ومنخفضة التكلفة. أحد أهم التطبيقات المحتملة لهذا النموذج هو الذي أثبت هنا-اختبار المضافات بيرفوساتي دوائية جديدة. وتشمل التطبيقات الأخرى المقترحة إصلاح الأجهزة التالفة، ديفاتينج من كبد للسماح بزرع الأعضاء ستيتوتيك، ومقدمة لمقاومة التهاب الكبد الوبائي الفيروسي والعلاج بالخلايا الجذعية الوسيطة والتعديل الجيني والتروية مع المناعة وكلاء11،31،32،33،34،35،36،،من3738.

الاستنتاجات

وفي الختام، لقد أظهرنا طراز نيفلب غير مكلفة، ويمكن تكرارها بسهولة باستخدام الفئران. استخدام هذا النموذج يتطلب التحضير الدقيق، والممارسة، والمعرفة، ولكن يمكن تنفيذها بتكاليف منخفضة. تطبيقات لهذا النموذج يمكن أن يشمل اختبار المضافات بيرفوساتي الرواية، كما تجلى في نتائج تمثيلية. وقد تشمل التطبيقات الإضافية من هذا النموذج اختبار البرمجيات المصممة لتقييم الجهاز و perfusates المختلفة، وناقلات الأكسجين الاصطناعي أو المستندة إلى الهيموغلوبين ووكلاء تهدف إلى إصلاح الأجهزة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تقرير جميع المؤلفين أن عليهم لا الكشف عن البيانات ذات الصلة.

Acknowledgments

هذا العمل أيده 106704-01A1 T32AI المعاهد الوطنية للصحة والصندوق زادت "ت." لزرع الأعضاء ونضح والهندسة والتجديد في "جامعة ولاية أوهايو".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusate
8% Albumin CLS Behring, King of Prussia, PA 0053-7680-32
Williams Media Sigma Aldrich, St. Louis, MO W1878
Penicillin/Streptomycin Sigma Aldrich, St. Louis, MO P4333
Insulin Eli Lilly, Indianapolis, IL 0002-8215-91
Heparin Fresnius Lab, Lake Zurich, IL C504701
L-glutamine Sigma Aldrich, St. Louis, MO G3126
Hydrocortisone Sigma Aldrich, St. Louis, MO H0888
THAM Hospira, Inc, 0409-1593-04
Polyethylene Glycol - Catalase Sigma Aldrich S9549 SIGMA
Personal Protective Equipment
Surgical Mask Generic N/A
Protective Gown Generic N/A
Surgical Gloves Generic N/A
Liver Procurement
Sprague-Dawley Rat Harlan Sprague Dawley Inc. 250 -350 grams
Surgical Microscope Leica M500-N w/ OHS
Charcoal Canisters Kent Scientific SOMNO-2001-8
Isoflurane Piramal Healthcare N/A
Pressure-Lok Precision Analytical Syringe  Valco Instruments Co, Inc. SOMNO-10ML
Electrosurgical Unit Macan MV-7A
Warming Pad Braintree Scientific HHP2
SomnoSuite Small Animal Anesthesia System Kent Scientific SS-MVG-Module
PhysioSuite Kent Scientific PS-MSTAT-RT
Isoflurane chamber Kent Scientific SOMNO-0530LG
SurgiVet Isotec CDS 9000 Tabletop
Oxygen Praxair 98015
Rib retractors Kent Scientific INS600240
GenieTouch Kent Scientific GenieTouch
Normal Saline Baxter NDC 0338-0048-04
4x4 Non-Woven Sponges Criterion 104-2411
Sterile Q-Tips Henry Schein Animal Health 1009175
U-100 27 Gauge Insulin Syringe Terumo 22-272328
5mL Syringe BD REF 309603
4-0 Braided Silk Suture Deknatel, Inc. 198737LP
7-0 Braided Silk Suture Teleflex Medical REF 103-S
16 gauge Catheters BBraun Introcan Safety 4252586-02
14 gauge Catheters BBraun Introcan Safety 4251717-02
Bile Duct Cannular Tubing Altec 01-96-1727       
Liver Perfusion Circuit Components
Water Bath Warmer Lauda Ecoline Staredition E103
Data Collection Software ADInstruments  Labchart 7
Liver Perfusion Circuit Harvard Apparatus 73-2901
Membrane Oxygenator Mediac SPA M03069
Roller Pump Ismatec ISM827B
Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) Praxair 98015
Organ Chamber Harvard Apparatus ILP-2
1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube USA Scientific 1418-7410
Mucasol Sigma-Aldrich Z637181
Microsurgical Instruments
Small Scissors Roboz RS-5610
Large Scissors S&T SAA-15
Forceps - Large Angled S&T JFCL-7
Forceps - Small Angled S&T FRAS-15 RM-8
Clip Applier ROBOZ RS-5440
Scissors - non micro FST 14958-11 14958-11
Forceps - Straight Tip S&T FRS-15 RM8TC
Large Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-01
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-02
Small Microsurgical Clip Fine Scientific Tools 18055-03
Small Mosquito Clamps Generic N/A
Post-Experiment Analysis
Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit BioVision K752
Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit BioVision K354
Glutathione Assay Kit Cayman Chemical 703002
Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit Abcam ab118970
Caspase-Glo 3/7 Assay Systems Promega G8090
POLARstar OMEGA Microplate Reader BMG LABTECH N/A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Network, O. P. aT. National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
  2. OPTN, O. P. aT. N. National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 - December 31, 2016, For Organ = Liver. , Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/# (2017).
  3. Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
  4. Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
  5. Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
  6. Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
  7. Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
  8. Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
  9. Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
  10. Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
  11. Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
  12. Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
  13. Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
  14. Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
  15. Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
  16. Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
  17. Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
  18. Held, P. An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , BioTek Instruments, Inc. Vinooski, Vermont. 1-14 (2012).
  19. Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
  20. Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
  21. He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
  22. Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
  23. Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
  24. Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
  25. Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
  26. Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
  27. Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
  28. Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
  29. Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
  30. Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
  31. Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
  32. Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
  33. Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
  34. Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells? Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
  35. Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
  36. Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
  37. Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
  38. Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).

Tags

أجهزة الطب، العدد 136، نورموثيرميك السابقين فيفو الكبد التروية، نيفلب، هامشية، مددت معايير المانحين، نموذج الحيوانات الصغيرة، القوارض، الفئران
نموذج حيوانات صغيرة من نضح الكبد نورموثيرميك<em> السابقين فيفو </em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J. L., … More

Beal, E. W., Dumond, C., Kim, J. L., Akateh, C., Eren, E., Maynard, K., Sen, C. K., Zweier, J. L., Washburn, K., Whitson, B. A., Black, S. M. A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion. J. Vis. Exp. (136), e57541, doi:10.3791/57541 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter